黃色和紫色百香果籽油抗氧化作用的對比研究

許曉靜,陶志華

(廣東工業(yè)大學(xué)食品與生物工程系,廣東廣州 510006)

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黃色和紫色百香果籽油抗氧化作用的對比研究

許曉靜,陶志華*

(廣東工業(yè)大學(xué)食品與生物工程系,廣東廣州 510006)

百香果籽油,抗氧化作用,對比分析

百香果(又名西番蓮),一種雙子葉植物,屬西番蓮科,來源于巴西。我國的臺灣、廣東、云南、廣西、福建、四川等地都有大量種植,主要有紫色百香果(P.edulisSimsvar.edulis)和黃色百香果(P.edulisSimsvar.flavicarpa)兩種品種[1]。百香果汁作為一種熱帶水果飲料,主要因?yàn)槠涓缓S生素、氨基酸和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)而受到喜愛?，F(xiàn)階段,我國每年約有4000多t百香果籽被廢棄或作為豬飼料,這造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。百香果果汁生產(chǎn)后的殘?jiān)伎偤康?6%,其中果籽殘?jiān)?6%[2-3]。這些副產(chǎn)物含有高濃度的生物活性成分,如維生素、礦物質(zhì)、糖類、多酚類等。百香果籽油中的多酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化作用,能有效地清除脂類自由基,如超氧陰離子自由基和DPPH自由基,并能預(yù)防脂質(zhì)過氧化,同時(shí)也起到抑制機(jī)體老化疾病的產(chǎn)生,如癌癥和心臟疾病[4-5]。對百香果加工副產(chǎn)物中的籽進(jìn)行開發(fā)利用,既可以提高百香果種植業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,又可以加強(qiáng)百香果的綜合利用,因此我們從兩種百香果籽油的抗氧化效果進(jìn)行分析,以便對百香果籽進(jìn)行篩選,進(jìn)一步對其開發(fā)利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紫色百香果和黃色百香果廣西壯族自治區(qū)玉林市;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼),BHT,亞油酸,TPTZ(Fe3+-三吡啶-三吖嗪),水楊酸,維生素E,蘆丁,β-胡蘿卜素,沒食子酸等試劑均為分析純。

DZF-6020型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海索普儀器有限公司;真空干燥箱上海一恒科技有限公司;KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司;500 mL索氏提取裝置北京海鵬翔精細(xì)化學(xué)品有限公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;Paradigm多標(biāo)記微孔板檢測儀廣州中科進(jìn)出口有限公司;UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;LC-20AT/SPD-M20高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1百香果籽油的制備在百香果中取新鮮籽粒,清理去雜,過夜晾干,于熱鼓風(fēng)干燥箱105 ℃下烘干至恒重。粉碎后用濾紙包扎,轉(zhuǎn)入索氏抽提筒中,用無水乙醚在45 ℃下抽提8 h。抽提完畢之后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在35 ℃下蒸發(fā)掉乙醚,置于真空干燥箱中,35 ℃干燥至恒重,得到百香果籽粗油。用離心機(jī)在6000 r/min下常溫離心15 min,分離得到上層清澈油脂。

1.2.2百香果籽油抗氧化物質(zhì)的測定

1.2.2.1黃酮含量測定配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.1～0.6 μg/mL,各自取1.0 mL的上述溶液于25 mL的容量瓶中,加入5% NaNO2溶液1 mL,充分搖勻,靜置6 min,然后加入10% Al(NO3)3溶液1 mL,充分搖勻,同樣靜置 6 min,最后再加4% NaOH溶液10 mL,用無水乙醇定容至刻度,充分搖勻,靜置15～20 min 后,于360 nm波長處測定吸光度A,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用無水乙醇配制0.5%(v/v)的樣品,按照上述方法測定,以不加油樣的溶液做空白對照,于360 nm波長測定吸光值。

1.2.2.2β-胡蘿卜素含量的測定制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:參照朱振寶等人[6]的方法,略有改動。用氯仿稀釋成0.4～2.4 μg/mLβ-胡蘿卜素溶液,于450 nm 下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品配制:用氯仿配制80 μg/mL的百香果籽油,以氯仿作為空白對照,在450 nm下測定其吸光度。

1.2.2.3總酚類化合物含量的測定參照Ferreira[7]和Silva[8]等人的方法,略有改動。用無水乙醇配成0～10 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,在765 nm下讀取吸光值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱量1.00 g 百香果籽油,加入3 mL的甲醇,超聲提取5 min,離心,并收集上清液,此過程再重復(fù)兩次,將三次上清液合并,用甲醇定容到溶液體積為10 mL。取0.1 mL的甲醇提取物到10 mL的容量瓶中,加入0.5 mL的福林―酚溶液,反應(yīng)3 min后加入1.5 mL的飽和碳酸鈉溶液,加水定容至10 mL,室溫下反應(yīng)2 h,以不加油樣的溶液做空白對照,在765 nm下讀取吸光值。

