加拿大紅參(Parastichopuscalifornicus)基本成分分析及其酶解工藝研究

楊　穎,汪秋寬,谷　越,何云海,宋悅凡,叢?；?劉　舒,祁艷霞

(大連海洋大學國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室,遼寧大連 116023)

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加拿大紅參(Parastichopuscalifornicus)基本成分分析及其酶解工藝研究

楊穎,汪秋寬*,谷越,何云海,宋悅凡,叢?；?劉舒,祁艷霞

(大連海洋大學國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室,遼寧大連 116023)

本文以加拿大紅參(Parastichopuscalifornicus)為原料,研究其最優(yōu)酶解工藝?；境煞譁y定結(jié)果表明加拿大紅參的蛋白質(zhì)含量73.33%,脂肪0.97%,灰分23.85%,粘多糖1.68%。研究以多肽得率為指標確定了加拿大紅參的最優(yōu)酶解工藝,并估算了其酶解液多肽分子量分布。實驗使用枯草桿菌中性蛋白酶與風味蛋白酶組成的復合酶對海參進行酶解,最優(yōu)酶解工藝:酶解溫度為55 ℃、pH為7.5、料液比1∶5、酶解時間為3 h、酶加量為1.05%,最優(yōu)條件下,酶解液中多肽得率為13.99%,通過Sephadex G-50對加拿大紅參酶解液多肽分子量分布范圍進行估算,得出分子量分布為1130～129460 u。

海參,基本成分,酶解工藝,酶解液多肽分子量

Aquatic Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian 116023,China)

海參為棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirota)動物,是海洋中重要的食物和藥物資源[1],全世界約有1100多種,我國海域有100多種,北起渤海灣,南到潿洲島都有出產(chǎn),其中西沙群島就有20多種[2]。海參高蛋白,低脂肪,且富含各種人體必需的氨基酸、維生素、必需脂肪酸及常量和微量元素[3]。隨著近幾年對海參生物活性物質(zhì)的分離、鑒定及其生物醫(yī)學作用等研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)海參含有許多具有重要生物學活性的物質(zhì),如海參多肽等[4]。海參多肽具有多種生物活性,如抗氧化、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗癌以及鎮(zhèn)痛等生物活性[5]。本文以多肽得率為指標,對加拿大紅參多肽的酶解工藝進行了優(yōu)化,以確定以其為原料開發(fā)多肽產(chǎn)品的價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

加拿大紅參大連水產(chǎn)品市場;木瓜蛋白酶索萊寶公司;枯草桿菌中性蛋白酶,風味蛋白酶上海藍季科技發(fā)展有限公司;Sephadex G-50凝膠GE Healthcare Bio-Sciences AB;藍葡聚糖上海藍季科技發(fā)展有限公司;胰島素,細胞色素c,胰凝乳蛋白索萊寶公司;三氯乙酸(TCA),鹽酸,無水乙醚,過氧化氫,無水乙醇等常規(guī)試劑均為分析純;雙縮脲試劑實驗室配制。

HWS-26型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司;721S分光光度計上海分析儀器總廠;LD5-2A型離心機北京醫(yī)用離心機廠;101-2-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠;TU-1810DAPC紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;全自動凱氏定氮儀北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1海參基本成分測定蛋白質(zhì)由GB/T 5009.5-2010方法測定[6];粗脂肪由GB/T 5009.6-2003方法測定[7];粗灰分由GB/T 5009.4-2010方法測定[8]。

1.2.2粘多糖含量的測定粘多糖含量的測定參照鄭艾初[9]等的提取工藝方法:將海參浸泡脫鹽,勻漿,將其放入丙酮中,4 ℃浸泡24 h。之后濾去丙酮,加入三倍體積的水,進行提取,提取工藝為:pH6.0,木瓜蛋白酶酶加量250 U/g,水解溫度為60 ℃,水解時間為9.0 h。提取結(jié)束后放入沸水中滅酶10 min,加入3倍體積無水乙醇4 ℃過夜,4 ℃條件下8000 r/min離心10 min,凍干,H2O2法脫色[10],3倍體積無水乙醇4 ℃過夜,凍干得到粗多糖,并使用苯酚硫酸法測定純度,得出粘多糖含量。

