高效液相色譜法測定葡萄皮、籽中的15種單體酚

史紅梅,王恒振,孫玉霞,王詠梅,周　攀

(1.山東省葡萄研究院,山東濟南 250100;2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟南 250100;3.煙臺張?？ㄋ固鼐魄f有限公司,山東煙臺 264000)

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高效液相色譜法測定葡萄皮、籽中的15種單體酚

史紅梅1,王恒振2,*,孫玉霞2,王詠梅1,周攀3

(1.山東省葡萄研究院,山東濟南 250100;2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟南 250100;3.煙臺張?？ㄋ固鼐魄f有限公司,山東煙臺 264000)

建立了葡萄皮、籽中15種單體酚的高效液相色譜(HPLC)分析方法,采用ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,柱溫30 ℃,流動相乙腈-甲酸水(2∶98 V/V)溶液,梯度洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min,檢測波長280 nm。15種單體酚在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系,相關系數(shù)為0.9980～0.9999。方法檢出限0.01～0.10 mg/L,加標回收率均大于85%。本方法快速、準確、靈敏度高,可用于葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚的測定。

高效液相色譜,葡萄籽,葡萄皮,單體酚

多酚(Polyphenolics)是指分子結(jié)構(gòu)中攜帶多個酚羥基的一大類植物次生代謝產(chǎn)物[1],主要有酚酸類(Phenolic acids)、黃酮(Flavones)、黃烷醇(Flavanols)、黃酮醇(Flavonols)、花色苷(Anthocyanins)、原花色素(Proanthocyanidins)、水解單寧(Hydrolysable tannins)等[2-6]。多酚類物質(zhì)是釀酒葡萄中的一類重要物質(zhì),直接影響葡萄酒的感官品質(zhì)如苦味、澀味、收斂性及風味等[7],而且具有極強的抗氧化性,具有廣泛的生理功能,如清除自由基、抗發(fā)炎、抗血栓等[8]。研究表明,葡萄果實中多酚主要分布在果皮、種子和果梗中,果肉也存在一定量的多酚物質(zhì)。果皮中含有酚酸、白藜蘆醇、花色苷、黃酮醇、黃烷-3-醇等結(jié)構(gòu)簡單的多酚[9-10],還含有原花色素等結(jié)構(gòu)復雜的多酚,如花色苷和芳香物質(zhì)[11]。種子中多酚主要是黃烷醇類多酚[12],也有大量原花色素[13],還有沒食子酸[9,12]、咖啡酸[14]等多酚類物質(zhì);果肉中的酚類物質(zhì)主要是酚酸類。

近幾年國內(nèi)外對葡萄酒和葡萄中的酚類物質(zhì)單體酚含量的測定研究逐漸增多,如韓國民等建立了葡萄酒中14種單體酚的HPLC測定方法[15],陳建業(yè)等建立葡萄酒中11種酚酸含量的測定方法[3],王美麗等測定了葡萄中6種單體酚的含量[16]。目前還未見采用一個方法分別測定葡萄皮和葡萄籽中15種單體酚含量的研究,本次實驗通過高壓液相色譜法測定葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚的方法,測定了蓬萊產(chǎn)區(qū)三個主要紅色品種中葡萄皮和葡萄籽中酚類物質(zhì)的含量,比較近三年葡萄中酚類物質(zhì)的變化情況。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄品種為赤霞珠、品麗珠、小味兒多由蓬萊產(chǎn)區(qū)各大葡萄酒廠的葡萄園提供；乙腈、甲醇(均為色譜純)由美國Honeywell公司生產(chǎn);甲酸為分析純;實驗用水為超純水；咖啡酸(Caffeic acid)、香豆酸(p-Coumaric acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、沒食子酸(Gallic acid)、香草酸(Vanillic acid)、水楊酸(Salicylic acid)、堪非醇(Kaemferol)、楊梅黃酮(Myricetin)、兒茶素沒食子酸酯((-)-epicatechin gallate,ECG)、表棓兒茶素沒食子酸酯((-)-epgallocatechin gallate,EGCG)、表兒茶素((-)-epicatechin,EC),均由美國Flulca公司生產(chǎn);白藜蘆醇(Resveratrol),由西安交大保賽生物技術股份有限公司生產(chǎn);蘆丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin),均由中國藥品生物制品鑒定所生產(chǎn);兒茶素((+)-catechin, CAT)由上海順勃生物工程技術有限公司生產(chǎn)。