1.2.2.4維生素E含量的測定參照李柰[9]等人的方法,略有改動。檢測條件:島津LC-20AT高效液相色譜儀,具有二極管陣列檢測器SPD-M20A,色譜柱:Description Gemini 5u C18110A柱,總流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:20 μL,流動相:甲醇與水的體積比為98∶2,洗脫時(shí)間:30 min。以維生素E為標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制至濃度為15～90 μg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品在上述檢測條件下進(jìn)行全波長掃描,得到最佳吸收波長,在最佳吸收波長下測定不同濃度維生素E的峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱量1.00 g 百香果籽油,用甲醇為溶劑,料液比例為1∶1. 25(g/mL),超聲提取20 min,離心,取上層清液,以上步驟重復(fù)三次后合并上清液,定容至2 mL棕色容量瓶中,在上述檢測條件下測定其峰面積。

1.2.3百香果籽油抗氧化活性的測定

1.2.3.1總抗氧化能力的測定(FRAP)參考Martínez等人[10]的方法,略有改動。用異丙醇配制不同濃度的黃色和紫色百香果籽油溶液,以BHT和亞油酸作對照。四種樣品的終濃度為0.0～25.0 mg/mL。往96孔板中加150 μL TPTZ工作液,37 ℃下反應(yīng)30 min,采用酶標(biāo)儀測定其在593 nm處的吸光值,記為A反應(yīng)前。再加入20 μL樣液,反應(yīng)8 min后讀取吸光值,記為A反應(yīng)后。分別對3次平行的樣液進(jìn)行鐵還原能力的測定。將(A反應(yīng)前-A反應(yīng)后)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取提取物相應(yīng)的硫酸亞鐵濃度(mmol/L)定義為FRAP值。

1.2.3.2抑制DPPH自由基的能力參考Jairo等人[11]的方法,略有改動。用無水甲醇配制0.10 mmol/L DPPH溶液。百香果籽油和BHT,以及亞油酸用乙酸乙酯配制成濃度為0.1～25.0 mg/mL的溶液。根據(jù)式(1)加入不同濃度的樣品和試劑,于517 nm波長下測吸光度,重復(fù)3次,求平均值,計(jì)算DPPH·的清除率。以BHT和亞油酸為對照。根據(jù)下式計(jì)算清除率:

式(1)

注:A1:2 mL DPPH溶液+2 mL樣品液,A2:2 mL無水乙醇+2 mL樣品液,A3:2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶劑

1.2.3.3水楊酸法測定清除羥自由基的能力參考陶志華等人[12]的方法,略有改動。百香果籽油和BHT,以及亞油酸用異丙醇配制成濃度為0.1～25.0 mg/mL的溶液。取不同濃度的樣品溶液1 mL,依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸、1 mL 8.8 mmol/L H2O2,混勻,置37 ℃水浴中加熱30 min,以蒸餾水為參比在510 nm下測定樣品吸光度(Ai)。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行管,結(jié)果取平均值。以1 mL 9 mmol/L FeSO4,1 mL水楊酸與樣品溶液1 mL,加1 mL的水作為本底吸收(Aj)。以BHT和亞油酸作為對照樣,由式(2)計(jì)算清除率:

式(2)

注:A0為空白對照液的吸光度;Ai為加入樣品溶液后的吸光度;Aj為不加H2O2的樣品溶液本底的吸光度。

1.2.3.4鄰苯三酚法測定清除超氧陰離子自由基的能力參考Li[13]的方法,略有改動。百香果籽油和BHT,以及亞油酸用異丙醇配制成濃度為0.1～25.0 mg/mL的溶液。在96孔板中加入177 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液,25 ℃水浴保溫20 min,加入3μL3 mmol/L鄰苯三酚(已于25 ℃預(yù)熱),采用酶標(biāo)儀在325 nm下測定吸光值。每隔30 s讀數(shù)一次A值,至300 s為止。將所得數(shù)據(jù)繪圖,得一直線,此直線斜率為鄰苯三酚的自氧化速率K0。用Tris-HCl緩沖液作為空白參比,于96孔板中加入87 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液和90 μL不同濃度的待測液。再加入3 μL 3 mmol/L鄰苯三酚,采用酶標(biāo)儀每隔30 s測定其在325 nm處的吸光值。將所得數(shù)據(jù)繪圖,得一直線,此直線斜率為加入樣品溶液后的鄰苯三酚自氧化速率K,用Tris-HCl緩沖液作為空白參比。

式(3)

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9和Excel建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行作圖,并用spss22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,兩樣本之間采用t檢驗(yàn),顯著性差異p≤0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1百香果籽油的抗氧化物質(zhì)測定結(jié)果

