斑馬魚(yú)血栓模型的建立與冠心寧片的干預(yù)作用

王木蘭，潘永明，金敏，徐孝平，王德軍，馬全鑫，陳民利*

(1.正大青春寶藥業(yè)有限公司，杭州 310023；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州310053)

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斑馬魚(yú)血栓模型的建立與冠心寧片的干預(yù)作用

王木蘭1，潘永明2，金敏1，徐孝平2，王德軍2，馬全鑫2，陳民利2*

(1.正大青春寶藥業(yè)有限公司，杭州 310023；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州310053)

目的采用3種誘導(dǎo)劑分別建立斑馬魚(yú)血栓模型，觀察冠心寧片的抗血栓作用。方法分別采用1.5μmol/L苯肼、80μmol/L花生四烯酸和5mg/L普納替尼建立活體斑馬魚(yú)血栓模型，并用冠心寧片、氯吡格雷或阿司匹林等藥物干預(yù)，觀察尾靜脈血栓形成情況，并用鄰聯(lián)茴香胺染色法對(duì)心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，計(jì)算預(yù)防血栓藥效。結(jié)果苯肼、花生四烯酸和普納替尼誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)尾靜脈血栓明顯增加和心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度顯著降低(P<0.001)，同時(shí)冠心寧片均能顯著對(duì)抗這三種模型的血栓形成，其心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度和預(yù)防血栓藥效均明顯增加(P<0.001)，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，IC50分別為44.32、138.5和459.5mg/L。結(jié)論苯肼、花生四烯酸和普納替尼均能建立不同形成機(jī)理的斑馬魚(yú)血栓模型，而冠心寧片具有明顯的抗血栓作用，且其抗血栓機(jī)制存在多靶點(diǎn)效應(yīng)。

冠心寧片；血栓模型；斑馬魚(yú)；抗栓作用

急性血栓栓塞性疾病仍然是引起死亡或致殘的主要原因。動(dòng)物模型常被用來(lái)了解病理過(guò)程包括血栓的形成機(jī)制以及抗血栓藥物的有效性和安全性評(píng)價(jià)。斑馬魚(yú)作為一種研究人類(lèi)疾病理想的新型模式動(dòng)物，具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1]，如斑馬魚(yú)與人類(lèi)一樣具有遺傳保守性，存在70%的人類(lèi)同源基因[2]，以及擁有凝血因子、血小板受體，并對(duì)臨床應(yīng)用的抗凝血和抗血栓藥物具有很好的反應(yīng)[3-4]，適合于血栓形成機(jī)制和治療藥物的評(píng)價(jià)。故斑馬魚(yú)作為新型模式動(dòng)物逐漸受到國(guó)內(nèi)研究者的青睞，被廣泛用于生理毒理、藥理和腫瘤等研究中。近來(lái)有學(xué)者用苯肼誘導(dǎo)建立斑馬魚(yú)血栓模型[5]，但血栓形成機(jī)制十分復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、花生四烯酸代謝途徑、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體調(diào)控等，且其發(fā)生發(fā)展受凝血、纖溶系統(tǒng)、前列腺素、血小板等方面的影響，因此，從不同層次、環(huán)節(jié)和研究手段來(lái)闡明血栓形成的發(fā)展機(jī)理并尋找有效治療藥物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近來(lái)認(rèn)為，活血化瘀是中醫(yī)抗血栓的治則。冠心寧片(GXN)是由活血化瘀中藥川芎和丹參經(jīng)改進(jìn)提取工藝而制成的一個(gè)新制劑，用于治療冠心病、心絞痛(胸痹心痛)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)冠心寧片能明顯升高急性心肌缺血犬血清一氧化氮(NO)水平，增加冠脈流量；并能降低氣滯血瘀大鼠血小板聚集和改善血液粘聚性，通過(guò)改變血小板花生四烯酸代謝途徑，改善血栓素B2(TXB2)/6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的平衡，保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[6-7]，提示冠心寧片可能有抗血栓形成的作用。為此，本文利用不同誘導(dǎo)劑苯肼(phenylhydrazine,PH)、花生四烯酸(arachidonicacid,AA)、普納替尼(ponatinib)建立活體斑馬魚(yú)血栓模型并初步探討其可能的形成機(jī)制，同時(shí)觀察冠心寧片抗血栓的作用，為冠心寧片用于臨床的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚(yú)為健康A(chǔ)B系和Albino系野生型斑馬魚(yú)，參照Westerfield[8]的養(yǎng)殖方法，飼養(yǎng)于杭州環(huán)特生物科技有限公司斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(浙)2012-0171]。在28℃條件下用養(yǎng)魚(yú)用水孵育胚胎，胚胎可以從自身的卵黃囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故在受精后9d內(nèi)(9dayspostfertilization,dpf)無(wú)需喂食。實(shí)驗(yàn)完成后用三卡因甲磺酸對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚(yú)進(jìn)行過(guò)度暴露處理，從而將斑馬魚(yú)麻醉處死。麻醉處死的操作步驟符合美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(AVMA)對(duì)動(dòng)物麻醉處死的規(guī)范要求。