1.2.3海參酶解工藝優(yōu)化稱取一定量的海參,在相應(yīng)的溫度、時間、pH、料液比、酶加量條件下進行酶解。

酶解工藝為:海參脫鹽→勻漿→酶解→滅酶→離心→按體積比1∶1加入10%TCA→離心→雙縮脲法測定多肽含量。

因酸性蛋白酶的最適pH為2.0～2.5,堿性蛋白酶的最適pH為11,反應(yīng)條件劇烈,而中性蛋白酶主要從蛋白質(zhì)內(nèi)部將肽鍵打開,專一性突出,反應(yīng)條件溫和,水解效力適中,操作易于控制,并且不會破壞氨基酸結(jié)構(gòu)和其它營養(yǎng)成分[4]。故研究選擇枯草桿菌中性蛋白酶與風味蛋白酶組成的復合酶,酶比例為3∶1(酶活比)[11]。

1.2.3.1酶解反應(yīng)pH的選擇在酶解溫度50 ℃,酶解時間4 h,料液比1∶3,酶加量為1.74%(與底物重量比,下同)的條件下,將pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,研究不同pH對酶解反應(yīng)的影響。

1.2.3.2酶解反應(yīng)酶加量的選擇在酶解溫度為50 ℃,酶解時間4 h,料液比1∶3,pH為7.0的條件下,設(shè)置酶加量依次為0.70%、1.05%、1.39%、1.74%、2.09%、2.44%,研究不同酶加量對酶解反應(yīng)的影響。

1.2.3.3酶解時間的選擇在酶解溫度50 ℃,酶加量為1.05%,料液比1∶3,pH為7.0的條件下,設(shè)置酶解時間依次為3、4、5、6、7、8 h,研究不同酶解時間對酶解反應(yīng)的影響。

1.2.3.4酶解反應(yīng)溫度的選擇在酶解時間4 h,酶加量1.05%,料液比為1∶3,pH為7.0的條件下,設(shè)置酶解溫度依次為40、45、50、55、60、65 ℃,研究不同酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響。

1.2.3.5酶解反應(yīng)料液比的選擇在酶解溫度55 ℃,酶解時間4 h,酶加量1.05%,pH為7.0的條件下,設(shè)置料液比依次為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7,研究不同料液比對酶解反應(yīng)的影響。

1.2.3.6正交實驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計正交實驗。為研究是否可以通過正交實驗在料液比較低時獲得較高的酶解液多肽得率,以節(jié)約資源,因此正交實驗中料液比因素選擇與單因素實驗相同的斷點。正交因素水平表見表1。

表1　正交因素水平表

1.2.4酶解液中多肽得率測定方法由于反應(yīng)中含有料液比因素,故在相同底物質(zhì)量的條件下,以不同反應(yīng)條件得出的酶解液中多肽得率為指標,比較不同條件的酶解效果。

具體方法為:使用TCA結(jié)合雙縮脲法[12-14],測定酶解液中多肽得率。具體方法為:取5 mL上清液加入5 mL的TCA溶液,濃度為10%,4000 r/min條件下離心10 min,得上清。分別向試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準蛋白溶液,用水補足到1 mL,然后加入4 mL雙縮脲,充分搖勻,室溫下放置30 min,于540 nm處進行比色測定。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標,光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。

取上清液1 mL,加入4 mL雙縮脲,充分搖勻,室溫下放置30 min,于540 nm處進行比色測定。通過標準曲線計算酶解液中多肽濃度(mg/mL)。

通過酶解液多肽濃度計算酶解液中多肽質(zhì)量,從而得出相應(yīng)酶解條件下的多肽得率。多肽得率的計算方法為:

多肽得率(%)=(酶解液體積(mL)×酶解液多肽濃度(mg/mL))/原料中蛋白含量(mg)×100

1.2.5海參酶解液多肽分子量分布分析先將Sephadex G-50凝膠抽真空去氣泡,然后裝填層析柱(1.6 cm×100 cm),用雙蒸水平衡24 h。

用藍葡聚糖2000測定柱外水體積V0,分別以桿菌肽(1422 u),胰島素(5500 u),細胞色素c(12384 u),胰凝乳蛋白(25000 u),牛血清蛋白(67000 u)為標準品,分別將2 mg標準品溶于1 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中,上柱,樣品流速為0.3 mL/min,每3 mL收集一管。使用紫外分光光度計,在280 nm處測定每管洗脫液吸光值,以標準品的洗脫體積計算相應(yīng)的分配系數(shù),繪制lgM-Kav標準曲線,并根據(jù)標準曲線計算樣品的分子量。

表2　加拿大紅參基本成分表

Kav值計算公式見式(1):

Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)

式(1)

式(1)中:Kav-分配系數(shù);Ve-洗脫體積;Vo -外水體積;Vt-總體積。

將海參酶解液冷凍干燥,得到海參多肽粉,取10 mg樣品溶于1 mL緩沖液中,按上述方法進行洗脫,在280 nm處測定每管洗脫液吸光值。以洗脫體積為橫坐標,280 nm處洗脫液吸光值為縱坐標繪制出洗脫曲線,計算洗脫曲線中各峰值處的Kav值。并通過標準曲線讀出該點lgM值,從而估算酶解液多肽分子量分布。

2　結(jié)果與分析

2.1海參基本成分

加拿大紅參的基本成分分析結(jié)果如表2所示。

王遠紅[15]對采自西沙群島海參科的糙參(Holothuriascabra)、烏皺輻肛參(ActinoPrgaechinite)、蕩皮海參(Holothuriavagabunda)的基本成分進行了測定,所選的三種海參蛋白質(zhì)含量69.61%～72.32%,脂肪0.41%～1.12%,灰分8.48%～18.35%,粗多糖在2.56%～7.23%。王磊等[16]對凍鮮東海海參體壁的營養(yǎng)成分進行了測定,得出其粗蛋白含量為71.74%,粗脂肪為0.8%,灰分為16.04%,粗多糖含量為5.71%。通過比較可以得出加拿大紅參屬于高蛋白,低脂肪的健康食品,蛋白質(zhì)含量占干重的70%以上。灰分含量與鹽干時鹽添加量有關(guān)。鹽干加拿大紅參中的粘多糖成分略低為1.75%。

2.2酶解工藝優(yōu)化

2.2.1pH對酶解液多肽得率的影響pH對酶解液中多肽得率的影響如圖1所示。酶是一種特殊的蛋白質(zhì),而pH對酶的分子結(jié)構(gòu)和底物的溶解性會有很大影響,因此對于酶活性和反應(yīng)速度也會產(chǎn)生影響。當pH低于或高于一定值后,即極端的反應(yīng)條件,會引起酶失活。從圖1中可以看出pH為7時,酶解效果最好(p<0.01)。酶解反應(yīng)pH在5.5～7范圍內(nèi)時,隨著pH不斷升高,酶解液中多肽得率不斷增大。當pH大于7時,酶活力又會不斷減小,水解速率降低,故酶解效果呈下降趨勢。由于枯草桿菌中性蛋白酶和風味蛋白酶的最適pH均處于7左右,因此在中性條件下,酶解反應(yīng)效果最好。

圖1　pH對加拿大紅參酶解液多肽得率的影響Fig.1　The effects of pH value on the Parastichopus californicus hydrolyzing

2.2.2酶加量對酶解液多肽得率的影響對酶解液中多肽得率的影響如圖2所示。加拿大紅參的最適酶加量為1.05%(p<0.01)。當酶加量低于其最優(yōu)酶加量時,會因酶濃度過低而造成蛋白水解程度降低;相反,過高的酶濃度造成多肽進一步水解成氨基酸,從而使其含量降低。

