肥胖對外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因表達的影響

張苗苗 仝其廣 毛雯 吳迪

臨床研究

肥胖對外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因表達的影響

張苗苗 仝其廣 毛雯 吳迪

目的 研究肥胖者外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因表達的情況。方法 采用實時熒光定量PCR方法，測定肥胖組和對照組外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因ABCA1、ABCG1和ApoA1 mRNA表達水平。結果 肥胖組ABCG1mRNA表達水平較對照組顯著降低（0.536±0.271比6.243±1.511，P<0.05）,ApoA1mRNA表達水平較對照組升高（0.385±0.188比 0.206±0.062，P<0.05）。單因素相關分析顯示，ABCG1mRNA表達與體重指數(shù)BMI呈負相關（r=-0.403，P=0.012）。多元線性回歸分析提示，ABCG1mRNA表達與體重指數(shù)BMI呈獨立相關性（β=-0.488，P=0.004）。結論 肥胖者外周血白細胞ABCG1mRNA表達下調，且ABCG1mRNA與體重指數(shù)BMI呈負相關，這可能是肥胖導致動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的機制之一。

肥胖； 體重指數(shù)； 膽固醇逆轉運基因； ATP結合盒轉運體G1

隨著生活水平的提高，肥胖患者越來越多。肥胖是導致動脈粥樣硬化包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危險因素之一。膽固醇逆轉運是機體拮抗動脈粥樣硬化的主要防御機制之一。機體通過膽固醇逆向轉運將外周細胞膽固醇轉運回到肝臟，促進其經膽道排泄，從而拮抗動脈粥樣硬化發(fā)生[1,2]。膽固醇逆轉運是機體排除過多膽固醇的唯一途徑，受到人們的關注。ATP結合盒轉運體A1（ATP binding cassettetransporter A1，ABCA1）和 ATP 結合盒轉運體 G1（ATP binding cassette transporter G1，ABCG1）是一類膜蛋白，它們通過相互獨立的機制參與膽固醇逆轉運，避免外周細胞膽固醇嚴重沉積[3,4]，因此成為研究抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的重要靶點。那么，肥胖者外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因表達情況如何，目前尚無相關報道。本研究旨在探討肥胖對外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因表達的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2013年3～5月在煤炭總醫(yī)院心內科就診或住院肥胖患者18例，其中男性10例、女性 8例，平均年齡（64.33±11.89）歲；對照組（BMI<25 kg/m2）20例，其中男性11例、女性9例，平均年齡（65.80±12.08）歲。體重指數(shù)（BMI，body mass index）=體重（kg）/身高（m）2。肥胖診斷標準：符合2000年《亞太區(qū)肥胖的重新定義和處理》指導性手冊的肥胖標準[5]，即BMI≥25 kg/m2。排除糖尿病、急性冠脈綜合征、腦卒中、入院前1個月內服用他汀或其他降脂藥物、心力衰竭、嚴重肝腎功能損害、血液病、甲狀腺疾病、腫瘤及絕經后婦女用激素替代治療。患者均知曉本試驗并簽署同意協(xié)議。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學指標測定 清晨取空腹12 h以上靜脈血，分離血清，測定血脂、血糖、血清肌酐、尿素氮和肝功能等生化指標，均由貝克曼AU2700全自動生化分析儀自動檢測。試劑由日本第一化學藥品株式會社、北京中生北控有限公司和德賽公司提供。