Agilent 1200液相色譜儀美國安捷倫公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;SHZ-A水浴恒溫振蕩器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;ML 204/02梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TDL-5臺式低速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預處理參照B.Girard等的方法[17],稍作修改。取-20 ℃冷凍的葡萄,將皮、籽、肉分開,將皮和籽用液氮研磨,研磨后置于冰箱(-18～-20 ℃)備用。取凍干研磨后的葡萄樣品1.000 g于10倍體積的提取液(丙酮∶水∶甲酸=80∶19∶1)中。每個葡萄樣品的皮、籽各取三個平行進行提取,記錄每個平行稱取樣品的實際質(zhì)量。將提取體系水浴(水浴溫度45.0±0.5 ℃)震蕩30 min后,離心(8000×g,20 min,4 ℃)取上清。將皮和籽的提取液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45.0± 1.0 ℃)蒸干,再用2 mL色譜級甲醇重溶置于5 mL棕色樣品瓶中,存放于-20 ℃避光保存待分析。測定樣品前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2檢驗波長的選擇用紫外分光光度計對沒食子酸、兒茶素等15種單體酚標準樣品溶液在波長200～400 nm區(qū)間內(nèi)掃描。15種單體酚紫外吸收光譜圖顯示,其組分最大吸收峰均在280 nm處有最大吸收峰,故選擇280 nm為檢測波長。

1.2.3流動相條件的確定根據(jù)成宇峰[18]的研究,本實驗選取流動相A:甲酸-水(2∶98,V/V),流動相B:乙腈,設計了10個不同濃度的洗脫實驗,其中分離效果較好的兩個梯度是:I.0～5 min,B相為2%～8%;5～8 min,B相為8%～15%;8～12 min,B相為15%～25%;12～17 min,B相為25%～35%;17～30 min,B相為35%～45%;30～40 min,B相為50%～50%,液相色譜圖如圖1a;流動相II. 0～7 min,B相為5%～10%;7～10 min,B相為10%～20%;10～15 min,B相為20%～30%;15～20 min,B相為30%～40%;20～30 min,B相為40%～50%;30～40 min,B相為50%～50%,液相色譜圖如圖1b。

1.2.4色譜條件Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),紫外檢驗波長為280 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,以峰面積外標法定量。梯度洗脫:流動相A:甲酸-水(2∶98,V/V),流動相B:乙腈,流速為1.0 mL/min。洗脫程序:0～7 min,B相為5%～10%;7～10 min,B相為10%～20%;10～15 min,B相為20%～30%;15～20 min,B相為30%～40%;20～30 min,B相為40%～50%;30～40 min,B相為50%～50%。

1.2.5標準品的配制用萬分子一天平分別準確稱取咖啡酸等15個單體酚標準品1～10 mg移至10 mL的棕色容量瓶中,色譜級甲醇定容,作為混合標準母液,將此標準液稀釋成不同濃度的標準溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2　結(jié)果與分析

2.1標準曲線的制備

分別配制10～100 mg/L 5個不同質(zhì)量濃度的15種單體酚混合標準溶液,進樣10 μL,按照上述確定的色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標、標準品濃度為橫坐標,計算得到15條標準曲線。將單體酚標準品用色譜級甲醇不斷稀釋至譜圖中信噪比為3,以此質(zhì)量濃度為單體酚的最低檢測限。結(jié)果表明15種多酚物質(zhì)的濃度和檢測響應值呈現(xiàn)出良好的線性關系,相關系數(shù)不小于0.9980,最低檢測限都較低,表明此方法靈敏度較高、準確度高、可行性好。結(jié)果見表1。

2.2流動相條件確定

按照1.2.3設定的條件15種標準品的色譜圖如圖1所示。

表1　15種酚類物質(zhì)的回歸方程及相關參數(shù)(n=5)

圖1　采用流動相Ⅰ和Ⅱ下15種單體酚類液相色譜圖a和bFig.1　Chromatogram of 15 mono-phonels standardsunder the first and second gradient program注:1.沒食子酸,2.CAT,3.EC,4.EGCG,5.咖啡酸,6.香草酸,7.蘆丁,8.ECG,9.香豆酸,10.阿魏酸,11.楊梅黃酮,12.白藜蘆醇,13.水楊酸,14.槲皮素,15.堪非醇。

在梯度II條件下葡萄籽和葡萄皮樣品的液相色譜圖如圖2和圖3所示,從圖中可以看出兩種樣品在這一洗脫條件下15種單體酚類能夠有效的分離,可以作為測定這兩種樣品的洗脫條件。