1.2試驗(yàn)藥物與儀器試劑

冠心寧片(冠心寧浸膏，GXN)，正大青春寶藥業(yè)有限公司；氯吡格雷(clopidogrel)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；阿司匹林(aspirin)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；苯肼，阿拉??；花生四烯酸，上海船夫生物科技有限公司；普納替尼(ponatinib)，MedChemExpress公司。臨用前冠心寧浸膏粉用0.9 %生理鹽水配成20g/L的母液，苯肼用100%乙醇配成1.5mmol/L母液；花生四烯酸、阿司匹林、氯吡格雷和普納替尼用100% 二甲基亞砜(DMSO)助溶分別配成8mmol/L、45g/L、7.5g/L和5g/L母液，備用。SZX7型解剖顯微鏡，日本Olympus公司；TK-C1481EC高清攝像機(jī)，日本凱勒電子公司；6孔板，上海NestBiotech公司。

1.3方法

1.3.1苯肼誘發(fā)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù)

AB系斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至2d時(shí)，在解剖顯微鏡挑選發(fā)育正常的胚胎，將其分到微孔板中，設(shè)置8個(gè)實(shí)驗(yàn)組：即正常對(duì)照組(NC)、模型組(用1.5μmol/L苯肼處理，PHmodel)、冠心寧片干預(yù)組：分別將終濃度為12.5、25、50、100和200mg/L的冠心寧片預(yù)處理6h后加入誘導(dǎo)劑1.5μmol/L苯肼；氯吡格雷組：終濃度7.5mg/L氯吡格雷預(yù)處理6h后加入誘導(dǎo)劑1.5μmol/L苯肼。每組30尾，之后28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

1.3.2花生四烯酸誘發(fā)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù)

Albino系斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至3d時(shí)，在解剖顯微鏡挑選發(fā)育正常的胚胎，將其分到微孔板中，設(shè)置8個(gè)實(shí)驗(yàn)組：即正常對(duì)照組(NC)、模型組(用80μmol/L花生四烯酸處理，AAmodel)、冠心寧片干預(yù)組：分別將終濃度為75、150、300、600和1200mg/L的冠心寧片預(yù)處理6h后加入誘導(dǎo)劑80μmol/L花生四烯酸；阿司匹林組：終濃度22.5mg/L阿司匹林預(yù)處理6h后加入誘導(dǎo)劑80μmol/L花生四烯酸。每組30尾，之后28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5h。

1.3.3普納替尼誘發(fā)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù)

Albino系斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至5d時(shí)，在解剖顯微鏡挑選發(fā)育正常的胚胎，將其分到微孔板中，設(shè)置8個(gè)實(shí)驗(yàn)組：即正常對(duì)照組(NC)、模型組(用5mg/L普納替尼處理，ponatinibmodelgroup)、冠心寧片干預(yù)組：分別將終濃度為150、300、600、1200和1500mg/L的冠心寧片與誘導(dǎo)劑5mg/L普納替尼共處理18h；阿司匹林組：終濃度45mg/L阿司匹林與誘導(dǎo)劑5mg/L普納替尼共處理18h。每組30尾，之后28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h。

1.4觀察指標(biāo)

