光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯制備技術(shù)研究進展

侯　靜，孫　婧，何軍邀，黃　金，王　普*（.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江　杭州 3004；.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江　寧波　3500）

光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯制備技術(shù)研究進展

侯靜1，孫婧1，何軍邀2，黃金1，王普1*
（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310014；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100）

光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯（EHB）是具有廣泛應(yīng)用價值的手性中間體，目前有多種制備方法。主要綜述了手性3-羥基丁酸乙酯的合成和拆分制備研究進展，概述相關(guān)的手性拆分，不對稱合成制備方法，重點介紹了生物不對稱合成法制備技術(shù)的研究現(xiàn)狀。

光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯；手性中間體；拆分；不對稱合成

0　引言

3-羥基丁酸乙酯 （ethyl-3-hydroxybutyrate，EHB），分子式C6H12O3，相對分子質(zhì)量 132.16；沸點170℃，閃點77℃；易溶于水，是一種無色粘稠液體，呈果香、葡萄香和類似白酒的香氣；天然品存在于白酒、朗姆酒、雞蛋果等。

3-羥基丁酸乙酯分子中含有羥基和酯基兩個功能性官能團，可用來制備許多天然產(chǎn)品和藥物制劑。3-羥基丁酸乙酯（EHB）本身可經(jīng)過酯交換縮聚用于制備熱塑材料聚3-羥基丁酸乙酯（PHB），以PHB為基體，與PLC、PLA、淀粉或纖維素形成的共混物均是具有良好生物相容性和易于降解的生物材料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和光學(xué)材料的制備［1］；EHB也可被還原成1，3-丁二醇，用作有機合成增塑劑、涂料、染料的中間體［2］。光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯因其具有特定官能團，是合成手性藥物，手性農(nóng)用化學(xué)品及香料等物質(zhì)的重要中間體：（S）-3-羥基丁酸乙酯（（S）-EHB）是合成灰綠霉素、格哈菌素、卡包霉素、核球殼菌素、食菌甲誘醇、香矛醇、熏衣草醇等天然產(chǎn)物的手性源；（R）-3-羥基丁酸乙酯（（R）-EHB）可用于制備β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、昆蟲信息素、噻烯霉素、L-肉堿以及亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、法羅培南、厄他培南、多尼培南、比阿培南等碳青霉烯類抗生素［3-5］。

近年來，關(guān)于光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯的制備研究受到了廣泛的關(guān)注。本文主要綜述了國內(nèi)外有關(guān)光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯的制備方法，包括生物拆分法，色譜拆分法，化學(xué)不對稱還原法，重點介紹2000年之后，生物不對稱還原法制備3-羥基丁酸乙酯的研究進展。

1　生物拆分法

生物拆分法主要是利用酶或微生物對對映異構(gòu)體進行選擇性酶解拆分。生物酶本身就是一個手性催化劑，酶的活性中心是一個不對稱結(jié)構(gòu)，有利于酶對消旋體的特異性識別，可選擇性地作用于外消旋體中的某一對映異構(gòu)體，從而起到拆分作用。

Fishman等［6］通過固定化的南極假絲酵母脂肪酶B（Candida Antarctica lipase B，CALB）兩步酶促拆分（R，S）-EHB得到（S）-EHB和（R）-EHB，且兩種對映異構(gòu)體的化學(xué)純度均達99%，對映體過量值（e.e.值）＞96%，總產(chǎn)率73%（40%（S）-EHB和33%（R）-EHB），其反應(yīng)式如圖1所示。采用分批循環(huán)反應(yīng)體系，循環(huán)運轉(zhuǎn)20次，實現(xiàn)千克級規(guī)模產(chǎn)品制備，但固定化Candida Antarctica lipase B的價格昂貴，使用量大，成本高。

圖1　兩步酶法拆分制備（S）-EHB和（R）-EHBFig 1 Synthetic（S）-EHB and（R）-EHB by two-step enzymatic resolution

