真空包裝鹽水鵝中腐敗細(xì)菌的分離鑒定

周　濤,余　娟,毛楊敏

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇南京 210097;2.南京師范大學(xué)中北學(xué)院,江蘇南京 210046)

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真空包裝鹽水鵝中腐敗細(xì)菌的分離鑒定

周濤1,余娟1,毛楊敏2

(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇南京 210097;2.南京師范大學(xué)中北學(xué)院,江蘇南京 210046)

為了采取有效措施控制鹽水鵝中的微生物污染,遂先采用平板劃線分離方法分離出鹽水鵝中的主要微生物菌群,再根據(jù)革蘭氏鏡檢、菌株特性、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA測(cè)序的方法對(duì)鹽水鵝中主要腐敗菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,引起鹽水鵝腐敗變質(zhì)的主要微生物菌群:菌種M為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,B.c)、菌種P為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens,P.f)、菌種S為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans,P.a)。

鹽水鵝,分離,鑒定,16S rDNA,腐敗菌

鹽水鵝作為現(xiàn)代健康食品,其鵝肉具有高蛋白,口味清淡,營養(yǎng)豐富,肉質(zhì)細(xì)嫩,多不飽和脂肪酸,低膽固醇以及免疫球蛋白數(shù)量多的特點(diǎn),因而一直成為加工綠色食品的理想原料。但是作為低溫肉制品,其在貯藏、運(yùn)輸以及銷售過程中都極易因微生物的大量繁殖而引起產(chǎn)品的腐敗變質(zhì),導(dǎo)致肉制品腐敗變質(zhì)的主要細(xì)菌包括:革蘭氏陰性菌,如需氧嗜冷假單胞菌(Pseudomonas)、氣單胞菌(Aeromonas)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、莫拉氏菌(Moraxella)和腐敗交替單胞菌(Altermonas)、腸桿菌(Enterobacteriaceae);革蘭氏陽性菌,如葡萄球菌(Staphylococcus)、熱殺索絲菌(Brochothrixthemosphacta)[1]、乳桿菌(Lactobaci11us);革蘭氏陽性芽孢桿菌,如蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等,厭氧梭狀芽孢桿菌,如腐敗梭菌、溶組織梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等[2-3],從而影響產(chǎn)品的貨架期。因此,就如何控制鹽水鵝中微生物的污染、延長其貨架期已成為企業(yè)迫切需要解決的問題[4]。目前,國內(nèi)外已報(bào)道的關(guān)于鵝肉制品方面的研究主要集中在風(fēng)味和品質(zhì)保鮮上,對(duì)鵝肉制品中的主要菌相的分離鑒定鮮有報(bào)道[5-6]。本研究采用平板劃線分離方法分離純化出鹽水鵝中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群,再根據(jù)革蘭氏鏡檢、菌株特性、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA[7-8]測(cè)序的方法對(duì)鹽水鵝中的主要腐敗菌進(jìn)行菌種鑒定,從而為靶向控制加工過程中的微生物污染提供依據(jù),以達(dá)到延長貨架期的效果[9]。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鹽水鵝為真空包裝,生產(chǎn)日期為2014年06月04日,批號(hào)為20140604,加工過程為分割,真空包裝,沸水殺菌(100 ℃,40 min),象山曙海大白鵝食品有限公司惠贈(zèng);營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2,121 ℃滅菌15 min;甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(chǔ)(Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin agar Base,MYP)蛋白胨10 g,甘露醇10 g,牛肉粉1 g,氯化鈉 10 g,酚紅0.025 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2±0.1,分裝每瓶100 mL,121 ℃滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃,每瓶分別加入50%卵黃乳液 5 mL及多粘菌素B 10000 IU;假單胞CFC選擇性培養(yǎng)基(Pseudomonas CFC Selective Agar additives,CFC)明膠蛋白胨16 g,酸水解酪蛋白10 g,硫酸鉀10 g,氯化鎂1.4 g,瓊脂12 g,甘油10 g,蒸餾水1000 mL,pH7.1±0.2,分裝每瓶200 mL,121 ℃滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃,每瓶加入一支假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基添加劑,混勻,備用;腸道菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(Violet Red Bile Dextrose Agar,VRBDA)酵母粉3 g,蛋白胨7 g,氯化鈉5 g,葡萄糖10 g,膽鹽1.5 g,結(jié)晶紫0.002 g,中性紅0.03 g,瓊脂13 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃滅菌15 min,pH7.3±0.2;PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂胰蛋白胨 5.0 g,酵母浸粉 2.5 g,葡萄糖1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0±0.2;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、PCR引物的合成以及DNA序列的測(cè)定上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其余試劑為分析純,南京化學(xué)試劑有限公司。