分別經(jīng)苯肼處理24h、花生四烯酸處理1.5h、普納替尼處理18h后，用1g/L鄰聯(lián)茴香胺染液對(duì)斑馬魚(yú)染色30min；然后，每組隨機(jī)挑選20尾斑馬魚(yú)在顯微鏡下觀察尾靜脈血栓情況并拍照，照片拍攝放大倍數(shù)為56倍；用NIS-ElementsDTM圖像處理軟件進(jìn)行定量分析心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(SI)，并計(jì)算預(yù)防血栓藥效 (%)=[SI(藥物干預(yù)組)-SI(模型組)]/SI(正常對(duì)照組)-SI(模型組) × 100%和半數(shù)抑制濃度IC50。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1苯肼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù)

與正常對(duì)照組比，PH模型組尾靜脈血栓明顯增加而心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(SI)明顯減少(P<0.001)，提示建模成功；與PH模型組比，7.5mg/L氯吡格雷干預(yù)后尾靜脈血栓減少明顯，并能顯著增加SI(P<0.001)，預(yù)防血栓效率達(dá)43.79%；同時(shí)，12.5、25、50、100和200mg/L的冠心寧片干預(yù)后SI亦有不同程度的增加，其中25～200mg/L劑量組的作用顯著(P<0.01, P<0.001)，各劑量組預(yù)防血栓效率分別為24.32%、37.63%、65.02%、93.90%和95.16%，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，IC50為44.32mg/L，同時(shí)200mg/L冠心寧片也能顯著減少尾靜脈血栓。見(jiàn)圖1、2。

注：與正常對(duì)照組比，ΔΔΔP<0.001; 與PH模型組比, **P< 0.01, ***P< 0.001. 正常對(duì)照組，苯肼模型組，7.5 mg/L氯匹格雷組， 12.5 mg/L、 25 mg/L、 50 mg/L、 100 mg/L和 200 mg/L冠心寧片組。圖1　苯肼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù) (n =20)Note. Compared with the NC group,ΔΔΔP<0.01; Compared with the PH model group, **P< 0.01, ***P< 0.001.NC group, PH model group, 7.5 mg/L Clopidogrel group,12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L and200 mg/L GXN group.Fig.1　Establishment of thrombosis model induced by phenyl hydrazine in the zebrafish and drug intervention of the models

注：圖A1-A8分別為正常對(duì)照組，苯肼模型組，7.5 mg/L氯吡格雷組，12.5、25、50、100和200 mg/L冠心寧片組；圖B1-B4分別為正常對(duì)照組，苯肼模型組，7.5 mg/L氯吡格雷組和200 mg/L冠心寧片組。圖2　各組心臟紅細(xì)胞染色(A)和尾靜脈血栓(B)的變化Note. Figure A1-A8: NC group, phenyl hydrazine model group, 7.5 mg/L Clopidogrel group, GXN groups in a dose of 12.5, 25, 50, 100 mg/L, and 200 mg/L, respectively. Figure B1-B4: NC group, phenyl hydrazine model group, 7.5 mg/L Clopidogrel group and 200 mg/L GXN group, respectively.Fig.2　Changes of cardiac red blood cells stained with O-dianisidine and venous thrombus in the zebrafish

2.2花生四烯酸誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù)

與正常對(duì)照組比，AA模型組尾靜脈血栓生成明顯增加，同時(shí)心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(SI)明顯減少(P<0.001)，提示建模成功；與模型組比，22.5mg/L阿司匹林干預(yù)后能明顯減少尾靜脈血栓和顯著增加SI(P<0.001)，預(yù)防血栓效率達(dá)69.17 %；且75、150、300、600和1200mg/L的冠心寧片干預(yù)后SI亦有不同程度增加，其中150～1200mg/L劑量組的作用顯著(P<0.01, P<0.001)，各劑量組的預(yù)防血栓效率分別為9.83 %、29.83 %、53.01 %、61.63 %和71.40 %，有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，IC50為138.5mg/L，同時(shí)1200mg/L冠心寧片也能顯著減少尾靜脈血栓，見(jiàn)圖3、4。

