不同提取方法對(duì)東北林蛙皮膠原蛋白理化特性的影響

李　梁,李慧萍,邵　穎,范　寧,劉少華,衛(wèi)功慶

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

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不同提取方法對(duì)東北林蛙皮膠原蛋白理化特性的影響

李梁,李慧萍,邵穎,范寧,劉少華,衛(wèi)功慶*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

以東北林蛙皮為原材料,用乙酸和胃蛋白酶兩種方法對(duì)其中所含的膠原蛋白進(jìn)行提取,最終得到兩種膠原蛋白:酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC),并對(duì)這兩種膠原蛋白的理化性質(zhì)及功能特性進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ASC和PSC在234 nm 附近都有強(qiáng)吸收峰,符合膠原蛋白的特征;紅外光譜發(fā)現(xiàn)ASC在3346.0、2952.0、1662.0、1548.0、1242.0 cm-1有吸收峰,PSC在3322.0、2944.0、1662.0、1551.0、1236.0 cm-1有吸收峰,證明這兩種膠原蛋白都存在酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ,內(nèi)部三螺旋結(jié)構(gòu)都保留完整;氨基酸組成表明ASC和PSC都含有18種氨基酸,包括人體所需的8種必需氨基酸,但是組成略有差異;SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,這兩種膠原蛋白都存在β、α1和α2鏈,符合Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征;PSC的變性溫度較ASC要高,但是保濕率較低,它們的吸濕率和相對(duì)溶解度差異不顯著(p>0.05);以上結(jié)果表明不同提取方法對(duì)東北林蛙皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性有一定影響,但是不影響膠原蛋白的品質(zhì)。

東北林蛙皮,膠原蛋白,提取方法,理化性質(zhì),功能特性

膠原蛋白是脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一種結(jié)構(gòu)蛋白,約占蛋白質(zhì)總量的30%,廣泛分布于脊椎動(dòng)物的皮膚、骨、軟骨、肌腱、筋膜、血管等組織,是動(dòng)物體內(nèi)各組織器官的重要支撐物,對(duì)機(jī)體生理功能的完善與增強(qiáng)發(fā)揮著巨大的作用[1]。研究證明,膠原蛋白有多種類型,超過27種,分為纖維性膠原蛋白和非纖維膠原蛋白,其中最主要的是纖維性膠原蛋白,主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型[2];膠原蛋白由三條鏈構(gòu)成,相互交聯(lián)后形成特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu);由于其特殊的空間結(jié)構(gòu)及生物活性,膠原蛋白在食品包裝材料[3]、化妝品[4]及生物醫(yī)學(xué)[5]等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用,特別是在生物醫(yī)學(xué)方面,因?yàn)槠涞偷目乖?可以被做成人造器官[6],為人類的健康做出很大的貢獻(xiàn)。

我國(guó)自然資源豐富,從陸生動(dòng)物豬、牛等獲得膠原蛋白已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史,但是近些年,瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發(fā)[7],限制了豬、牛膠原蛋白的使用,因此,尋找新的膠原蛋白載體成為時(shí)代的必要。東北林蛙(Ranadybowskii)是兩棲綱(Amphibia)、無(wú)尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬(Rana)動(dòng)物,又稱為田雞、蛤士蟆、雪蛤等,是我國(guó)珍稀的藥用動(dòng)物之一,主產(chǎn)于我國(guó)東北長(zhǎng)白山地區(qū)[8];林蛙取油后殘留的大量林蛙皮是蛤蟆油生產(chǎn)過程中最主要的副產(chǎn)物之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),林蛙皮中含有豐富的膠原蛋白,鄭淼等[9]研究了東北林蛙皮中膠原蛋白的提取工藝,并且定量測(cè)定了林蛙皮中膠原蛋白的含量為26%;人們對(duì)林蛙皮膠原蛋白的提取及純化方面也做了相關(guān)研究,如朱瑞霞等[10]用冰醋酸和胃蛋白酶分步提取新鮮林蛙皮膠原蛋白,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件,最終使提取率達(dá)到了11.85%,經(jīng)純化后,其純度能達(dá)到64.70%。