1.2.2 外周血白細胞 ABCA1、ABCG1和 ApoAI mRNA表達測定RNA提取 清晨取空腹靜脈血2 ml置入EDTA抗凝管內，1500 rpm離心12 min，棄去血漿，分離出血細胞，加入RNA保存液中，-80℃冰箱保存，1周內按照試劑盒說明書提取外周血白細胞RNA。檢測所有標本RNA純度、濃度和完整性?；虮磉_：白細胞總RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄體系（20 μl體 系）：RNA 3 μl，5×Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，Oligo（dT）1 μl，逆轉錄酶 0.5 μl，DEPC H2O 10.5 μl。逆轉錄程序：42 ℃保溫 60 min。95 ℃5 min，4℃ 5min，迅速放入-20℃長期凍存。熒光定量PCR反應體系為25 μl含：基因組cDNA 2 μl，上游和下游引物分別為5 pmol，dNTPmix 5 nmol，Taq酶1 U，Taq酶緩沖液2.5 μl及滅菌去離子水適量，應用自動循環(huán)儀進行擴增。擴增條件為：預變性94℃ 5 min。反應循環(huán)為：變性 94℃ 30 s、退火61℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，循環(huán) 35次；最后72℃延伸10 min?；騧RNA表達以 β-actin標化。βactin 上游引物：5′-TCCTTCT GCATCCTGTCGGCA-3′，下游引物：5′-CAA GAGATGGCCACGGCTGCT-3′。ApoA1 基因上游引物：5′-CCGCCGTTCTCCTTGAGAG-3′， 下 游 引 物 ：5′-AGAAGAAGT GGCAGGAGGAGATG-3′。ABCA1基因上游引物：5′-GGCT GTGTCTCGTATTGTCTG-3′，下游引物：5′-CCTTGTGGCTGGAGTGTCA-3′。ABCG1 上游引物：5′-AGAAAGACTTTG AAAGAGTT-3′，下游 引物：5′-GGTAAATCACATACTTTGTT-3′。RNA 提取和引物合成以及熒光定量PCR均由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司負責完成。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，正態(tài)分布數(shù)據兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布數(shù)據采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料應用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。參數(shù)間相關分析采用Pearson相關分析，線性回歸用于參數(shù)獨立相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較 研究選擇肥胖者18例，對照組20例。兩組基礎資料比較顯示，肥胖組飲酒比例明顯高于對照組（P＜0.05），兩組之間其他基線資料如年齡、性別、高血壓、冠心病與吸煙比例基本平衡。見表1。

2.2 肥胖組與對照組臨床生化指標比較 與對照組相比，肥胖組 ApoB 明顯升高［（1.00±0.35）g/L比（0.76±0.31）g/L，P＜0.05］，丙氨酸轉氨酶（ALT）及空腹血糖（BS）也明顯升高［（26.39±13.92）U/L 比（16.00±10.88）U/L，（6.48±1.70）mmol/L 比 （5.54±0.85）mmol/L，P＜0.05］。其他生化指標兩組間未見統(tǒng)計學差異。見表2。

2.3 肥胖對外周血白細胞膽固醇逆轉運基因mRNA表達的影響 ABCA1基因mRNA表達水平在肥胖組與對照組之間無明顯差異（1.264±0.549比 0.245±0.0783，P>0.05）；與對照組相比，肥胖組ABCG1基因mRNA表達明顯降低（6.243±1.511比0.536±0.271，P＜0.05），ApoA1mRNA 表達水平升高（0.206±0.062 比 0.385±0.188，P＜0.05）。

2.4 肥胖患者膽固醇逆轉運基因mRNA表達相關性分析 單因素相關分析顯示，ABCG1 mRNA表達與 BMI呈負相關（r=-0.403，P=0.012），APOA1 mRNA表達與 BMI呈正相關（r=0.38，P=0.019），ABCA1表達與BMI無明顯相關性（r=0.275，P=0.095）。多元線性回歸分析提示，ABCG1 mRNA表達與 BMI呈獨立相關性 （β=-0.488，P=0.004），APOA1 mRNA表達與 BMI無獨立相關性（β=0.041，P=0.104）。

3 討論

膽固醇逆轉運是將外周細胞膽固醇轉運到載脂蛋白 A-I（apolipoprotein A-I，ApoA-I）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）上，并將膽固醇轉移至肝膽管，經肝膽管流入腸道，最后隨糞便排出體外[1,2]。膽固醇逆轉運對維持生物體膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)有著重大意義，也是目前認為機體對抗動脈粥樣硬化發(fā)生的主要機制之一。ABCA1和ABCG1是ATP結合盒轉運體（ATP bindingcassette transporter，ABC）超家族中的一員，通過消耗ATP介導蛋白質、膽固醇、磷脂等多種物質的跨膜轉運。在膽固醇逆轉運中，ABCA1主要負責促進膽固醇從細胞流出到載脂蛋白A-I，ABCG1主要負責促進膽固醇流出到成熟高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）上，同時兩者也存在相互作用從而聯(lián)合促進膽固醇逆轉運[6]。