圖2　酶加量對加拿大紅參酶解液多肽得率的影響Fig.2　The effects of enzyme amount added on the Parastichopus californicus hydrolyzing

2.2.3酶解時間對酶解液多肽得率的影響酶解時間對酶解液中多肽得率的影響如圖3所示。從圖中可以看出,隨著酶解時間的增加,多肽得率先升高,隨后逐漸下降,4 h時達到最大值(p<0.01)。分析原因可能是隨著酶解時間的增加,多肽進一步酶解成氨基酸,從而降低酶解液中肽的含量。因此,酶解反應(yīng)時間不宜過長,以4 h最優(yōu)。

圖3　酶解時間對加拿大紅參酶解液多肽得率的影響Fig.3　The effects of time on the Parastichopus californicus hydrolyzing

2.2.4酶解溫度對酶解液多肽得率的影響酶解溫度對酶解液中多肽得率的影響如圖4所示。從圖可以看出,加拿大紅參酶解液中的多肽得率在低于55 ℃的條件下,隨酶解溫度增加而升高,55 ℃時多肽得率達到最大值(p<0.01),當溫度超過55 ℃時,多肽得率開始下降。可能是當反應(yīng)溫度低于反應(yīng)所用酶的最適溫度時,酶解反應(yīng)速率會隨著溫度的升高而不斷增大;而當溫度高于酶最適溫度后,由于結(jié)構(gòu)的改變,蛋白酶不斷失去活性,酶解效果逐漸下降,酶解液中的多肽得率隨之降低。酶的最適反應(yīng)溫度是酶促反應(yīng)重要影響因素之。反應(yīng)過程中偏離此溫度,酶解程度便會降低,達不到最理想的水解效果[17]。

圖4　酶解溫度對加拿大紅參酶解液多肽得率的影響Fig.4　The effects of temperature on the Parastichopus californicus hydrolyzing

2.2.5料液比對酶解液多肽得率影響料液比對酶解效果的影響如圖5所示。從圖中可以看出,加拿大紅參在料液比1∶2～1∶5范圍內(nèi)時,酶解液多肽得率隨著反應(yīng)體系中水的增加先變大,料液比為1∶5時的酶解液多肽得率最高(p<0.01)。料液比在1∶5～1∶7范圍內(nèi)時,多肽得率無顯著性差異(p>0.05)。這是由于在料液比為1∶2時,反應(yīng)體系中底物粘稠,與蛋白酶的接觸少,酶解反應(yīng)受到阻礙,反應(yīng)速率低,因此酶解程度也相應(yīng)較低。隨著反應(yīng)體系中水的增加,酶與底物充分接觸,水解速率不斷增加。料液比在1∶5～1∶7范圍內(nèi)時,多肽得率隨料液比變化無明顯增大,可能是由于加水量過多會使酶濃度降低,從而減慢了反應(yīng)速度;且工業(yè)化生產(chǎn)時加水量過多會因為濃縮工藝增加生產(chǎn)成本,因此料液比選在1∶5較為合適。

圖5　料液比對加拿大紅參酶解液多肽得率的影響Fig.5　The effects of material and water ratio on the Parastichopus californicus hydrolyzing

2.2.6酶解條件正交實驗優(yōu)化本實驗以酶解溫度、pH、料液比、酶解時間、酶加量為因素,以酶解液中多肽得率為指標,根據(jù)海參單因素實驗結(jié)果,使用L16(45)設(shè)計正交實驗,結(jié)果見表3。

從表3的極差分析中可以看出,各因素影響提取過程的主次順序是A(酶解溫度)>C(料液比)>D(酶解時間)>B(pH)>E(酶加量)。得出理論最優(yōu)組合A1B1C4D1E2,即酶解溫度為50 ℃、pH為6.5、料液比1∶5、酶解時間為3 h、酶加量為1.05%。

實驗結(jié)果方差分析見表4。通過方差分析可見,酶解溫度對酶解液中多肽得率影響顯著,其它四個因素則不顯著。

表4　正交實驗結(jié)果方差分析表

注：*表示有顯著性差異(p<0.05)。

根據(jù)正交實驗結(jié)果可以看出,實驗最優(yōu)組為A2B3C4D1E2,即酶解溫度55 ℃、pH7.5、料液比1∶5、酶解時間3 h、酶加量1.05%。