注：圖A1-A8分別為正常對(duì)照組，花生四烯酸模型組，22.5 mg/L阿司匹林組，75、150、300、600和1200 mg/L冠心寧片組；圖B1-B4分別為正常對(duì)照組，花生四烯酸模型組，22.5 mg/L阿司匹林組和1200mg/L冠心寧片組。圖4　各組心臟紅細(xì)胞染色(A)和尾靜脈血栓(B)的變化Note. Figure A1-A8: NC group, Arachidonic acid model group, 22.5 mg/L Aspirin group, GXN groups in a dose of 75,150, 300,600 mg/L, and 1200 mg/L, respectively. Figure B1-B4: NC group, Arachidonic acid model group, 22.5 mg/L Aspirin group and 1200 mg/L GXN group, respectively.Fig.4　Changes of the O-dianisidine staining intensity of erythrocytes in the heart and venous thrombus in the zebrafish

2.3普納替尼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù)

注：與正常對(duì)照組比，ΔΔΔP<0.001; 與ponatinib模型組比, **P< 0.01, ***P< 0.001. 正常對(duì)照組，普納替尼模型組，45 mg/mL阿司匹林組，150 mg/L、300 mg/L、600 mg/L、1200 mg/L和1500 mg/L冠心寧片組。圖5　普納替尼誘發(fā)活體斑馬魚(yú)血栓模型的建立及藥物干預(yù) (n =20)Note. Compared with the NC group,ΔΔΔP<0.01; Compared with the ponatinib model group, **P< 0.01, ***P< 0.001. NC group, Ponatinib model group, 45 mg/mL Aspirin group, 150 mg/L, 300 mg/L, 600 mg/L, 1200 mg/L and1500 mg/L GXN group.Fig.5　Establishment of the thrombosis model induced by ponatinib in the zebrafish and drug intervention

與正常對(duì)照組比，Ponatinib模型組尾靜脈血栓生成明顯增加而心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(SI)明顯減少(P<0.001)，提示建模成功；與模型組比，45mg/L阿司匹林干預(yù)后能減少尾靜脈血栓并能顯著增加SI(P<0.001)，預(yù)防血栓效率達(dá)66.36%；同時(shí)，劑量為150、300、600、1200和1500mg/L的冠心寧片干預(yù)后SI也有不同程度的增加，其中600～1500mg/L劑量組的作用顯著(P<0.001)，各劑量組的預(yù)防血栓效率分別為5.33 %、9.91 %、85.84 %、89.93 %和107.73%；IC50為459.5mg/L，同時(shí)1500mg/L冠心寧片也能顯著減少尾靜脈血栓，見(jiàn)圖5，6。

注：圖A1-A8分別為正常對(duì)照組，普納替尼模型組，45 mg/mL阿司匹林組，150、300、600、1200和1500 mg/L冠心寧片組；圖B1-B4分別為正常對(duì)照組，普納替尼模型組，45 mg/mL阿司匹林組和1500mg/L冠心寧片組。圖6　各組心臟紅細(xì)胞染色(A)和尾靜脈血栓(B)的變化Note. Figure A1-A8: NC group, Ponatinib model group, 45 mg/L Aspirin group, GXN groups with 150, 300,600,1200 mg/L, and 1500 mg/L, respectively. Figure B1-B4: NC group, Ponatinib model group, 45 mg/L aspirin group and 1500 mg/L GXN group, respectively.Fig.6　Changes of the O-dianisidine staining intensity of erythrocytes in the heart and venous thrombus in the zebrafish

3　討論

血栓形成是多因素參與、漸進(jìn)發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程，血液在流動(dòng)狀態(tài)下因血小板的活化和凝血因子被激活而發(fā)生的異常凝固[9]。血栓形成在心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展中起促進(jìn)作用，也是引起死亡和致殘的主要原因之一。血栓形成的條件包括血管內(nèi)膜損傷、血流狀態(tài)的改變和血液凝固性增加。因此，抑制血小板功能和防止血液凝固可預(yù)防血栓形成。臨床上應(yīng)用的抗血小板和抗凝血酶藥物較多，如血小板環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林、血小板內(nèi)環(huán)核苷酸抑制劑雙嘧達(dá)莫、二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑氯匹格雷、抗凝血酶Ш(ATШ)的肝素、維生素K拮抗劑華法林等，這些藥物共同的特點(diǎn)是單藥、單靶點(diǎn)、且不可逆的抑制，導(dǎo)致不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生，如阿司匹林能引起患者過(guò)敏、胃腸道反應(yīng)、瑞氏綜合征、肝損害、凝血障礙等[10]；也有發(fā)現(xiàn)部分患者存在阿司匹林和氯吡格雷抵抗或反應(yīng)性低的現(xiàn)象，甚至對(duì)這兩藥存在同時(shí)抵抗，導(dǎo)致術(shù)后血栓形成的并發(fā)癥明顯增加[11]。因此，尋找多靶點(diǎn)、多通路且療效顯著、安全性高的抗血栓藥物具有重要意義；而建立理想的血栓模型是研究人類(lèi)疾病機(jī)理和藥物防治重要的研究手段之一。

