不同脅迫條件對(duì)魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響研究

胡夢(mèng)蝶,陳　雄,李　欣,王　志,代　俊,黃　珍,劉翠翠

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

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不同脅迫條件對(duì)魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響研究

胡夢(mèng)蝶,陳雄*,李欣,王志,代俊,黃珍,劉翠翠

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

為了積累魯氏醬油酵母胞內(nèi)海藻糖的含量,提高活性干酵母制作過(guò)程中的存活率。本文主要探討了滲透壓(NaCl)、溫度、乙醇和氧化(H2O2)條件下魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖的積累規(guī)律。實(shí)驗(yàn)表明,滲透壓脅迫對(duì)海藻糖積累沒(méi)有明顯的作用,高濃度NaCl脅迫時(shí)海藻糖含量反而降低;添加乙醇和升高溫度有利于海藻糖的積累:2%(v/v)乙醇添加9 h后海藻糖的含量達(dá)到22.32 mg/gDw,相比對(duì)照20.46 mg/gDw提高了9.09%;溫度升高6 h后海藻糖含量從17.55 mg/gDw升至24.41 mg/gDw,提高了39.14%;在氧化脅迫初期,H2O2可明顯提高魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖的含量,0.2%(v/v)H2O2濃度下海藻糖含量為14.18 mg/gDw,比對(duì)照8.17 mg/gDw增加了73.56%,但是隨著氧化脅迫延長(zhǎng),最終海藻糖含量沒(méi)有明顯區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提高魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖含量從而制成耐儲(chǔ)藏活性干酵母具有一定指導(dǎo)意義。

魯氏酵母,海藻糖,滲透壓,溫度,乙醇,H2O2

魯氏酵母是一種耐高滲酵母,是醬油釀造中后期風(fēng)味物質(zhì)形成的重要菌株。在醬油釀造過(guò)程中,魯氏酵母能夠產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì),如乙醇、高級(jí)醇、異戊醇、異丁醇等芳香雜醇類(lèi)物質(zhì)[1]。目前我國(guó)醬油產(chǎn)量不斷增加,導(dǎo)致對(duì)醬油酵母的需求量也逐漸增大,醬油活性干酵母的應(yīng)用前景更加廣泛[2]。

海藻糖是一種非還原性的二糖,由葡萄糖以α,α-1,1糖苷鍵連接而成,廣泛存在于各種生物體內(nèi),在惡劣環(huán)境中能夠保護(hù)微生物細(xì)胞質(zhì)膜的完整性和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[3]。海藻糖含量與活性干酵母的存活率密切相關(guān)[4],是鑒定活性干酵母質(zhì)量和活性的一個(gè)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量為其干重的2%～3%時(shí),就會(huì)對(duì)保持壓榨鮮酵母細(xì)胞的活性起到重要的作用[5-6],胞內(nèi)海藻糖含量高(13.0%)的酵母,貯存前10 d內(nèi)發(fā)酵活力基本沒(méi)有變化;而胞內(nèi)海藻糖含量低(10.2%)的酵母,貯存4 d后發(fā)酵活力就開(kāi)始下降[7]。因此,細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量是鑒定活性干酵母質(zhì)量和活性的一個(gè)重要指標(biāo)。本文從滲透壓、溫度、乙醇、氧化脅迫方面比較全面地研究了魯氏酵母在YEPD培養(yǎng)基中胞內(nèi)海藻糖的積累情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為生產(chǎn)耐儲(chǔ)藏醬油活性干酵母提供一定的指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii):湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院分離保藏菌種,專(zhuān)利保藏號(hào)為:CCTCC M 2013310。

YEPD培養(yǎng)基:蛋白胨2%,酵母浸粉1%,葡萄糖2%(固體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂),pH5.95。

UV-722型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司:高壓滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠:DZF-6020電熱鼓風(fēng)干燥箱重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化及培養(yǎng)條件將實(shí)驗(yàn)室保藏的魯氏酵母CCTCC M 2013310接種一環(huán)至YEPD斜面活化,恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)2 d復(fù)蘇菌種。將活化好的斜面取一環(huán)接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基,30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h,獲得液體種子。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中接入5%的液體種子,于30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

1.2.2生物量的測(cè)定收集5 mL菌液離心(5000 r/min,10 min)去掉上清液,菌體稀釋后于波長(zhǎng)600 nm處以去離子水為對(duì)照進(jìn)行比色測(cè)定,光密度OD600nm=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)[8]。

1.2.3細(xì)胞干重的測(cè)定取干燥的10 mL離心管,記錄空管的質(zhì)量,取5 mL發(fā)酵液于管中,5000 r/min離心10 min,去上清液,洗滌2次后在80 ℃烘干至恒重,用電子天平稱(chēng)重[9]。

1.2.4海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定稱(chēng)取不同體積的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液定容于50 mL容量瓶中(內(nèi)含4 mL,0.5 mol/L三氯乙酸),吸取l mL試樣及空白樣(50 mL蒸餾水,內(nèi)含4 mL,0.5 mol/L三氯乙酸)于已烘干潔凈的試管中,加入5 mL硫酸-蒽酮溶液,震蕩均勻,在沸水中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,迅速冷卻到室溫,測(cè)定630 nm的吸光度,以空白為對(duì)照,海藻糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)[2]。