比較理論最優(yōu)組與實驗最優(yōu)組酶解液中的多肽得率,進行驗證實驗,確定最優(yōu)酶解工藝。實驗結(jié)果如表5。

經(jīng)過驗證實驗,得出最優(yōu)酶解工藝為A2B3C4D1E2,即酶解溫度為55 ℃、pH為7.5、料液比1∶5、酶解時間為3 h、酶加量為1.05%。

2.3酶解液多肽分子量分布估算

如圖7為加拿大紅參酶解液多肽分子量分布曲線。

圖6　分子量標準曲線Fig.6　Standard curve for estimating moleculor weight of peptides in hydrolysate

表3　加拿大紅參正交實驗結(jié)果

表5　最優(yōu)實驗組合的確立

圖7　加拿大紅參酶解液多肽分子量分布曲線Fig.7　The molecular weight distribution curve of Parastichopus californicus hydrolysate

從圖7可以看出,加拿大紅參酶解液多肽分子量范圍為1133～129457 u,圖中標識的三個峰值對應(yīng)的肽段所含的氨基酸數(shù)目分別約為1012,74,9。加拿大紅參具有開發(fā)海參多肽類產(chǎn)品的潛力。

3　討論

海參營養(yǎng)豐富,通過本文研究結(jié)果可以證實海參具有高蛋白,低脂肪的優(yōu)點。蘇永昌[18]等對海參多肽的生物活性進行了研究,發(fā)現(xiàn)海參多肽不僅可以加工成營養(yǎng)補充劑,而且也可以作為制備抗氧化,抗衰老的保健品或化妝品的原料。Schmeer[19]發(fā)現(xiàn)一種分子量小于10000 u的多肽類物質(zhì)-糖肽或小分子的核蛋白可能具有抗腫瘤的活性。本文所選的加拿大紅參基本成分中含有蛋白質(zhì),粘多糖等成分,且脂肪含量很低。通過對加拿大紅參酶解液多肽分子量分布的測定,得出分子量范圍為1133～129457 u,其具備開發(fā)多肽類產(chǎn)品的潛力。

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Study on the hydrolyzing technologies of basic flavoring materials fromParastichopuscalifornicus

YANG Ying,WANG Qiu-kuan*,GU Yue,HE Yun-hai,SONG Yue-fan,CONG Hai-hua,LIU Shu,QI Yan-xia

(Dalian Ocean University,National R&D Branch Center For Seaweed Processing,Key Laboratory of

TakenParastichopuscalifornicusas raw materials,the technologies for hydrolyzing sea cucumber were optimized. The approximate compositions of the raw materials were analyzed. The results showed that the protein content was 73.33%. The lipid content was 0.97%. The ash content was 23.85%. The mucopolysaccharide content was 1.68%. The enzymes used in the experiment were the bacillus subtilis neutral proteinase and the flavourzyme. The technologies for hydrolyzing the sea cucumber were as the hydrolyzing temperature 55 ℃,pH 7.5,the material to liquid ratio 1∶5,the hydrolyzing time 3 h,the amount of enzymes 1.05%.The peptide content of enzymatic hydrolysis at the optimal conditions was 13.99%.The polypeptide molecular weight distribution of their hydrolyzing products were estimated by Sephadex G-50,which indicated that the distribution ofParastichopuscalifornicuswas among 1133～129457 Da.

sea cucumbers;basic ingredients;hydrolyzing technologies;hydrolyzing products molecular weight

2015-04-13

楊穎(1990-),女,碩士,研究方向：水生生物資源利用,E-mail:1051542620@qq.com。

汪秋寬(1962-),女,碩士,教授,研究方向：水生生物資源利用,E-mail:wqk320@dlou.edu.cn。

國家科技成果轉(zhuǎn)化項目(2008GB2B000061)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000