苯肼是一種強(qiáng)氧化劑，能作用于機(jī)體后引起自由基產(chǎn)生，促進(jìn)紅細(xì)胞膜骨架和珠蛋白的氧化，使得紅細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)失衡，加速膜脂質(zhì)過(guò)氧化，最終紅細(xì)胞變形能力降低并使其易于黏附到細(xì)胞外基質(zhì)中，進(jìn)而損傷血管內(nèi)膜，促進(jìn)血小板黏附、聚集和血管活性物質(zhì)的大量釋放，導(dǎo)致血栓形成[5,12]。本研究顯示，苯肼誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)的心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯減少和尾靜脈血栓明顯增加，這與張勇等[5]研究結(jié)果一致，并發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)紅細(xì)胞染色強(qiáng)度與尾靜脈血栓長(zhǎng)度呈明顯負(fù)相關(guān)，故可用紅細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)估血栓生成情況。用氯吡格雷干預(yù)后能明顯減輕其血栓率，證實(shí)苯肼能誘導(dǎo)活體斑馬魚(yú)血栓形成，其形成機(jī)制與苯肼引起紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基生成過(guò)多和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增加，促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷和血小板聚集，導(dǎo)致血栓形成有關(guān)。冠心寧片是由丹參和川芎兩味中藥組成，且這兩味藥均有活血化瘀的療效，在臨床上被廣泛用于治療冠心病心絞痛。前期已證實(shí)冠心寧片具有抗自由基作用[13]。同樣，冠心寧片能顯著對(duì)抗苯肼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)的血栓形成，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，表明冠心寧片有抗血栓形成作用，其效應(yīng)與對(duì)抗自由基生成，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和血小板聚集有關(guān)[7,13]。

花生四烯酸可誘導(dǎo)血小板釋放內(nèi)源性ADP，激活血小板聚集，這是血小板聚集的主要途徑之一；并且花生四烯酸通過(guò)環(huán)氧合酶和脂氧酶的作用，產(chǎn)生血栓素、前列腺素和白三烯等，其代謝產(chǎn)物血栓素TXA2具有收縮血管、促進(jìn)血小板聚集，增加血液粘滯性的作用，同時(shí)前列腺素具有擴(kuò)張血管和抑制血小板聚集的作用，兩者共同調(diào)節(jié)血小板的聚集和血管收縮程度，維持血管的正常張力和血液循環(huán)通暢[14]。本研究結(jié)果表明花生四烯酸能引起斑馬魚(yú)心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度降低和尾靜脈血栓明顯增加，用環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林干預(yù)后血栓形成減少明顯，故花生四烯酸也可誘導(dǎo)活體斑馬魚(yú)血栓形成，其機(jī)制與花生四烯酸代謝途徑有關(guān)。而給予冠心寧片干預(yù)后也能明顯對(duì)抗花生四烯酸誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓形成，提示冠心寧片抗血栓作用也可能影響花生四烯酸代謝途徑有關(guān)。