表1 肥胖組與對照組一般臨床資料比較（±s）

表1 肥胖組與對照組一般臨床資料比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05

組別 例數(shù) 年齡（歲） 男/女 飲酒（%） 高血壓（%） 冠心?。?） 吸煙（%）對照組 20 64.33±11.89 10/8 0.0 55.6 83.3 44.4肥胖組 18 65.80±12.08 11/9 30.0a55.0 55.0 30.0

表2 肥胖組與對照組生化指標比較（±s）

表2 肥胖組與對照組生化指標比較（±s）

注：TC：膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；ApoA1:載脂蛋白 A1；ApoB：載脂蛋白 B；Lpa：脂蛋白 a；ALT：丙氨酸轉氨酶；BS：空腹血糖；BUN：尿素氮；Cr：肌酐。與對照組比較，aP<0.05

組別 例數(shù) TC（mmol/L）Cr（μmol/L）對照組 20 4.34±2.10 1.03±0.68 1.20±0.32 2.07±0.79 1.12±0.29 0.76±0.31 178.18±98.63 16.00±10.88 5.54±0.85 5.95±1.66 78.39±30.94肥胖組 18 3.88±1.19 1.91±2.10 1.02±0.26 2.39±0.74 1.06±0.28 1.00±0.35a303.28±195.30 26.39±13.92a6.48±1.70a5.37±2.35 68.89±16.88 TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）ApoA1（g/L）ApoB（g/L）Lpa（g/L）ALT（U/L）BS（mmol/L）BUN（mmol/L）

對ABCG1轉基因鼠，靶向阻斷ABCG1導致中性脂質在肝臟、肺、外周組織巨噬細胞的聚積，而ABCG1轉基因動物則不產生高脂飲食引起的脂質聚積[4]。由此可見，ABCG1通過參與膽固醇代謝平衡的調節(jié)，減少外周細胞膽固醇嚴重沉積，進而阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。該基因的正常表達降低，膽固醇過多積聚于血管壁的巨噬細胞會促使泡沫細胞形成，從而導致動脈粥樣硬化形成。本研究中肥胖患者外周血白細胞ABCG1 mRNA表達下調，提示可能通過抑制膽固醇的逆轉運導致外周細胞膽固醇沉積，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。

那么，引起ABCG1 mRNA下調的具體機制如何呢?黃嘌呤氧化還原酶（Xanthine oxidoreductase,XOR）是人體內尿酸生成的限速酶，通過將嘌呤分解為尿酸，控制著人體內嘌呤的代謝。肥胖小鼠脂肪組織中XOR mRNA的濃度均增加[7]，XOR還通過調節(jié)尿酸代謝在肥胖的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[8]；敲除XOR基因后J774.1細胞ABCG1表達增加，而XOR過表達會抑制ABCG1的表達，促進巨噬細胞源性泡沫細胞的形成[9]。因此提示肥胖可能通過XOR過表達抑制ABCG1 mRNA的表達，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是由脂肪組織產生的脂肪細胞因子，具有改善胰島素抵抗、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[10]。提高APN的水平能夠明顯增加動脈壁中膽固醇流出基因ABCG1的表達，有效促進膽固醇逆轉運[11]。APN介導的PPARα激活可以誘導LXR的靶基因ABCG1的激活[11]。皮下和內臟脂肪組織中的APN水平與肥胖呈負相關[12]。提示肥胖患者的APN水平降低，可能抑制ABCG1的表達。此外，血尿酸水平與體重指數(shù)呈正相關[13]。肥胖患者尿酸升高亦可能降低APN mRNA水平，伴隨著APN的生成下降。因此推測肥胖者ABCG1表達下降可能與APN水平下降有關。高血糖可抑制人巨噬細胞ABCG1蛋白表達[14]。本研究肥胖組血糖水平較對照組升高，提示此可能與高血糖有關。此外，代謝綜合征的代謝產物能通過抑制ABCG1的膽固醇逆向轉運功能促進動脈粥樣硬化的形成[14]。肥胖屬于代謝綜合征諸多癥候群的一種，其代謝產物亦有可能通過抑制ABCG1的表達參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者外周血白細胞ApoA1 mRNA表達較對照組升高，而血清HDL-C和ApoA1兩組間無明顯差異，提示外周血白細胞ApoA1 mRNA基因表達并沒有影響抗動脈粥樣硬化脂蛋白的血清水平。ApoA1是HDL的主要載脂蛋白，血清ApoA1可反映HDL水平，與HDL-C呈明顯正相關；ApoA1濃度與CHD發(fā)生危險性呈負相關。ApoA1主要來源于兩個方面[15]：由肝細胞和小腸上皮細胞合成與分泌，也可由成熟HDL分解代謝而來，并在轉錄和轉錄后水平進行調節(jié)。肝細胞ABCA1等基因表達對血清HDL-C水平具有決定性作用，而不受外周血細胞基因表達的影響[16,17]。所以，外周血白細胞ApoA1 mRNA基因表達并未影響血清HDL-C和ApoA1水平。