1.2.5酵母中胞內(nèi)海藻糖含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取用冰蒸餾水洗滌兩次的上述酵母泥約0.1 g于離心管中加入4 mL,0.5 mol/L三氯乙酸,震蕩均勻后置于帶有冰塊的冰水中每15 min震蕩一次,1 h后,2500～3000 r/min離心,將上清倒入盛有冰水的50 mL容量瓶中,再用冰水洗滌兩次,將上清倒入容量瓶中,然后再用冰水定容?？瞻讟訛楹? mL,0.5 mol/L三氯乙酸的冰水溶液。重復(fù)標(biāo)曲的測(cè)定方法計(jì)算海藻糖的含量[2]。

1.2.6條件脅迫方法滲透壓脅迫:在初始YEPD培養(yǎng)基中分別添加0%、1%、5%、9%的NaCl濃度培養(yǎng)至27 h。溫度脅迫:在YEPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至18 h時(shí),以30 ℃為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組分別提高溫度至35、40 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至27 h。乙醇脅迫:在YEPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至18 h時(shí),以不添加乙醇為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組分別添加體積比2%、4%、6%的乙醇繼續(xù)培養(yǎng)至27 h。H2O2脅迫:在YEPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至18 h時(shí),以不添加H2O2為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組分別添加體積比為0.1%、0.2%、0.3%的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)至27 h。所有培養(yǎng)過(guò)程均每隔3 h取樣檢測(cè)生物量和胞內(nèi)海藻糖含量。

2　結(jié)果與分析

2.1海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線為Y=0.2191X-0.0031,其中R2=0.9962,呈線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of trehalose

2.2滲透壓對(duì)魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響

滲透壓對(duì)魯氏酵母生長(zhǎng)和胞內(nèi)海藻糖的影響如圖2所示。隨著滲透壓的增加,魯氏酵母生物量會(huì)有小幅的降低,對(duì)應(yīng)海藻糖的含量也降低,在無(wú)NaCl脅迫時(shí)胞內(nèi)海藻糖含量達(dá)到15.83 mg/gDw,其他滲透脅迫條件下胞內(nèi)海藻糖含量大致在10.00 mg/gDw左右,并且隨鹽濃度增加而下降,分析原因可能是滲透脅迫下魯氏酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低,抑制外界葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞,在合成其他物質(zhì)(甘油)的同時(shí)減少合成海藻糖的原料。該結(jié)論與Yoshikawa S在對(duì)耐鹽魯氏酵母研究中的結(jié)果一致,即鹽脅迫表現(xiàn)為胞內(nèi)積累鈉離子脅迫和滲透壓脅迫,這2種初級(jí)脅迫產(chǎn)生活性氧(ROS)造成氧化損傷,此時(shí)耐鹽酵母細(xì)胞能夠積累更多的甘油來(lái)適應(yīng)外界的高滲環(huán)境[10]。

圖2　魯氏酵母在不同NaCl濃度脅迫下生物量和胞內(nèi)海藻糖的積累Fig.2　The accumulation of trehalose and biomass of Z. rouxii under different NaCl concentration

2.3溫度對(duì)魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響

溫度是影響海藻糖積累的重要因素,升溫有利于酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的積累[11]。在釀酒酵母中,海藻糖開(kāi)始積累的溫度為33～35 ℃[12]。Bell等應(yīng)用蛋白質(zhì)印記分析,證實(shí)了當(dāng)釀酒酵母的培養(yǎng)溫度從27 ℃上升到40 ℃時(shí),6-磷酸海藻糖合成酶(TPS1)基因產(chǎn)物增加[13]。圖3中可以看出30 ℃培養(yǎng)魯氏酵母,達(dá)到穩(wěn)定期時(shí),其生物量最大為26.21,而35 ℃和40 ℃培養(yǎng)時(shí),魯氏酵母生物量下降,40 ℃下生物量最低。胞內(nèi)海藻糖在35 ℃下刺激6 h時(shí)達(dá)到最大值24.41 mg/gDw,比對(duì)照17.55 mg/gDw提高了39.14%。因此,在魯氏酵母培養(yǎng)過(guò)程中,35 ℃比較有利于胞內(nèi)海藻糖的積累。

圖3　不同溫度脅迫下魯氏酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖的積累Fig.3　The accumulation of trehalose and biomass of Z. rouxii under different temperature

2.4乙醇對(duì)魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響

乙醇的積累會(huì)抑制微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活能力,影響各種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能[14]。高濃度的乙醇甚至破壞細(xì)胞膜的完整性,降低質(zhì)膜的流動(dòng)性和損害多種離子的滲透性,從而導(dǎo)致跨膜電勢(shì)的損耗,最終酸化細(xì)胞內(nèi)和液泡的環(huán)境[15-16]。圖4結(jié)果顯示在18～24 h內(nèi)添加乙醇組的生物量均高于對(duì)照組,并且隨著乙醇濃度的增加,生物量略有降低,在添加2%的乙醇濃度下,生物量最高,達(dá)到23.63。在24～27 h內(nèi),對(duì)照組和添加2%濃度乙醇組生物量仍然在上升,但是添加乙醇濃度為4%和6%的乙醇組生物量明顯下降。在18～27 h,2%乙醇組胞內(nèi)海藻糖積累量最多,在27 h時(shí)胞內(nèi)海藻糖含量達(dá)到22.32 mg/gDw,比對(duì)照提高了9.09%。