谷耀華等［7］利用固定化酶PSL/G-NH2-MCF催化 （R，S）-EHB的轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率為15.6%，（S）-3-羥基丁酸乙酯的e.e.值為17.8%，（R）-3-乙酸基丁酸乙酯的e.e.值為96.2%，對映選擇性參數(shù)E為61。宣磊等［8］利用巨大芽孢桿菌WZ009酯酶催化（R，S）-EHB水解拆分獲得光學(xué)純（R）-EHB，如圖2所示，生物催化劑可重復(fù)使用5批次。當?shù)孜餄舛葹?%（w/v），0.25 g菌/10 mL，30℃反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)化率55.5%，e.e.值99%，E值66。微生物酶法拆分條件溫和，工藝簡單，不易造成環(huán)境污染，但成本較高，工業(yè)應(yīng)用上仍受到一定的限制。

圖2　酯酶催化不對稱水解拆分制備（R）-EHBFig 2 Synthetic（R）-EHB by esterase catalytic asymmetric hydrolytic resolution

2　色譜拆分法

色譜拆分法能夠進行簡便快速的定性定量分析，也能進行制備規(guī)模的分離和微量測定。主要包括薄層色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法等。具有快速、回收率高、不需要添加手性試劑或其它催化劑等優(yōu)點，但設(shè)備和手性固定相的投入成本較大，流動相的使用消耗量大，溶劑回收利用困難，因而該法局限于實驗室規(guī)模的制備和對映體純度的分析。施介華等［9］采用三氟乙酸酐柱前衍生化法在色譜柱Cyclodex B上分離3-羥基丁酸乙酯光學(xué)異構(gòu)體，獲得了較好的分離效果，其分離因子（α）和分離度（R）分別為1.02和1.26。向忠權(quán)等［10］采用Chiralcel OD-H手性色譜柱作為分離柱，用高效液相色譜法對3-羥基丁酸乙酯對映體進行拆分，以正己烷-異丙醇為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫25℃時，3-羥基丁酸乙酯對映異構(gòu)體在11 min內(nèi)得到分離，分離度（R）達4.25。

3　化學(xué)不對稱合成法

化學(xué)不對稱合成技術(shù)是有機化學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，該法只需使用少量的催化劑即可將潛手性化合物轉(zhuǎn)化為高立體選擇性的手性化合物?；瘜W(xué)合成法主要包括不對稱氫化反應(yīng)和不對稱氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)，所用的手性催化劑主要是由鈀（Pd）、銠（Rh）、釕（Ru）等重金屬元素和不同配體形成的絡(luò)合物。

胡斌等［11］采用釕催化劑RuCl3·3H2O和雙膦［CH2PPh2］2為配體的催化劑體系，在高壓反應(yīng)釜中催化乙酰乙酸乙酯（EAA）加氫生成3-羥基丁酸乙酯，且當所用手性四面體簇合物為外消旋體時，反應(yīng)產(chǎn)物為消旋體；當選用適當?shù)氖中耘潴w時，也可得到光學(xué)活性的產(chǎn)物。其反應(yīng)式如圖3所示。

圖3　不對稱氫化反應(yīng)制備3-羥基丁酸乙酯Fig 3 Synthetic EHB by asymmetric hydrogenation

劉建華等［2］在以CO2（CO）8為催化劑前體，3-羥基吡啶為配體的催化劑體系中，催化環(huán)氧丙烷與CO和乙醇發(fā)生氫酯化反應(yīng)，生成 （α）-3-羥基丁酸乙酯和（β）-4-羥基-2-甲基丁酸乙酯兩種產(chǎn)物，其反應(yīng)式如圖4所示。

圖4　氫酯化反應(yīng)制備3-羥基丁酸乙酯Fig 4 Synthetic EHB by hydroesterification

Andrew等［12］將100 g的（R）-PHB經(jīng)過解聚，C-3羥基的甲磺?；饔煤椭脫Q作用三步反應(yīng)獲得（S）-EHB，產(chǎn)率為75%，e.e.值為98%。化學(xué)不對稱合成法的優(yōu)點在于反應(yīng)速度快，可獲得較高的產(chǎn)率，產(chǎn)物的手性可通過改變配體的手性來修飾；但主要缺點是反應(yīng)條件比較苛刻，反應(yīng)步驟繁瑣、收率不高、反應(yīng)所使用的有機溶劑大多有毒，易造成環(huán)境污染；而且手性催化劑的制備比較困難，價格昂貴，在產(chǎn)物中容易殘留且不易去除，循環(huán)使用也困難，因此經(jīng)濟成本高，收益低，從而限制了其工業(yè)化的應(yīng)用進程。