膠原蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)隨著原材料的種類、年齡、提取條件等不同而發(fā)生變化,結(jié)構(gòu)完善、活性更強(qiáng)的膠原蛋白更能受到人們的青睞。本次實(shí)驗(yàn)通過比較酸溶性膠原蛋白(Acid-solubilized collagen)和胃蛋白酶溶性膠原蛋白(Pepsin-solubilized collagen)的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的差異,以期尋求更能滿足人類需要的膠原蛋白產(chǎn)品。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

三年生東北林蛙(心臟取血處死,在4 ℃條件下將皮剝離,蒸餾水洗凈、晾干,-20 ℃保存)吉林市朝亮林蛙養(yǎng)殖場(chǎng);胃蛋白酶(1∶3000)、異硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺、乙腈色譜純，美國(guó)Sigma公司;冰醋酸、溴化鉀、磷酸、氯化鈉、三水乙酸鈉分析純，北京化工廠。

WGH-30A雙波長(zhǎng)紅外分光光度計(jì)上海精密儀器儀表有限公司;高效液相色譜儀日本島津;UV-5100紫外分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司;Schott烏氏粘度計(jì)桂寧實(shí)驗(yàn)器材有限公司;FD-1D-50冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Sigma高速冷凍離心機(jī)德國(guó);Sartorius BP211D 型電子天平德國(guó)賽多利斯公司;pB-10酸度計(jì)德國(guó)賽多利斯公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1東北林蛙皮中主要營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定粗蛋白(凱氏定氮法):GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法》;粗脂肪(索氏抽提法):GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》;水分(直接干燥法):GB/T 5009.3-2003《食品中水分的測(cè)定》;灰分(高溫灼燒法):GB/T 5009.4-2003《食品中灰分的測(cè)定》;膠原蛋白(羥脯氨酸比色法)[11]。

1.2.2東北林蛙皮前處理在4 ℃條件下,取晾干的林蛙皮30 g,用預(yù)冷的蒸餾水沖洗解凍并晾干后,以1∶10的比例在0.1 mol/L的NaOH溶液中浸泡3 h,以去除雜蛋白和部分色素,然后將林蛙皮用預(yù)冷的蒸餾水沖洗至中性;接著將林蛙皮以1∶10的比例放入10%正丁醇中24 h,每8 h換一次溶液,以去除林蛙皮中的脂溶性成分,然后用預(yù)冷的蒸餾水沖洗數(shù)遍,最后低溫晾干備用。

1.2.3酸法提取東北林蛙皮膠原蛋白參考李八方等的方法并適當(dāng)修改[12]。以下操作均在4 ℃的條件下進(jìn)行。取前處理后的林蛙皮10 g,經(jīng)脂肪分散器勻漿后,用30倍的0.5 mol/L的冰醋酸溶液提取,緩慢攪拌48 h,5000 r/min離心30 min,離心后的沉淀用以上方法重復(fù)提取一次,合并兩次上清液,緩慢勻速加入研細(xì)的NaCl(最終濃度為0.9 mol/L)至絮狀沉淀析出,過夜,20000 r/min離心,沉淀用0.5 mol/L冰醋酸復(fù)溶,在0.1 mol/L冰醋酸中透析24 h,6 h換一次透析液,再用蒸餾水透析48 h,12 h換一次透析液,最后經(jīng)冷凍干燥后得到酸溶性膠原蛋白(ASC),于-20 ℃保存。

1.2.4酶法提取東北林蛙皮膠原蛋白參照Lin Wang等的方法并適當(dāng)修改[13]。以下操作均在4 ℃條件下進(jìn)行。取前處理后的林蛙皮10 g,放入30倍的蒸餾水中,用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)酸堿度為1.8,以酶與底物比為4%的比例加入胃蛋白酶,磁力攪拌器緩慢攪拌24 h,5000 r/min離心,沉淀用以上方法重復(fù)提取一次,合并兩次離心后的上清液,用1 mol/L NaOH調(diào)pH至10.0滅酶,鹽析、透析及保存方法與1.2.3處理方法一致,最終得到酶溶性膠原蛋白(PSC)。

