裂壺藻補(bǔ)糖發(fā)酵及糖氮代謝對(duì)產(chǎn)油的影響

付　杰,林源鋒,謝鑫磊,田　華,陳　濤,何東平,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

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裂壺藻補(bǔ)糖發(fā)酵及糖氮代謝對(duì)產(chǎn)油的影響

付杰1,林源鋒1,謝鑫磊1,田華1,陳濤2,何東平1,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

為了探索裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)突變株生長及產(chǎn)油過程中對(duì)碳源和氮源的需求,本文對(duì)發(fā)酵各階段的碳源和氮源利用變化情況進(jìn)行測定,并設(shè)定五個(gè)在不同時(shí)期的補(bǔ)糖實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行研究,分別觀測各組各時(shí)期生物量、油脂產(chǎn)量。結(jié)果表明,前96 h是裂壺藻生長的重要時(shí)期,生物量大幅度增長,在發(fā)酵144～168 h時(shí),油脂產(chǎn)量達(dá)到最大,各組經(jīng)發(fā)酵7 d收獲總的藻體,對(duì)生物量、油脂產(chǎn)量、DHA含量和DHA產(chǎn)量進(jìn)行綜合測定,結(jié)果表明,在發(fā)酵120 h時(shí)進(jìn)行補(bǔ)糖為最佳時(shí)期,且油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量相比于對(duì)照組分別高出18.80%和22.44%。當(dāng)?shù)春谋M時(shí)補(bǔ)糖不僅可以促進(jìn)油脂的產(chǎn)生,而且對(duì)DHA的形成也是有利的。

裂壺藻突變株,營養(yǎng)代謝,補(bǔ)糖發(fā)酵

DHA具有防治心血管疾病,提高人體免疫力、預(yù)防和減輕精神疾病、消炎、抗癌等功能。1993年世界衛(wèi)生組織正式推薦嬰幼兒生長發(fā)育早期階段要補(bǔ)充DHA后,DHA吸引了越來越多的關(guān)注[1-2],裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)是一種海洋真菌,該菌富含DHA,油脂含量高、生長快、易于培養(yǎng)、對(duì)人畜無毒害,并且細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成簡單、分離純化工藝簡單,是一種極具工業(yè)化生產(chǎn)前景的微生物油脂資源[3-4]。

裂壺藻在生長對(duì)數(shù)期之前主要利用碳源和氮源進(jìn)行自身的生長繁殖和油脂積累,生長對(duì)數(shù)期之后若沒有及時(shí)的碳源補(bǔ)給,裂壺藻便會(huì)分解自身的油脂來提供生存所必需的能量[5]。因此,及時(shí)的補(bǔ)糖有利于裂壺藻油脂積累[6-7]。盧英華等[8]利用流加技術(shù)高密度培養(yǎng)裂壺藻生產(chǎn)DHA,生物量、脂肪酸及DHA含量分別達(dá)到60.6、40.2和8.0 g/L。De Swaaf等[9]報(bào)道,當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度過高會(huì)抑制菌體生長,只有當(dāng)碳氮濃度適中,并且達(dá)到一個(gè)適合的碳氮比才有可能盡量的提高產(chǎn)油率和DHA含量。本文通過研究裂壺藻發(fā)酵過程中的碳氮含量的變化,通過每天對(duì)發(fā)酵液碳氮含量進(jìn)行測定,并且觀測生物量、油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量,了解裂壺藻發(fā)酵過程中,碳氮代謝對(duì)產(chǎn)油的影響,并且通過對(duì)不同的培養(yǎng)時(shí)間補(bǔ)糖發(fā)酵,以期來增加油脂產(chǎn)量,從而為大規(guī)模生產(chǎn)化提供了必要的科學(xué)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

裂壺藻株ATCC20888廣東微生物菌種保藏中心,并經(jīng)過等離子誘變獲得的裂壺藻突變株15k-160s-2-3,本實(shí)驗(yàn)室保存。葡萄糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉天津博迪化工股份有限公司;酵母膏北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;谷氨酸鈉上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;硫酸鎂國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鈷天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;正己烷天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鉀、氯化鈣天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇天津天力化學(xué)試劑有限公司;纖維素酶、堿性蛋白酶江蘇銳陽生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純。

Agilent 7890A氣相色譜儀安捷倫科技(中國)有限公司;SPX-150C恒溫恒濕箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HYQ-150S全溫?fù)u床武漢匯誠生物科技有限公司;YM75立式壓力蒸汽滅菌器上海三申醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-1F 單人雙面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;XSP-BM-2CA生物顯微鏡寧波永新光學(xué)有限公司。