4　生物不對稱合成法

生物不對稱合成是指利用酶或微生物細胞催化無手性或潛手性的化合物轉(zhuǎn)化為手性化合物的過程。常用的生物催化劑是微生物全細胞，其本質(zhì)是利用微生物細胞內(nèi)酶的多樣性和立體選擇性催化非天然有機化合物的生物轉(zhuǎn)化，可以合成一些化學(xué)方法難以實現(xiàn)的手性中間體。利用微生物細胞催化不對稱合成具有立體選擇性高、反應(yīng)條件綠色安全、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，生物催化劑通常僅需通過簡單的擴增培養(yǎng)獲得，特別是進行不對稱還原反應(yīng)時，反應(yīng)過程中不需要額外添加昂貴的輔因子即可實現(xiàn)輔酶的原位再生［13］。

利用微生物細胞催化乙酰乙酸乙酯（EAA）不對稱還原可制備得到光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯。目前，可用于不對稱還原EAA的生物催化劑來源廣泛，包括細菌、酵母、霉菌和植物細胞。2000年之前，利用面包酵母催化EAA不對稱還原制備光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯的研究報道較多［3］，隨后，更多具有催化能力的菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，同時，對菌株性能強化和引入介質(zhì)工程的研究也逐漸深入。

于平［14］研究了5種酵母催化EAA生成（S）-EHB的能力，篩選出催化性能較好的釀酒酵母菌株，并以其為出發(fā)菌株進行紫外誘變篩選得到LY7菌株，150g/L的LY7細胞在水相中可催化250 mmol/L的EAA，產(chǎn)率達84%，e.e.值為94%。于明安［15］利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）透性化處理啤酒酵母細胞中高活性的脫氫酶，并借助輔助底物乙醇和葡萄糖，水相反應(yīng)可催化334 mmol/L的EAA不對稱還原為（S）-EHB，產(chǎn)率和e.e.值分別為94%和98%。Wolfson等［16］利用固定化酵母細胞IBY在以甘油為介質(zhì)的反應(yīng)體系中可將1g底物EAA轉(zhuǎn)化為（S）-EHB，轉(zhuǎn)化率達99%，e.e.值99%。Albuquerque等［17］利用Haploid Saccharomyces cerevisiae W303-1A細胞可在以正己烷為溶劑的有機介質(zhì)體系中催化39.2 mmol/L 的EAA為 （S）-EHB，產(chǎn)率50%，e.e.值達99%。Yang［18］等篩選了一株原核藍藻Chlorella vulgaris和一株真核綠藻Paracoccus denitriflcans，可通過光偶聯(lián)生物催化20mmol/L EAA轉(zhuǎn)化為（S）-EHB，產(chǎn)率分別為70%和 25.2%，e.e.值分別為87.6%和90.2%。Lou所在課題組［19-20］利用固定化細胞Acetobacter sp.CCTCCM209061生物不對稱還原EAA為（R）-EHB，在含離子液體體系和含微水有機溶劑體系中反應(yīng)，催化效率明顯提高。

筆者所在實驗室也篩選獲得了可催化EAA不對稱還原為 （R）-EHB的菌株 Pichia membranaefaciens Hansen ZJPH07，并利用紫外誘變和引入含離子液體介質(zhì)的體系提高其催化效率，經(jīng)紫外誘變獲得的Pichia membranaefaciens-218可催化 350 mmol/L的 EAA，產(chǎn)率 70.8%，e.e.值80.5%［21］，反應(yīng)體系中添加離子液體 ［BMIM］［BF4］后，可催化550 mmol/L底物EAA還原，產(chǎn)率73%，e.e.值77.8%，相比水相中反應(yīng)（底物濃度350 mmol/L，產(chǎn)率65.1%，e.e.值68.5%），催化效率和立體選擇性均有所提高［22］。