CJ-2S超凈工作臺(tái)天津市泰斯特儀器有限公司;LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;LRH-250A生化培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠;DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱太倉市科教器材廠;TH2-C恒溫?fù)u床太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;CH30-313顯微鏡江南光電股份有限公司;DYY-5穩(wěn)壓電泳儀、DYCP-31DN DNA電泳槽北京六一儀器廠;PCR儀2720 thermal cyclerApplied Biosystems;FR980凝膠成像儀上海復(fù)日科技儀器有限公司;DK-8D電熱恒溫水槽上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腐敗菌的分離純化將鹽水鵝貯藏在4 ℃冰箱中6個(gè)月,直到出現(xiàn)例如鹽水鵝包裝袋內(nèi)液體增多、肉質(zhì)變軟、脹袋以及失去彈性等腐敗現(xiàn)象,將其從冰箱取出。

在無菌操作條件下,用無菌剪刀從鵝肉表面取樣25 g,剪碎后加入到225 mL 0.1%蛋白胨無菌生理鹽水中,隨后搖床振蕩30 min混勻,再取1 mL上清液進(jìn)行加倍遞增稀釋到10-6,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù),傾注平板計(jì)數(shù)。選擇3個(gè)合適的稀釋度,接種于不同的選擇性培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)出的不同菌落形態(tài)的菌種進(jìn)行標(biāo)號(hào)。

從平板上挑選出長勢(shì)良好、典型生長的菌落,然后再在各自的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)劃線分離純化,直至得到最終純化的單菌落。

1.2.2培養(yǎng)及形態(tài)特征菌落培養(yǎng)特征:菌落形狀;菌落顏色;菌落大小;菌落表面(表面光澤、表面性狀等);邊緣形狀(光滑、樹枝狀、波狀、缺刻狀等);隆起程度;透明程度;菌落質(zhì)地。

菌體形態(tài)特征:菌體形狀;革蘭氏染色(紅色、紫色、陽性、陰性);芽孢;鞭毛等。

1.2.3生理生化特征糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),V-P實(shí)驗(yàn),吲哚實(shí)驗(yàn),H2S實(shí)驗(yàn),接觸酶實(shí)驗(yàn),石蕊牛乳實(shí)驗(yàn),甲基紅(M.R)實(shí)驗(yàn),Hugh-Leifson實(shí)驗(yàn),硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn),淀粉水解實(shí)驗(yàn),脲酶實(shí)驗(yàn),明膠液化實(shí)驗(yàn),檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn),油脂水解實(shí)驗(yàn),精氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn),苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn),L-酪氨酸分解實(shí)驗(yàn),0.001%溶菌酶實(shí)驗(yàn),酪蛋白水解實(shí)驗(yàn),厭氧洋菜實(shí)驗(yàn),動(dòng)力實(shí)驗(yàn)等[10]。

1.2.4DNA的提取與純化采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒直接提取單菌落DNA。

1.2.516S rDNA目標(biāo)片斷的PCR擴(kuò)增以提取的基因組DNA為模板,選用細(xì)菌通用引物5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′。選用25 μL體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸1 min,72 ℃修復(fù)延伸10 min,4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)檢測(cè)。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.616S rDNA 序列的比對(duì)將測(cè)得的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上使用BLASTN程序在GeneBank基因庫上進(jìn)行同源性檢索,然后選取相似性較高的代表菌株的16S rDNA序列,與測(cè)得的菌株用ClustalX1.83校準(zhǔn)排齊后進(jìn)行多序列比較,用MEGA 3.1軟件進(jìn)行多重比較后以鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap=1000)。