固體培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L、谷氨酸鈉18 g/L、酵母膏12 g/L、海水晶24 g/L、硫酸銨2.4 g/L、金屬離子混合液1 mL、維生素混合液2 mL、瓊脂2%。液體培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L、谷氨酸鈉18 g/L、酵母膏12 g/L、海水晶24 g/L、硫酸銨2.4 g/L、硫酸鈉6 g/L、磷酸二氫鉀5.76 g/L、金屬離子混合液1 mL、維生素混合液2 mL。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵補(bǔ)糖代謝設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)五個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在發(fā)酵24、48、72、96、120 h時(shí)補(bǔ)15 g/L糖和一個(gè)不補(bǔ)糖發(fā)酵的對(duì)照組,并且五個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組初始葡萄糖質(zhì)量濃度均為80 g/L,每24 h檢測各組糖、氮利用情況,并收獲藻體,分別測定各階段產(chǎn)油量。最后對(duì)整個(gè)發(fā)酵周期完全的各組進(jìn)行生物量、產(chǎn)油量、DHA含量及DHA產(chǎn)量的整體測定。

1.2.2無菌培養(yǎng)條件種子培養(yǎng):從無菌長勢(shì)良好的藻種的斜面上取一定量純凈的藻落,用無菌破口試管取10%接種到種子培養(yǎng)液中,置于搖床上,pH6.5,26 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng):用滅過菌的破頭吸管吸取10%的種子液,轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,于26 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。

1.2.3還原糖質(zhì)量濃度的測定參照菲林試劑法[10]

1.2.4氨基酸質(zhì)量濃度的測定參照甲醛滴定法[11]

1.2.5生物量的測定裂壺藻的生物量以收集的菌體細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)。取培養(yǎng)好的菌體發(fā)酵液100 mL預(yù)先稱重的離心管中5000 r/min離心20 min,棄上清液,沉淀用蒸餾水清洗后再次離心、棄上清液,反復(fù)操作3次,置于干燥箱中,60 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定,稱質(zhì)量。生物量的計(jì)算公式如下:

1.2.6油脂的提取及產(chǎn)量測定油脂的提取:將裂壺藻發(fā)酵液經(jīng)過離心分離,去除上清液,在藻泥中加入一定量的蒸餾水混合均勻,置于恒溫磁力攪拌器中,溫度60 ℃下攪拌,調(diào)節(jié)pH到8左右,按發(fā)酵液質(zhì)量體積的0.5%和0.025%分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶,55 ℃酶解6～8 h,用顯微鏡觀察破壁情況,破壁完成置于真空冷凍干燥至質(zhì)量恒定,研磨成藻粉,用乙醚索氏抽提至藻粉至無色,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)殘留溶劑,置于烘箱干燥至兩次質(zhì)量變化<0.2 mg/L,計(jì)算油脂質(zhì)量。油脂產(chǎn)量及含油率的計(jì)算公式如下:

1.2.7DHA含量測定

1.2.7.1待測樣品的處理精密稱取0.2 g的油脂于20 mL試管中,加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液2 mL,60 ℃水浴加熱至油珠完全溶解(約30 min),冷卻后加入25%的BF3-CH3OH 溶液2 mL,60 ℃水浴酯化20 min。冷卻后加入2 mL正己烷并振蕩,再加入2 mL飽和NaCl溶液并振蕩。靜置30 min后取上層有機(jī)相于一只干燥試管中,并加入少量無水硫酸鈉以去除微量水分,經(jīng)氣相色譜分析得到DHA相對(duì)含量。

DHA產(chǎn)量計(jì)算公式如下:

DHA產(chǎn)量(g/L)=油脂產(chǎn)量(g/L)×DHA含量(%)

1.2.7.2氣相色譜分析條件色譜柱:Agilent SP-2560(100 m×25 μm,0.2 μm);升溫程序:100 ℃保持4 min,以3 ℃/min升溫至230 ℃,保持20 min,載氣(N2)流速25 mL/min,壓力2.4 kPa,進(jìn)樣量1 μL;分流比15∶1。

2　結(jié)果與分析

2.1裂壺藻突變株對(duì)碳、氮的利用變化及不同時(shí)期的補(bǔ)糖對(duì)產(chǎn)油的影響

裂壺藻突變株對(duì)碳、氮利用的變化及補(bǔ)糖發(fā)酵對(duì)產(chǎn)油的影響的情況見圖1～圖6,圖1為A組對(duì)照組,圖2～圖6為B、C、D、E、F組分別為發(fā)酵24、48、72、96、120 h時(shí)補(bǔ)15 g/L糖組,將對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)7 d,每隔24 h用斐林試劑法和甲醛滴定法對(duì)各組各時(shí)刻的碳、氮變化進(jìn)行測定,并計(jì)算碳、氮消耗情況、碳氮比,確定生物量及油脂產(chǎn)量。首先測定了每組實(shí)驗(yàn)初始葡萄糖和氨基酸質(zhì)量濃度將近為80.92 g/L和14.86 g/L,其次在各組分別補(bǔ)糖,補(bǔ)糖組在補(bǔ)糖時(shí)刻,糖的含量都高于其他各組,當(dāng)發(fā)酵144 h以后測定A、B、C、D、E、F組葡萄糖和氨基酸質(zhì)量濃度基本不變。最后在發(fā)酵168 h后收獲藻體,測定各組總的生物量、油脂產(chǎn)量、DHA含量、DHA產(chǎn)量,進(jìn)行綜合對(duì)比。