此外，胡向東等［23］將合成（R）-EHB所需的多種酶基因構(gòu)建于E.coli工程菌中，能將淀粉等可再生碳源轉(zhuǎn)化為（R）-3-羥基丁酸，再與輔助底物乙醇通過酯化反應(yīng)獲得 （R）-EHB，其e.e.值達99.5%。徐忠傳等［24］通過15 min/12 mT磁處理后的胡蘿卜組織為生物催化劑，可將0.1 g EAA還原為（S）-EHB，產(chǎn)率25%，e.e.值79.9%。綜上所述，通過對菌種性能強化和引入介質(zhì)工程的研究，利用生物不對稱還原法制備光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯具有良好的應(yīng)用前景。

5　結(jié)論

光學(xué)純3-羥基丁酸乙酯作為具有廣泛用途的重要手性中間體，其制備工藝一直受到廣泛的關(guān)注。手性拆分法反應(yīng)條件溫和，效率高，但應(yīng)用于工業(yè)化制備時成本較高；化學(xué)不對稱合成法反應(yīng)快速，但手性催化劑制備困難、價格昂貴；生物不對稱還原法具有立體選擇性高，副產(chǎn)物少等優(yōu)點具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。在運用生物不對稱還原法制備手性3-羥基丁酸乙酯的研究中，仍存在生物催化劑催化效率不理想，有機溶劑耐受性差等問題，因此，菌種性能的提高和反應(yīng)體系的優(yōu)化是其主要研究方向。在今后的研究中，可將構(gòu)建重組工程菌技術(shù)引入該反應(yīng)，以實現(xiàn)高底物濃度的催化，并獲得較高產(chǎn)率；另一方面，也可通過引入介質(zhì)工程強化生物催化反應(yīng)過程，如含離子液體介質(zhì)體系是目前的研究熱點，離子液體作為一種綠色溶劑，生物相容性好，細胞毒性小，有望在生物催化反應(yīng)中發(fā)揮優(yōu)勢作用，成為綠色制藥工藝的發(fā)展方向。

［1］Yu H Y，Qin Z Q，Wang L F，et al.Crystallization behavior and hydrophobic properties of biodegradable ethyl cellulose-g-poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate）：The influence of the side-chain length and grafting density biotransformation in organic chemistry［J］.Carbohydrate Polymers，2012，87（4）：2447-2454.

［2］劉建華，陳靜.“一鍋法”合成3-羥基丁酸乙酯的研究［J］.石油化工，2004，33：413-415.

［3］周鶯，何軍邀，王普，等.微生物細胞生物催化3-羰基丁酸乙酯制備光學(xué)活性3-羥基丁酸乙酯的研究進展［J］.科技通報，2008，24（1）：56-61.

［4］Wang X T，Chen X H，Xu Y，et al.Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp.CCTCC M209061 ［J］.Journal of Biotechnology，2013，163：292-300. 0s yeast-mediated asymmetric reduction of ethyl 3-oxobutanoate in deep eutectic solvents［J］.Process Biochemistry，2015，50：1788-1792.

［6］Fishman A，Eroshov M，Sheffer S，et al.A Two-step enzymatic resolution process for large-scale production of （S）-and（R）-ethyl-3-hydroxybutyrate［J］.Biotechnology and Bioengineering，2001，74（3）：256-263.

［7］谷耀華，薛屏，李鵬，等.固定化假單胞菌脂肪酶催化（R，S）-3-羥基丁酸乙酯轉(zhuǎn)酯化拆分［J］.應(yīng)用化工，2015，44（9）：1621-1626.

［8］宣磊，鄭建永，何耀瑩，等.微生物酯酶催化合成 （S）-3-羥基丁酸乙酯［J］.發(fā)酵科技通訊，2013，42（2）：13-17.

［9］ Shi J H，Hu Y，Ding Z J.Theoretical study on chiral recognition mechanism of ethyl-3-hydroxybutyrate with permethylated β-cyclodextrin［J］.Computational and Theoretical Chemistry，2011，973：62-68.

［10］向忠權(quán)，韋志明，陳小鵬，等.高效液相色譜法手性色譜柱分離3-羥基丁酸乙酯對映體 ［J］.理化檢驗-化學(xué)分冊，2014，15（2）：214-216.