2　結(jié)果與分析

2.1鹽水鵝中分離出的菌種

4 ℃貯藏條件下,從鹽水鵝中分離出的腐敗菌為菌種M、P、S及其它,且菌種M、P、S這三種菌占總菌落數(shù)的百分比比較大,見表1。因此可以判斷菌種M、P、S為鹽水鵝中的主要腐敗菌。

表1　4 ℃貯藏溫度下從鹽水鵝中分離出的菌種Table 1　 Strains isolated from salted goose at 4 ℃ storage temperature

圖1　革蘭氏染色顯微鏡觀察(1000×)Fig.1　The microscopy of gram staining(1000×)

通過革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)及芽孢染色實(shí)驗(yàn)初步分析這三種分離出來的細(xì)菌。結(jié)果見圖1、圖2以及表2。從圖1中可以看出菌種M為革蘭氏陽性菌,菌種P和菌種S為革蘭氏陰性菌。從圖2中可以看出菌種M有芽孢,可以初步判定為芽孢桿菌。根據(jù)表2的結(jié)果,可以看出三種菌株的基本特性,從而為對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

圖2　芽孢染色顯微鏡觀察(1000×)Fig.2　The microscopy of spore staining(1000×)

菌種MPS菌落培養(yǎng)特征菌落形狀不規(guī)則狀圓形圓形菌落顏色粉紅色乳白色乳白色菌落大小較大較小較小表面光澤無有無表面性狀粗糙干燥光滑粘稠光滑邊緣形狀缺刻狀整齊整齊隆起程度扁平隆起隆起透明程度不透明不透明不透明菌落質(zhì)地軟軟、濕潤軟、濕潤菌體形態(tài)特征形狀桿狀較短短桿狀桿狀革蘭氏紫色紅色紅色染色G+G-G-芽孢有無無鞭毛有有有

注:“+”表示陽性,“-”表示陰性。

2.2生理生化實(shí)驗(yàn)

菌種M、P、S的主要生理生化特征見表3。結(jié)合革蘭氏鏡檢、菌株特性、生理生化實(shí)驗(yàn)以及伯杰氏菌種鑒定手冊(cè)[11],初步可以鑒定出菌種M為芽孢桿菌(Bacillus)[12],菌種P為假單孢菌(Pseudomanas),菌種S為腸桿菌(Enterobacter)[13]。

表3　三種菌種的主要生理生化特征Table 3　Main physiological and biochemical characteristics of three species

注:“+”表示陽性,“-”表示陰性,“ND”表示未檢測(cè),“O/F”表示氧化/發(fā)酵。

2.3菌種16S rDNA的PCR擴(kuò)增

菌種的16S rDNA PCR擴(kuò)增后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示,得出長度在1500 bp左右的明亮條帶,因此,PCR擴(kuò)增后的16S rDNA的長度大約為1500 bp。

圖3　1%瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.3　Electrophoresis results with 1% agarose gel 注:M* 泳道為DNA Marker。 1、2、3號(hào)泳道分別為菌種M、P、S的PCR條帶。

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析

將分離出的菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性較高的菌株的16S rDNA序列進(jìn)行多序列比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖4。由同源性比較可得:M與蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)的同源性最高;P與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的同源性最高;S與成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)的同源性最高。

圖4　系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenic tree based on 16S rDNA sequence

蠟狀芽孢桿菌是一種好氧性、具有較強(qiáng)的耐受力、可以形成芽孢的革蘭氏陽性桿菌,因而在鹽水鵝加工過程中難以將其完全殺滅,殘存的菌種大量生長繁殖后將會(huì)影響產(chǎn)品的貨架期。雷鳴[14]等人對(duì)市售某3個(gè)品牌的在架真空包裝冷藏肉制品樣品進(jìn)行嗜冷菌和中溫菌的微生物檢測(cè),而后利用16S rDNA序列分析鑒定出其中的優(yōu)勢(shì)菌群。研究結(jié)果表明:芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、葡萄球菌屬Staphylococcus這三類菌為冷藏肉制品樣品中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬,條件致病菌蠟樣芽孢桿菌和葡萄球菌在3個(gè)品牌產(chǎn)品中均有較高檢出率。