從圖1首先看出對(duì)照組A前96 h糖耗為86.76%左右,氮耗為92.92%左右;說明前96 h是裂壺藻利用營養(yǎng)物質(zhì)的主要時(shí)期,96 h后碳源和氮源消耗趨于穩(wěn)定;其次前96 h糖耗的速率先慢后快,而氮耗的速率則是先快后慢,表明裂壺藻突變株前期較快利用氮源進(jìn)行營養(yǎng)生長。并且前96 h生物量大幅度增長,說明前96 h為裂壺藻快速增長期,96 h之后生物量增長比例變小,而油脂產(chǎn)量增長比例逐漸增大。在144 h達(dá)到產(chǎn)量最大值,說明裂壺藻在發(fā)酵后期為產(chǎn)油脂重要時(shí)期。當(dāng)168 h收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅8.62 g/L,氨基酸質(zhì)量濃度為1.02 g/L,碳/氮質(zhì)量濃度(g/L)比約為8.5∶1。

圖1　對(duì)照組A碳、氮利用變化Fig.1　Contrast group A changes of the use of sugar and nitrogen

從圖2看出實(shí)驗(yàn)組B與對(duì)照組A相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變,還原糖質(zhì)量濃度曲線在24 h時(shí)略有上升;96 h后趨于穩(wěn)定,此時(shí)糖耗為86.13%左右,氮耗為92.60%左右;在前48 h生物量及油脂產(chǎn)量相比于對(duì)照組有所下降,可能是因?yàn)榘l(fā)酵24 h補(bǔ)糖后,糖濃度過高對(duì)裂壺藻生長有一定的抑制作用。當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅8.52 g/L,氨基酸質(zhì)量濃度為1.04 g/L,碳/氮質(zhì)量濃度(g/L)比約為8.2∶1。

圖2　實(shí)驗(yàn)組B碳、氮利用變化Fig.2　Test group B changes of the use of carbon and nitrogen

從圖3看出實(shí)驗(yàn)組C與對(duì)照組A相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變,還原糖質(zhì)量濃度曲線在48 h時(shí)略有上升;96 h后趨于穩(wěn)定,此時(shí)糖耗為86.51%左右,氮耗為90.71%左右;生物量和油脂產(chǎn)量相比于對(duì)照組A、B都有小幅度的提高。當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅8.28 g/L,氨基酸質(zhì)量濃度為1.28 g/L,碳/氮質(zhì)量濃度(g/L)比約為6.5∶1。

圖3　實(shí)驗(yàn)組C碳、氮利用變化Fig.3　Test group C changes of the use of carbon and nitrogen

從圖4看出實(shí)驗(yàn)組D與對(duì)照組A相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變,還原糖質(zhì)量濃度曲線在72 h時(shí)略有上升;96 h后趨于穩(wěn)定,此時(shí)糖耗為87.33%左右,氮耗為91.39%左右;生物量和油脂產(chǎn)量相比于對(duì)照組A、B、C都有一定幅度的提高。當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅8.32 g/L,氨基酸質(zhì)量濃度為1.29 g/L,碳/氮質(zhì)量濃度(g/L)比約為6.5∶1。

圖4　實(shí)驗(yàn)組D碳、氮利用變化Fig.4　Test group D changes of the use of carbon and nitrogen

從圖5看出實(shí)驗(yàn)組E與對(duì)照組A相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變,還原糖質(zhì)量濃度曲線在96 h時(shí)略有上升;前72 h糖耗為52.81%左右,氮耗為85.24%左右;當(dāng)96 h補(bǔ)15 g時(shí)時(shí),發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?7.19%左右,氨基酸濃度為9.89%左右;生物量相比于對(duì)照組A沒有太大增長,而油脂產(chǎn)量相比于A、B、C、D組卻有一定幅度提高,說明發(fā)酵中后期補(bǔ)糖對(duì)裂壺藻產(chǎn)油脂有比較大的影響。當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅8.46 g/L,氨基酸質(zhì)量濃度為1.05 g/L,碳/氮質(zhì)量濃度(g/L)比約為8∶1。