1.2.5紫外全波長(zhǎng)掃描(UV)將ASC和PSC分別溶于0.5 mol/L的冰醋酸中配成1 mg/mL 的膠原蛋白溶液,用雙波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。

1.2.6紅外光譜掃描(IR)分別取ASC和PSC適量,與KBr以1∶100的比例在瑪瑙研缽中研磨均勻,混合后手動(dòng)壓片,用紅外分光光度計(jì)在4000～500 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.2.7氨基酸組成分析精確稱取ASC和PSC各20 mg,放入安瓿瓶中,加入6 mol/L鹽酸,充10 min 氮?dú)?N2),火焰燒灼封口,然后將其放入烘箱中以115 ℃水解6 h,水浴揮發(fā)鹽酸,用去離子水溶解并定容到10 mL,最后以異硫氰酸苯酯(HPLC)衍生反相高效液相法測(cè)定ASC和PSC中氨基酸的組成[14]。

表1　東北林蛙皮各營(yíng)養(yǎng)成分含量Table 1　The contents of all kinds of nutrient ingredients from Rana chensinensis skins

1.2.8SDS-PAGE電泳首先配制10%分離膠和5%濃縮膠,然后取ASC和PSC適量,分別溶于0.5 mol/L冰醋酸中,配成濃度為10 mg/mL的膠原溶液,分別取10 μL與同體積的上樣緩沖液(250 mmol/L Tris-HCl 6.8,10% SDS,0.5% BPB,50%甘油,5%β-巰基乙醇)混勻,100 ℃水浴10 min,與蛋白質(zhì)Marker一起上樣,用垂直電泳儀在100 V的電壓下進(jìn)行電泳,待溴酚藍(lán)跑出分離膠后,停止電泳,取出分離膠后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250,25%異丙醇,10%冰醋酸)進(jìn)行染色3 h,取出分離膠放入脫色液(10%醋酸,5%乙醇)中脫色,待條帶完全清晰后停止脫色,根據(jù)條帶的數(shù)量和位置與蛋白質(zhì)Marker比較,確定樣品的分子量。

1.2.9熱變性溫度測(cè)定(Td)將ASC和PSC分別用0.5 mol/L冰醋酸配成1 mg/mL膠原蛋白溶液,用烏氏粘度計(jì)測(cè)定兩種膠原蛋白在15～45 ℃的粘度值變化,每個(gè)溫度保持30 min,重復(fù)測(cè)定三次,計(jì)算ASC和PSC的增比粘度,用分值粘度(Fractional viscosity)與溫度作粘度變化曲線圖,當(dāng)分值粘度為50%時(shí),所對(duì)應(yīng)的溫度(Td)為膠原蛋白的變性溫度[15]。

其中t為樣品流出毛細(xì)管時(shí)間(ASC和PSC);t0為對(duì)照品流出毛細(xì)管時(shí)間(0.5 mol/L冰醋酸)。

1.2.10東北林蛙皮膠原蛋白的水合作用

1.2.10.1吸濕性測(cè)定精確稱取ASC和PSC 各0.500 g,放入密閉恒溫恒濕箱(溫度30 ℃,濕度60%)中,每隔一段時(shí)間精確測(cè)定樣品的重量,同時(shí)用甘油作對(duì)照,實(shí)驗(yàn)平行做三次,計(jì)算樣品和甘油的吸濕率,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸濕率為縱坐標(biāo)作吸濕曲線[16-17]。

其中T為吸濕率;mt為t小時(shí)后樣品或甘油的重量(g);m0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)樣品或甘油的重量(g)。

1.2.10.2保濕性測(cè)定取ASC和PSC各0.5 g,分別置于稱量瓶中,同時(shí)在各稱量瓶中加入樣品質(zhì)量10%的蒸餾水,將稱量瓶放入干燥器中,每隔一段時(shí)間測(cè)定每個(gè)樣品重量,同時(shí)以甘油作對(duì)照,實(shí)驗(yàn)平行做三次,計(jì)算樣品和甘油的保濕率,以時(shí)間為橫坐標(biāo),保濕率為縱坐標(biāo)作保濕曲線[16-17]。