從圖1～圖4可得,0.1～0.6 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在360 nm波長下,0.4～2.4 μg/mL的β-胡蘿卜素溶液在450 nm 下,0～10 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品在765 nm下,15～90 μg/mL維生素E(α-生育酚)在284 nm 下均有良好的線性關(guān)系。從圖5可知,維生素E在284 nm下有最大吸收。由表1可知，紫色百香果籽油的黃酮含量、β-胡蘿卜素含量和維生素E含量都高于黃色百香果籽油,而黃色百香果籽油的總酚含量達(dá)到16.69 mg GAE/kg,比紫色百香果籽油高。在兩種百香果籽油中,黃酮含量最高。黃色百香果籽油中黃酮含量達(dá)到44.86 μg/mL,紫色百香果籽油中黃酮含量達(dá)到45.75 μg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫色和黃色百香果籽油都含有多種抗氧化物物質(zhì),而且紫色百香果籽油的抗氧化物質(zhì)含量高于黃色百香果籽油。

圖1　黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of flavonoids

圖2　β-胡蘿卜素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of β-carotene

圖3　總酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3　Standard curve of total phenolics

圖4　維生素E含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of Vitamin E

圖5　維生素E的全波長掃描圖Fig.5　The UV-Vis spectrophotometry of Vitamin E

2.2百香果籽油的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1對鐵離子的還原能力如圖6所示,在593 nm波長下,硫酸亞鐵在濃度為0.1～1.0 mmol/L的范圍內(nèi),硫酸亞鐵的濃度跟吸光值有良好的線性關(guān)系。由于百香果籽油中的主要成分是亞油酸,因此將亞油酸作為對照組,分析其抗氧化能力。由圖7可以看出,黃色和紫色百香果籽油對鐵離子的還原能力都會隨著濃度的增大而增大,紫色百香果籽油的鐵離子還原能力最大能達(dá)到0.81 mmol/L。總抗氧化能力:BHT>紫色百香果籽油>黃色百香果籽油>亞油酸。方差分析結(jié)果顯示兩種百香果籽油在對鐵離子的還原能力方面無顯著差異(p>0.05)。

表1　黃色百香果籽油、紫色百香果籽油的抗氧化物質(zhì)含量

圖6　硫酸亞鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve of FeSO4

圖7　不同樣品的RFAP值Fig.7　RFAP values of samples

2.2.2對DPPH自由基清除率從圖8可以看出黃色和紫色百香果籽油在一定濃度范圍內(nèi)會隨著油脂濃度的增加,清除能力也隨著增強(qiáng),黃色和紫色百香果籽油對DPPH自由基的最高清除能力均能達(dá)到84%以上。清除DPPH自由基能力:BHT>紫色百香果籽油>黃色百香果籽油>亞油酸。方差分析結(jié)果顯示兩種百香果籽油在對DPPH自由基清除率方面有顯著差異(p<0.05)。

圖8　不同樣品對DPPH自由基清除率Fig.8　DPPH radical scavenging activity of samples

2.2.3對羥自由基清除能力為了與氧化劑和油籽常有成分進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)分別采用黃色和紫色百香果籽油、BHT及亞油酸對羥基自由基的清除能力進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9,黃色和紫色百香果籽油清除羥自由基的能力都弱于亞油酸和BHT。清除羥自由基能力:BHT>亞油酸>黃色百香果籽油>紫色百香果籽油。方差分析結(jié)果顯示兩種百香果籽油在對羥自由基清除能力方面無顯著差異(p>0.05)。

圖9　不同樣品對羥自由基清除率Fig.9　Hydroxyl radical scavenging activity of samples

圖10　不同樣品對超氧陰離子自由基清除率Fig.10　Superoxide anion free radicalscavenging activity of samples

3　結(jié)論

研究表明,兩種百香果籽油都有較強(qiáng)的抗氧化能力,能有效地清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基。而且,隨著百香果籽油濃度的增加,兩種百香果籽油的清除自由基能力的變化趨勢一致。紫色百香果籽油中維生素E、類胡蘿卜素和黃酮的含量均高于黃色百香果籽油,導(dǎo)致其總抗氧化能力強(qiáng)于黃色百香果籽油。總體分析說明,兩種百香果籽油均可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品上。因此百香果籽油可作為一種天然保健植物油的新來源,達(dá)到有效利用廢棄百香果籽的目的。

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A comparative study on antioxidant properties of yellow and purple passion fruit seed oil

XU Xiao-jing,TAO Zhi-hua*

(Department of Food and Biology Engineering,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China)

passion fruit seed oil;antioxidant;comparative analysis

2015-10-16

許曉靜(1990-)，女，在讀研究生，研究方向：生物活性成分的開發(fā)利用，E-mail:15011701241@163.com。

陶志華(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：海洋生物資源的有效利用及其有害成分的控制技術(shù)研究,E-mail:tzh730@hotmail.com。

國家自然科學(xué)基金(31101743)；國家自然科學(xué)基金(31300804)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)11-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.001