表1　對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量及含量Table 1　The Biomass,oil production,DHA production and content of contraet group and test group

圖5　實(shí)驗(yàn)組E碳、氮利用變化Fig.5　Test group E changes of the use of carbon and nitrogen

從圖6看出實(shí)驗(yàn)組F與對(duì)照組A相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變,還原糖質(zhì)量濃度曲線在120 h時(shí)略有上升;前96 h糖耗為84.37%左右,氮耗為92.02%左右;當(dāng)120 h補(bǔ)糖15 g時(shí),發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?9.16%左右,氨基酸濃度為7.70%左右;圖中可以看出F組生物量、油脂產(chǎn)量相比于其他各組都有相當(dāng)程度的提高,說明在發(fā)酵后期補(bǔ)充一定量的碳源對(duì)于裂壺藻產(chǎn)油是非常有利的。當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅8.70 g/L,氨基酸質(zhì)量濃度為1.10 g/L,碳/氮質(zhì)量濃度(g/L)比約為8∶1。

圖6　實(shí)驗(yàn)組F碳、氮利用變化Fig.6　Test group F changes of the use of carbon and nitrogen

2.2補(bǔ)糖發(fā)酵對(duì)裂壺藻突變株干重、產(chǎn)油率及DHA的影響

將對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵7 d后,對(duì)它們的生物量、油脂產(chǎn)量、及DHA產(chǎn)量及含量進(jìn)行綜合測定,得出表1。

從表1中可以看出,實(shí)驗(yàn)組B、C、D、E、F中生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量、DHA含量多數(shù)都高于對(duì)照組A,尤其是實(shí)驗(yàn)組F油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量相比于對(duì)照組A分別高出18.80%和22.44%。

3　結(jié)果與討論

本文通過對(duì)裂壺藻糖、氮代謝變化進(jìn)行觀測,得出前96 h是裂壺藻生長的重要時(shí)期,隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行,碳/氮比會(huì)一直下降。當(dāng)對(duì)照組發(fā)酵至120 h時(shí),發(fā)酵液中碳/氮比約為7∶1,此時(shí)補(bǔ)糖的F組生物量、油脂產(chǎn)量DHA產(chǎn)量及含量都達(dá)到本實(shí)驗(yàn)最高。從補(bǔ)糖角度來分析,五個(gè)不同的補(bǔ)糖實(shí)驗(yàn)組油脂的生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量及含量多數(shù)高于對(duì)照組。盧英華等通過流加培養(yǎng)裂壺藻表明,當(dāng)裂壺藻受到氮源的限制,油脂濃度成指數(shù)增長。說明油脂的積累是在細(xì)胞生長受限的條件下進(jìn)行的,細(xì)胞不會(huì)消耗自身合成的油脂;在線性生長時(shí),營養(yǎng)限制使得細(xì)胞生長受限因此產(chǎn)生更多的油脂,并且充足的營養(yǎng)供給可能導(dǎo)致更多的飽和脂肪酸合成,相反氮源的限制可能使得更多的不飽和脂肪酸形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明當(dāng)?shù)春谋M時(shí)補(bǔ)糖不僅可以促進(jìn)油脂的產(chǎn)生,而且對(duì)DHA的形成也是有利的。

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Effect of oligosaccharide-adding fermentation and sugar-nitrogen metabolism onSchizochytriumlimacinumproducing oil

FU Jie1,LIN Yuan-Feng1,XIE Xin-lei1,TIAN Hua1,CHEN Tao2,HE Dong-ping1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Wuhan Institute of Virus,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

In order to explore the requirement of sugar and nitrogen sources in the vegetative growth and oil production of limacinumSchizochytriummutant strain,this study determined the change of carbon source and nitrogen source at different fermention stages,and the experimental groups oligosaccharide-adding were set up at five different periods,and the biomass and oil production of each group were measured.The research showed that the first 96 h was the important period of the limacinumSchizochytriumgrowth,and the biomass increased rapidly.When it was fermented for 144～168 h,the oil yield reached at the maximum value.The total biomass,lipid production,DHA content and DHA production were comprehensively measured after fermenting for 7 d.The result showed that it was the optimal time to adding oligosaccharide when fermented for 120 h,and the yield of oil and DHA were increased by 18.80% and 22.44% compared with the control group.When the nitrogen source was depleted,oligosaccharide supplement can not only promote the production of oil,but also benefit the formation of DHA.

Schizochytriumlimacinummutant strain;nutrient metabolism;oligosaccharide supplement fermentation

2015-10-16

付杰(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:微生物油脂，E-mail：2683802254@qq.com。

何東平(1957-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白，E-mail：hedp123456@163.com。

國家糧食局糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201313012-03)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.026