管理方式改革穩(wěn)步推進(jìn)。借著“互聯(lián)網(wǎng)+”的東風(fēng)，珠航局積極促進(jìn)互聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)、人工智能與珠江航運(yùn)融合，打破信息孤島，實(shí)現(xiàn)政府部門、管理機(jī)關(guān)、港航企業(yè)間的信息互聯(lián)互通，全流域航運(yùn)信息資源共享。今年11月，珠江航運(yùn)綜合信息服務(wù)系統(tǒng)珠航局項(xiàng)目正式上線試運(yùn)行，該項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)了部水運(yùn)局、海事局和廣東省交通運(yùn)輸廳數(shù)據(jù)的共享，與廣西交通運(yùn)輸主管部門的數(shù)據(jù)交換網(wǎng)絡(luò)也已連通并實(shí)施數(shù)據(jù)交換，標(biāo)志著“數(shù)字珠江、智慧珠航”建設(shè)邁出新步伐。

其中E為保濕率;m0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)樣品或甘油的含水量(g);mt為t小時(shí)后樣品或甘油的含水量(g)。

1.2.11溶解性測(cè)定

1.2.11.1pH對(duì)膠原蛋白溶解性的影響取ASC和PSC溶液(3 mg/mL,溶于0.5 mol/L冰醋酸溶液)各8 mL分別放入10 mL離心管中,用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)膠原蛋白溶液pH從1～10,然后用與膠原蛋白溶液相同pH的蒸餾水定容至10 mL,充分混勻后20000×g離心30 min,考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量,用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最后計(jì)算ASC和PSC的相對(duì)溶解度,以pH為橫坐標(biāo),相對(duì)溶解度為縱坐標(biāo)作溶解度曲線[18]。

其中mpH為不同pH條件下蛋白質(zhì)的含量;mpH.max為pH變化時(shí)蛋白質(zhì)的最大溶解量。

1.2.11.2NaCl濃度對(duì)膠原蛋白溶解性的影響取ASC和PSC溶液(5 mg/mL,溶于0.5 mol/L冰醋酸溶液)各5 mL放入 10 mL離心管中,與5 mL NaCl(濃度為0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%,溶于0.5 mol/L冰醋酸中)充分混勻,靜置30 min后以20000×g離心30 min,上清液中蛋白含量測(cè)定方法參照1.2.11.1,以pH為橫坐標(biāo),相對(duì)溶解度為縱坐標(biāo)作溶解度曲線。

其中mc為不同NaCl濃度下蛋白質(zhì)的含量;mc.max為NaCl濃度變化時(shí)蛋白質(zhì)的最大溶解量。

2　結(jié)果與討論

2.1東北林蛙皮各營(yíng)養(yǎng)成分含量

由表1可知,東北林蛙皮中水分的含量最高,能達(dá)到56.78%,蛋白質(zhì)含量為34.23%,粗脂肪和灰分含量都比較少,符合動(dòng)物皮膚組織的一般成分組成。膠原蛋白含量為18.68%,與鄭淼等[9]的26%相比較低,可能是取材地不同或者蛙齡不一致,導(dǎo)致東北林蛙皮中膠原蛋白含量差異較大。

2.2ASC和PSC的紫外光譜特征

大多蛋白質(zhì)中都含有酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等,一般在280 nm處有特征吸收峰,但是膠原蛋白基本不含以上氨基酸,因而在280 nm處幾乎沒有吸收,如圖1所示,ASC和PSC的特征吸收峰都在234 nm附近,符合膠原蛋白的特征[19];通過紫外光譜發(fā)現(xiàn)ASC和PSC的特征吸收峰相差不大,證明了ASC和PSC一級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性。