假單胞菌是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的主要微生物,亦是冷藏肉中存在的優(yōu)勢(shì)菌[15],這是因?yàn)榧賳伟诘蜏貤l件下也能利用葡萄糖迅速生長繁殖使肉制品腐敗變質(zhì)影響貨架期,由于鹽水鵝加工熟制后是在4 ℃條件下貯藏,因此有利于嗜冷性假單胞菌的生長繁殖。薛黨辰[16]等研究表明4 ℃存放過程中的鹽水鵝的菌群變化,最終是由假單胞菌屬履行著腐敗的進(jìn)程。蔣云升[17]等研究了鹽水鵝貯藏在不同溫度下的菌落總數(shù)、pH以及菌相的變化。研究表明,當(dāng)有異味產(chǎn)生時(shí),此時(shí)的菌落總數(shù)達(dá)106cfu/g、腿肌的pH在6.5以上。此外,37 ℃時(shí)的腸球菌屬和葡萄球菌屬、20 ℃時(shí)的變形桿菌屬、4 ℃時(shí)的假單胞菌屬為鹽水鵝腐敗過程中的優(yōu)勢(shì)菌種。

成團(tuán)泛生菌屬腸桿菌科的泛菌屬,其廣泛存在于自然界中,如植物的體表、體內(nèi)以及土壤中,在生產(chǎn)加工操作過程中受到污染或者在加工過程中使用了各種香辛料都可能會(huì)導(dǎo)致鹽水鵝中存在此類菌種,所以嚴(yán)格規(guī)范加工操作流程以及規(guī)范對(duì)香辛料的篩選也變得尤為重要[18-20]。

3　結(jié)論

從貯藏在4 ℃溫度下的鹽水鵝中分離出主要腐敗菌,經(jīng)反復(fù)純化后將其分別命名為菌種M、P、S,通過革蘭氏染色鏡檢,芽孢染色鏡檢,菌落形態(tài)的觀察以及生理生化實(shí)驗(yàn)。初步判斷菌種M為芽孢桿菌,菌種P為假單胞菌、菌種S為腸桿菌。然后提取細(xì)菌的16S rDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,經(jīng)測(cè)序和序列比對(duì),得到最終的鑒定結(jié)果,菌種M為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、菌種P為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、菌種S為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)。這些細(xì)菌正是容易引起食品腐敗變質(zhì)的常見污染菌,并且在肉制品的熟制加工后仍有殘存,最終大量生長繁殖,引起鹽水鵝感官品質(zhì)下降,從而影響其貨架期。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與前人已發(fā)表的一些相關(guān)論文得到了類似的結(jié)果,進(jìn)一步為加工過程中采取針對(duì)性的措施控制微生物污染提供借鑒和參考,另外就蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌以及成團(tuán)泛菌如何污染鹽水鵝及其生長規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

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Isolation and identification of spoilage bacteria in vacuum-packed salted goose

ZHOU Tao1,YU Juan1,MAO Yang-min2

(1.Ginling College,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China;2.Zhongbei College,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China)

To understand the microbial contamination of salted goose,some effective measurements were taken. Firstly,the primary bacterial flora was isolated from salted goose by the streak plate separation method. Secondly,it was identified on the basis of gram microscopy,strain characteristics,physio-biochemical tests as well as 16S rDNA sequence analysis.The results indicated that the Bacteria M asBacilluscereus,Bacteria P asPseudomonasfluorescensand Bacteria S asPantoeaagglomerans. All of them were the the primary bacteria in salted goose.

salted goose;isolation;identification;16S rDNA;spoilage

2016-01-18

周濤(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:zhoutaoo@sina.com。

TS207.4

A

1002-0306(2016)14-0219-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.036