圖2　葡萄籽樣品液相色譜圖Fig.2　Chromatogram of grape seeds

圖3　葡萄皮樣品液相色譜圖Fig.3　Chromatogram of grape skin

2.3回收率和相對標準偏差

將已知15種單體酚濃度的葡萄皮、籽樣品分別添加各標準品的混合標準溶液,按照1.2.1制備葡萄樣品(n=5)。吸取10 μL進樣,根據(jù)所測樣品中的15種單體酚的含量計算相應的精確度和回收率,結(jié)果見表2。從表2中可以看出,樣品回收率均大于85%,相對偏差也較低(在3%以內(nèi)),方法精密度高,符合高壓液相色譜測定要求。

2.4葡萄樣品的測定

根據(jù)前述色譜條件,對蓬萊產(chǎn)區(qū)赤霞珠、小味兒多、品麗珠三個品種的葡萄樣品葡萄皮和葡萄籽中的15種單體酚含量進行測定,結(jié)果見表3、表4。

從表3可以看出,三個葡萄品種的葡萄籽中共檢測出12～15種單體酚,主要酚類是黃烷醇類,這與文獻[12]報道的相吻合。在黃烷醇類中,CAT是主要成分,其次是EC,這與溫鵬飛[2]等檢測結(jié)果也相吻合。種子中其它成分如蘆丁、阿魏酸、香草酸等含量也較高,咖啡酸、沒食子酸、槲皮素、ECG、EGCG、白藜蘆醇等也有檢出。

葡萄籽中單體酚含量與葡萄品種和年份有關[11],從檢測的三個品種中可以看出:小味兒多>赤霞珠>品麗珠,從年份來看2014>2013>2012,這與這三年的氣候條件相符合。2012年7月下旬、8月份、9月上中旬雨水較集中,陰雨天較多;2013年雨水集中在6月、7月,8、9、10月份較少;2014年和2013年類似,但10月份收獲季節(jié)下了些雨,因此果實品質(zhì)是2014>2013>2012。

表2　樣品和標樣加標回收率及相對標準偏差(n=5)

注:/表示未檢測出。

表3　蓬萊產(chǎn)區(qū)葡萄籽中15種單體酚的含量和均值(mg/100 g(干重))(n=3)

注:/表示未檢測出。

表4　蓬萊產(chǎn)區(qū)葡萄皮中15種單體酚的含量和均值(mg/100 g(干重))(n=3)

紅色品種葡萄皮的主要多酚是花色苷,本方法是測定除花色苷外其它種類的酚類物質(zhì)。從表4中可以看出,黃烷醇類是葡萄果皮的重要多酚之一,在這三個葡萄品種中都存在黃烷-3-醇單體及聚合體,其中EC和CAT是主要的單體,也有少量的ECG和EGCG。另外,在葡萄皮中酚酸類(咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、香草酸等)、白藜蘆醇、黃酮類(楊梅黃酮、蘆丁、槲皮素等)等多酚也被檢測出。從品種看,葡萄皮中單體酚含量最高的是小味兒多,其次是赤霞珠,然后是品麗珠。從年份看,三個品種都是以2014年單體酚含量最高。

3　結(jié)論與討論

本文建立一種新的同時測定葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚含量的HPLC方法。通過對流動相的選擇和優(yōu)化,在選定的液譜條件下,15種酚類物質(zhì)在30 min內(nèi)得到了很好地分離,且回收率均在85%以上,最低檢測限也較低。該方法簡單、實用,且準確度、靈敏度較高,重復性好。

針對3個葡萄品種連續(xù)三年對葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚進行測定,通過比對本次實驗結(jié)果與文獻報道結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),本次實驗數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)相吻合,進一步說明本實驗方法能夠?qū)ζ咸哑ず推咸炎阎械?5種酚類進行檢測。在本方法對葡萄籽中酚類物質(zhì)測定時發(fā)現(xiàn),基線有點飄移,說明在前處理時有些雜質(zhì)尚未被去除,在今后的工作中可以繼續(xù)探索更有效的前處理方法。另外,本次實驗只選取幾種代表性的單體酚類,不能了解其他酚類的含量,為了更全面的測定葡萄中單體酚的含量,在今后工作中可以根據(jù)多酚類別有分步測定。

[1]Lu Y,Yeap Foo L. Polyphenolics of Salvia:a review[J]. Phytochemistry,2002,59:117-140.