圖1　東北林蛙皮膠原蛋白的紫外光譜圖Fig.1　UV spectrum of Rana chensinensis skins collagens

2.3ASC和PSC的紅外光譜特征

酰胺A與N-H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)有關(guān),N-H基團(tuán)單獨(dú)存在時(shí)所產(chǎn)生的吸收峰在3400～3440 cm-1,但是當(dāng)含有N-H基團(tuán)的分子肽參與氫鍵的形成時(shí),吸收峰的振動(dòng)頻率會(huì)降到3300 cm-1左右,由表2可知,ASC和PSC酰胺A鍵的振動(dòng)頻率分別為3346.0 cm-1和3322.0 cm-1,說明了PSC有更多的N-H基團(tuán)參與到氫鍵的形成;酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的存在由于多肽中羰基的伸縮振動(dòng)形成的,與肽鏈之間的交聯(lián)程度有關(guān),振動(dòng)頻率越大說明肽鏈結(jié)合越緊密,ASC的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ鍵的吸收峰分別為1662.0 cm-1和1548.0 cm-1,PSC吸收峰分別為1662.0 cm-1和1551.0 cm-1,說明前者的三條α鏈結(jié)合得更緊密;酰胺Ⅲ的存在證明了ASC和PSC三螺旋結(jié)構(gòu)的完整[20]。

圖2　東北林蛙皮膠原蛋白紅外光譜圖Fig.2　IR spectrum of Rana chensinensis skins collagens

結(jié)構(gòu)波數(shù)(cm-1)ASCPSC解析酰胺A3346.03322.0N-H伸縮振動(dòng)酰胺B2952.02944.0CH2-不對(duì)稱伸縮振動(dòng)酰胺Ⅰ1662.01662.0C=O伸縮振動(dòng)或α螺旋的COO-反對(duì)稱收縮振動(dòng)酰胺Ⅱ1548.01551.0N-H彎曲與C-N伸縮酰胺Ⅲ1242.01236.0N-H彎曲與C-N伸縮

2.4ASC和PSC的氨基酸組成

膠原蛋白區(qū)別于其他蛋白質(zhì)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是含有其他蛋白質(zhì)沒有的Hyp,Hyp的存在對(duì)膠原蛋白三螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起重要作用[21];Gly幾乎占所有氨基酸的1/3,其肽鏈基本組成結(jié)構(gòu)為(Gly-X-Y)n,由表3可知,ASC和PSC中都含有Hyp,但是PSC較ASC含量稍高,這是因?yàn)槲傅鞍酌冈谔崛∧z原蛋白的過程中,特異性剪切掉膠原蛋白非螺旋區(qū)端基肽,造成Hyp所占比例升高;同理,其他氨基酸所占比例也存在差異,如PSC中Gly、Phe、Met等所占比例要高于ASC,而Asp、Glu、Leu 等所占比例卻低于ASC,氨基酸存在的差異有助于人們識(shí)別ASC和PSC,而且氨基酸的組成不同勢(shì)必導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的區(qū)別,因此,對(duì)ASC和PSC氨基酸含量的測(cè)定也可以引導(dǎo)不同人群對(duì)不同方法制備的林蛙皮膠原蛋白的選擇。

表3　ASC和PSC的氨基酸組成Table 3　Amino acids composition of ASC and PSC

2.5ASC和PSC的電泳圖譜

膠原蛋白分子量大約在300 ku,每條肽鏈在100 ku左右,其三級(jí)結(jié)構(gòu)是由三股左旋的肽鏈相互纏繞形成的。圖3為東北林蛙皮膠原蛋白的電泳圖譜,可知,在分子量為100～220 ku之間,ASC和PSC都存在三條肽鏈,分別為β、α1、α2鏈,符合Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征,β鏈的存在說明了膠原蛋白肽鏈分子間存在分子內(nèi)和分子外的交聯(lián)作用[22]。雖然ASC和PSC結(jié)構(gòu)都保持完整,但是從圖3中可以明顯看出,PSC存在一些雜條帶,這可能是胃蛋白酶酶解非螺旋區(qū)段后形成的雜蛋白,說明ASC的純度更高。

圖3　ASC和PSC的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3　SDS-PAGE electrophoresis pattern of ASC and PSC

2.6ASC和PSC的熱變性溫度

蛋白質(zhì)的熱變性溫度為使50%蛋白質(zhì)變性時(shí)的溫度,通常用分值粘度變化一半時(shí)的溫度來(lái)表示;如圖4所示,ASC和PSC的熱變性溫度在33～35 ℃之間,PSC的熱變性溫度較ASC稍高,與鰱魚皮ASC和PSC的(31.05±0.14)、(31.45±0.01) ℃相比,其變性溫度要高[23],更適合長(zhǎng)期保存。