［11］胡斌，張玉華，張偉強，等.釕催化劑催化C=O加氫反應(yīng)的研究［J］.分子催化，2001，15（6）：404-406.

［12］Andrew J C，Robert H，Derek B，et al.Efficient large scale stereoinversion of（R）-ethyl 3-hydroxybutyrate［J］. Tetrahedron：Asymmetry，2004，15：821-825.

［13］金保軍，孫婧，何軍邀，等.新型降血脂藥物依替米貝制備技術(shù)研究進展［J］.浙江化工，2015，46（11）：15-21.

［14］于平.酵母還原乙酰乙酸乙酯制備（S）-3-羥基丁酸乙酯的研究［J］.菌物系統(tǒng)，2003，22（3）：430-435.

［15］于明安，朱曉冰，祁巍，等.CTAB透性化酵母細胞生物催化合成 （S）-（+）-3-羥基丁酸乙酯 ［J］.催化學(xué)報，2005，26（7）：609-613.

［16］Wolfson A，Dlugy C.Baker’s yeast catalyzed asymmetric reduction in glycerol［J］.Tetrahedron Asymmetry，2007，38 （3）：2043-2045.

［17］Albuquerque P M，Witt M A.Influence of sugars on enantioselective reduction using Saccharomyces cerevisiae in organic solvent［J］.Process Biochemistry，2007，42（2）：141-147.

［18］Yang Z H，Luo L，Chang X，et al.Production of chiral al-cohols from prochiral ketones by microalgal photo-biocatalytic asymmetric reduction reaction［J］.Journal of Industry Microbiology and Biotechnology，2012，39：835-841.

［19］徐玉，王曉婷，婁文勇，等.含水有機溶劑體系中固定化Acetobacter sp.CCTCCM 209061細胞催化乙酰乙酸乙酯不對稱還原反應(yīng)［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30（7）：31-37.

［20］Wei P，Xu P，Wang X T，et al.Asymmetric reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by immobilized Acetobacter sp.CCTCCM209061 cells in hydrophilic ionic liquid hybrid system［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2015，20：324-332.

［21］祖蕾，何軍邀，王普，等.不對稱還原制備 （R）-3-羥基丁酸乙酯酵母菌株的選育［J］.藥物生物技術(shù)，2009，1：55-59.

［22］He J Y，Zhou L M，Wang P，et al.Microbial reduction of ethyl acetoacetate to ethyl（R）-3-hydroxybutyrate in an ionic liquid containing system［J］.Process Biochemistry，2009，44：316-321.

［23］胡向東，冼坤華.一種手性醫(yī)藥中間體（R）-3-羥基丁酸乙酯微生物發(fā)酵制備方法：CN，101864457A［P］. 2010-10-20.

［24］徐忠傳，柴文，王曉丹.磁處理對胡蘿卜生物轉(zhuǎn)化率的生物學(xué)效應(yīng)研究［J］.常熟理工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)），2010，24（10）：14-22.

Research Progress in Preparation Technique of Enantiomeric Pure Ethyl-3-hydroxybutyrate

HOU Jing1，SUN Jing1，HE Jun-yao2，HUANG Jin1，WANG Pu1*
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China；2.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo，Zhejiang 315100，China）

Enantiomeric pure ethyl-3-hydroxybutyrate is a versatile and valuable chiral intermediate in pharmaceutical industry.Several preparation methods have been reported so far.In this paper，research process on the production of enantiomeric pure ethyl-3-hydroxybutyrate was summarized，including chiral resolution and asymmetric synthesis，especially the asymmetrically biocatalytic synthesis of optically active ethyl-3-hydroxybutyrate.

enantiomeric pure ethyl-3-hydroxybutyrate；chiral intermediate；resolution；asymmetric synthesis

1006-4184（2016）8-0025-05

2016-02-26

浙江省新苗計劃項目（2015R403073），浙江省公益性項目（No.2015C33137），浙江省自然科學(xué)基金（LY16B060010）。

侯靜（1991-），女，碩士研究生，研究方向：生物制藥。E-mail：houjing224@163.com。

王普，女，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：wangpu@zjut.edu.cn。