普納替尼是一種多靶點(diǎn)小分子酪氨酸激酶抑制劑，用于治療急慢性淋巴細(xì)胞白血病，但在臨床應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)嚴(yán)重的血栓和血管狹窄等副作用而受監(jiān)控。近來(lái)發(fā)現(xiàn)普納替尼導(dǎo)致血栓形成與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成，影響NO合成，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，誘發(fā)血栓形成有關(guān)[15]，并有學(xué)者發(fā)現(xiàn)普納替尼內(nèi)有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)[16]，可阻斷PI3K/AKT/eNOS通路的傳遞。令狐克剛等[17]發(fā)現(xiàn)阿司匹林對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，與其調(diào)控激活p-Akt/eNOS信號(hào)通路密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)普納替尼誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)能形成明顯的血栓，并用阿司匹林干預(yù)后能抑制血栓的形成，提示普納替尼所致斑馬魚(yú)血栓形成可能與PI3K/AKT/eNOS通路表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)。另外，冠心寧片干預(yù)后同樣能明顯對(duì)抗普納替尼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血栓的形成，該效應(yīng)可能與其能提高NO水平和保護(hù)血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，但是否與PI3K/AKT/eNOS通路表達(dá)調(diào)控有關(guān)，還有待于進(jìn)一步研究。

由此可見(jiàn)，苯肼、花生四烯酸和普納替尼均能建立活體斑馬魚(yú)血栓模型，并能快速、簡(jiǎn)便、直觀的觀察血栓形成和溶栓情況，但血栓形成機(jī)制可能有所差異，如苯肼誘導(dǎo)可能與自由基生成有關(guān)，花生四烯酸誘導(dǎo)可能與花生四烯酸代謝途徑有關(guān)，而普納替尼誘導(dǎo)可能與PI3K/AKT/eNOS通路表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)，故這些斑馬魚(yú)血栓模型對(duì)加快篩選抗栓藥物并了解其作用特點(diǎn)具有支撐作用。此外，通過(guò)對(duì)冠心寧片、氯吡格雷和阿司匹林藥物的干預(yù)也進(jìn)一步證實(shí)了斑馬魚(yú)模型的敏感性和有效性；進(jìn)而也證實(shí)冠心寧片具有抗血栓作用，且其抗血栓機(jī)制存在多靶點(diǎn)效應(yīng)。

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Establishment of a zebrafish model of thrombosis and theinterventioneffectofGuanxinningtablet

WANGMu-lan1,PANYong-ming2,JINMin1,XUXiao-ping2,WANGDe-jun2,MAQuan-xin2,CHENMin-li2*

(1.ZhengdaQingchunbaoPharmaceuticalCo.,Ltd.Hangzhou310023;2.LaboratoryAnimalResearchCenter,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

ObjectiveToestablishazebrafishmodelofthrombosisinducedbythreekindsofinducersandobservetheanti-thromboticeffectofaChinesetraditionalmedicine,Guanxinningtablet(GXN).MethodsThezebrafishmodelsofthrombosiswasinducedbyusing1.5μmol/Lphenylhydrazine, 80μmol/Larachidonicacidand5mg/Lponatinib,respectively,andweretreatedwithvariousconcentrationofGXN,clopidogrelorasprin.Thethrombusinthetailveinwasobservedundermicroscope,Erythrocytesinthezebrafishheartwerestainedwitho-dianisidineandtheerythrocytestainingintensitywasassessedwithaNIS-ElementsDTMimageanalyzer,andtheanti-thromboliceffectofGXNwascalculated.ResultsVenousthrombuswassignificantlyincreasedandthestainingintensitiesoferythrocytesintheheartweresignificantlydecreasedafterinductionbyphenylhydrazine,arachidonicacidorPonatinib(P<0.001),respectively.Atthesametime,GXNshowedanincresinganti-thromboliceffectinthezebrafishmodels(P<0.001)inadose-effectmanner,withaIC50ofGXNof44.32mg/L,138.5mg/Land459.5mg/L,respectively.ConclusionsThezebrafishmodelsofthrombosisaresuccessfullyestablishedbyphenylhydrazine,arachidonicacidorPonatinib,respectively,bydifferentformationmechanisms.GXNhasbeenshowntohaveananti-thrombosiseffect,probably,bymultipletargeteffects.

Guanxinningtablet;Thrombosismodel;Zebrafish;Anti-thromboticeffect;Phenylhydrazine;Arachidonicacid;Ponatinib

CHENMin-li.E-mail:cmli991@aliyun.com

浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(XTD201301)。

王木蘭(1983-)，女，工程師，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼-mail:qcbwml@163.com

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail:cmli991@aliyun.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0432-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.018

2016-05-10