正常情況下，每一個 LDL、IDL、VLDL 和 Lp（a）顆粒中均含有一分子ApoB，因LDL顆粒占絕大多數(shù)，大約90%的ApoB分布在LDL中。血清ApoB主要反映LDL水平，它與血清LDL-C水平呈明顯正相關，而總ApoB含量反映了可能的致動脈粥樣硬化脂蛋白的總量。本研究肥胖患者血清ApoB升高，而LDL-C濃度并未升高，提示血液中存在較多小而致密的LDL。ApoB與各項心血管危險因素均顯著相關[18]，血清ApoB濃度升高與CHD發(fā)生危險性呈明顯正相關[19,20]，提示肥胖患者ApoB升高，可能與其發(fā)生冠心病的風險增高有關。此外，本研究中肥胖組丙氨酸轉氨酶升高，可能與肥胖引起肝臟脂肪沉積產生肝毒性脂肪酸有關[21]。

肥胖是動脈粥樣硬化的危險因素之一。本研究中肥胖患者膽固醇逆轉錄基因ABCG1 mRNA表達下調，提示膽固醇逆轉運降低，推測此可能為肥胖患者細胞內膽固醇聚集，發(fā)生動脈粥樣硬化的機制之一；同時肥胖患者血糖升高及血清ApoB升高，亦可能參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展。但具體調節(jié)機制尚需進一步研究。

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Effects of obesity on the expression of reverse cholesterol transport genes in peripheral blood leukocytes

ZHANG Miao-miao，TONG Qi-guang，MAO Wen，et al.Cardiovascular Department，China Meitan General Hospital，Beijing 100028，China

Objective To study the expressions of reverse cholesterol transport genes in peripheral blood leukocytes in obese patients.Methods The expressions of peripheral blood leukocytes ATP binding cassette transporter A1（ABCA1），ATP binding cassette transporter G1（ABCG1） and apolipoprotein A1（ApoA1） mRNA in obesity group and control group were measured by real-time quantitative PCR（RT-PCR）．Results Compared with control group，ABCG1 mRNA expression decreased （0.536±0.271 vs 6.243±1.511，P<0.05） and ApoA1 mRNA expression increased （0.385±0.188 vs 0.206±0.062，P<0.05）in obesity group.Single factor correlation analysis showed that the expression of ABCG1 mRNA was negatively correlated with body mass index（BMI）（r=-0.403，P=0.012）.Using multivariant linear regression analysis method，it was shown that the expression of ABCG1 mRNA was dependently associated with obesity （β=-0.488，P=0.004）.Conclusion The expression of ABCG1 mRNA in peripheral blood leukocytes was decreased in obesity group and was negatively correlated with BMI，which may be one of the mechanisms that obesity results in atherosclerosis.

Obesity； BMI； Reverse cholesterol transport genes； ATP binding cassette transporter G1

100028 北京市，煤炭總醫(yī)院心血管內科

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．06．007

R541.4

A

1672-5301（2016）06-0507-05

2016-01-28）