[2]溫鵬飛.葡萄與葡萄酒中黃烷醇類多酚和果實原花色素合成相關酶表達規(guī)律的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2005.

[3]陳建業(yè).葡萄酒中酚酸及葡萄果實苯丙烷類代謝途徑研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2005.

[4]Skerget M,Kotnik P,Hadolin M,et al. Phenols,proanthocyanidins,flavones and flavonols in some plant materials and their antioxidant activities[J]. Food Chemistry,2005,89:191-198.

[5]李景明.葡萄采收后白藜蘆醇的誘導與釀造工藝對葡萄酒中白藜蘆醇的影響[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2003.

[6]Hollman P C H,Arts I C W. Flavonols,flavones and flavanols:nature,occurrence and dietary burden[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2000,80:1081-1093.

[7]Garrido J,Borges F. Wine and grape polyphenols:a chemical perspective[J]. Food Research International,2011,doi:10.1016.

[8]Rasmussen S E,Frederiksen H,Krogholm K S,et al. Dietary proanthocyanidins:occurrence,dietary intake,bioavailability,and protection against cardiovascular disease[J]. Molecular Nutrition and Food Research,2005,49:21-40.

[9]Pinelo M,Arnous A,Meyer A S. Upgrading of grape skins:significance of plant cell-wall structural components and extraction techniques for phenol release[J]. Trends in Food Science & Technology,2006,17:579-590.

[10]姜壽梅,金贊敏,梁娜娜,等. 西拉葡萄果實成熟過程中果皮內(nèi)非花色苷酚類物質(zhì)的變化[J].中外葡萄與葡萄酒,2008,6:20-24.

[11]李華,王華,袁春龍,等.葡萄酒工藝學[M].北京:科學出版社,2007:24-30.

[12]Rodrigo R,Miranda A,Vergara L. Modulation of endogenous antioxidant system by wine polyphenols in human disease[J]. Clinica Chimica Acta,2011,412:410-424.

[13]Kennedy J A,Troup G J,Pilbrow J R,et al. Development of seed polyphenols in berries from Vitis vinifera L. cv. Shiraz[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research,2000,6:244-254.

[14]Souquet J M,Labarbe B,Le Guernevé C,et al. Phenolic composition of grape stems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48:1076-1080.

[15]韓國民,陳鋒,侯敏,等.葡萄酒中14種單體酚的高壓液相色譜測定[J].食品科學,2011,32(2):180-183.

[16]王美麗,張振文,張予林. HPLC測定釀酒葡萄中單體酚的方法研究[J].釀酒科技,2006(6):91-93.

[17]B. Girard,L. Fukumoto,G. Mazza,et al. Volatile Terpene Constituents in Maturing Gewürztraminer Grapes from British Columbia[J]. Am. J. Enol. Vitic,2002,53(2):99-109.

[18]成宇峰,張振文,岳泰新,等. HPLC同時檢測葡萄酒中10種單體酚的方法[J].食品科學,2008,29(4):287-290.

Determination of 15 mono-phenols in grape skin and seeds by high performance liquid chromatography

SHI Hong-mei1,WANG Heng-zhen2,*,SUN Yu-xia2,WANG Yong-mei1,ZHOU Pan3

(1.Shandong Academy of Grape,Ji’nan 250100,China;2.Institute of Agro-food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences(SAAS),Ji’nan 250100,China;3. Chateau changyu castel co.,LTD.Yantai,Yantai 264000,China)

A high performance liquid chromatograohic(HPLC)method was established for the determination of 15 mono-phenols in grape skin and grape seeds. The ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used as chromatographic column with column temperature of 30 ℃. Acetonitrile and formic acid aqueous solution was used as the mobile phase by gradient elution with a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm. A good linearity was obtained for 15 mono-phenols in the range of 0.01～0.10 mg/L. The correlation coefficients were in range of 0.9980～0.9999. The recoveries of standard samples were in the range of 93.25%～109.12%. The method was rapid,simple and high senstivity and was suitable for the determination of 15 mono-phenols in grape skin and grape seeds.

HPLC;grape seeds;grape skin;mono-phenols

2015-11-16

史紅梅(1979-)，女，碩士，高級工程師，研究方向：葡萄酒釀造新工藝及風味物質(zhì)的分析測定,E-mail:hm.sh@163.com。

王恒振(1978-)，男，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：葡萄栽培技術及風土條件和微域環(huán)境對葡萄品質(zhì)的影響,E-mail:chinajinan@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2016)11-0318-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.057