圖4　不同濃度乙醇脅迫下魯氏酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖的積累Fig.4　The accumulation of trehalose and biomass of Z. rouxii under different ethanol concentration

2.5H2O2對(duì)魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖積累的影響

過(guò)氧化氫(H2O2)是一種強(qiáng)氧化劑,外源添加H2O2可以直接作用于蛋白質(zhì)或者跨過(guò)細(xì)胞膜后進(jìn)一步與金屬離子反應(yīng)產(chǎn)生自由基,對(duì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)甚至DNA產(chǎn)生傷害。因此,限制外源H2O2向胞內(nèi)的擴(kuò)散是微生物細(xì)胞對(duì)自身的一種保護(hù),可以有效降低H2O2對(duì)微生物的氧化損傷[17]。圖5結(jié)果表明:添加H2O2后的3 h內(nèi)(18～21 h)生物量與對(duì)照組基本一致,但胞內(nèi)海藻糖量有明顯變化:在0.1%和0.2%的H2O2濃度下,海藻糖含量有一定的增加,在0.2%H2O2濃度下為14.18 mg/gDw,比對(duì)照(8.17 mg/gDW)增加73.56%。在H2O2脅迫6 h內(nèi)(21～24 h)時(shí),0.1%和0.2%的H2O2濃度下生物量與胞內(nèi)海藻糖含量與對(duì)照相比仍有一定的增加。在H2O2脅迫6～9 h(24～27 h),在不同H2O2濃度下,生物量與胞內(nèi)海藻糖含量與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異。因此,在氧化脅迫初期,H2O2可明顯提高魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖的含量。

圖5　不同H2O2濃度脅迫下魯氏酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖的積累Fig.5　The accumulation of trehalose and biomass of Z. rouxii under different H2O2concentration

3　結(jié)論

基于細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量是鑒定活性干酵母質(zhì)量和活性的一個(gè)重要指標(biāo),本文主要研究了NaCl滲透壓、溫度、乙醇和H2O2氧化脅迫條件下魯氏酵母在YEPD培養(yǎng)基中海藻糖的積累特性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:在YEPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在1%～9% NaCl濃度范圍內(nèi),隨著NaCl濃度的增加,胞內(nèi)海藻糖含量降低,鹽脅迫不利于魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖的積累;在YEPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,溫度提高到35 ℃刺激6 h,魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖的積累達(dá)到最大,在40 ℃培養(yǎng)下海藻糖含量低于在30 ℃時(shí)海藻糖的積累量,可能是過(guò)高溫度影響海藻糖合成酶的活性;在YEPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,2%濃度乙醇的添加會(huì)同時(shí)促進(jìn)魯氏酵母生物量的增加及胞內(nèi)海藻糖的積累;在YEPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在H2O2氧化壓力的短時(shí)脅迫下,0.2%濃度H2O2可明顯提高魯氏酵母胞內(nèi)海藻糖的含量。

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Intracellular trehalose metabolism characteristics ofZygosaccharomycesrouxiiunder different stresses

HU Meng-die,CHEN Xiong*,LI Xin,WANG Zhi,DAI Jun,HUANG Zhen,LIU Cui-cui

(Key Labortory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,College of Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Trehalose content and the resistance of yeast are positively correlated,the content of intracellular trehalose is an important index for assessing the quality and the activity of active dry yeast. The intracellular trehalose synthesis regulation ofZygosaccharomycesrouxiiunder osmotic pressure,temperature,ethanol and H2O2was discussed. The study showed that the osmotic pressure had no obvious effect on trehalose accumulation. Trehalose content was lower under high concentrations of NaCl stress,but adding ethanol and raising temperature were conducive to the accumulation of trehalose:trehalose content was increased by 9.09% from 20.46 mg/gDw to 22.32 mg/gDw at 9 h after ethanol added and trehalose content was increased by 39.14% from 17.55 mg/gDw to 24.41 mg/gDw at 6 h for heating. During the early period under H2O2stress,0.2% H2O2can enhance the accumulation of trehalose remarkablely. Compared with the control content of 8.17 mg/gDw,the trehalose was increased by 73.56% to the content of 14.18 mg/gDw. This result had certain guiding significance for soy sauce fermentation and improving soy sauce storage stability of active dry yeast.

Zygosaccharomycesrouxii;trehalose;osmotic pressure;temperature;ethanol;H2O2

2015-11-19

胡夢(mèng)蝶(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程,E-mail:13343401589@163.com。

陳雄(1969-)，男，博士，教授，研究方向：釀造工程，E-mail：cx163_qx@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0130-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.019