圖4　東北林蛙皮膠原蛋白的變性溫度Fig.4　Thermal denaturation temperature of Rana chensinensis skins collagens

2.7水合作用

吸水性和保濕性是護(hù)膚化妝品的關(guān)鍵指標(biāo),膠原蛋白作為一種重要的化妝品原材料,這兩個(gè)指標(biāo)的測(cè)定可以為林蛙皮膠原蛋白在化妝品的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),同時(shí),對(duì)ASC和PSC保濕性和吸水性的差異進(jìn)行分析,指導(dǎo)人們選擇更適合的膠原蛋白產(chǎn)品。ASC和PSC的吸濕曲線見圖5(A),由吸濕性曲線可知,甘油有很強(qiáng)的吸濕能力,在64 h后,吸濕率能達(dá)到35%,與ASC和PSC比較,吸濕性更強(qiáng);通過比較ASC和PSC的吸濕率,發(fā)現(xiàn)ASC要強(qiáng)于PSC,更適合成為化妝品的原材料。

圖5　東北林蛙皮膠原蛋白和甘油的 吸水性(A)和保濕性(B)曲線Fig.5　The curve of water absorption(A)and moisture(B) about Rana chensinensis skins collagens and glycerol

ASC和PSC的保濕曲線見圖5(B),由保濕性曲線可知,ASC的保濕性能明顯強(qiáng)于PSC,但仍低于甘油,這一結(jié)果與海蜇皮ASC和PSC不同[17],可能是由于不同物種膠原蛋白結(jié)構(gòu)的不同引起的。

2.8pH和NaCl濃度變化對(duì)膠原蛋白的溶解性的影響

pH對(duì)林蛙皮膠原蛋白溶解度的影響見圖6(A),由圖6可知,ASC和PSC相對(duì)溶解度最高時(shí)的pH分別為2和4,相對(duì)溶解度達(dá)到最高值后隨著pH的增大,溶解度迅速下降,pH7～8變?yōu)閴A性后相對(duì)溶解度達(dá)到最低,隨著堿性的增強(qiáng),溶解度有回升的趨勢(shì),以上現(xiàn)象說明ASC和PSC在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性時(shí)相對(duì)溶解度較高,pH為中性附近時(shí)相對(duì)溶解度達(dá)到最低。

圖6　pH(A)和NaCl濃度(B) 對(duì)東北林蛙皮膠原蛋白相對(duì)溶解度的影響Fig.6　The impact of pH value(A)and NaCl concentration(B) to relative solubility of Rana chensinensis skins collagens

由圖6(B)可知,隨著NaCl濃度的升高,ASC和PSC的相對(duì)溶解度有一定的下降趨勢(shì),當(dāng)達(dá)到4%以后,下降明顯,這是因?yàn)殡S著鹽濃度的增加,蛋白質(zhì)與無(wú)機(jī)鹽競(jìng)爭(zhēng)水分子,無(wú)機(jī)鹽濃度達(dá)到一定濃度后,蛋白質(zhì)分子會(huì)發(fā)生凝聚反應(yīng),隨著重量的增加,蛋白質(zhì)就會(huì)沉降下來(lái),這就是鹽析作用;而且ASC的相對(duì)溶解度對(duì)鹽濃度的增加反應(yīng)更靈敏,可能是因?yàn)锳SC的三螺旋結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,疏水作用更強(qiáng)導(dǎo)致的。

3　結(jié)論

通過不同提取方法得到兩種東北林蛙皮膠原蛋白:ASC和PSC,對(duì)其理化性質(zhì)如紫外光譜特征、紅外光譜特征、氨基酸組成、變性溫度、水合作用、溶解度等進(jìn)行比較分析得出,紫外光譜鑒定發(fā)現(xiàn)林蛙皮膠原蛋白在234 nm附近有最強(qiáng)吸收峰,符合膠原蛋白特征;紅外光譜特征發(fā)現(xiàn)ASC和PSC都存在酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,證明其都保留有三螺旋結(jié)構(gòu)。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)ASC和PSC氨基酸組成不同,PSC的亞氨基酸組成(脯氨酸和羥脯氨酸)較ASC高,為11.91。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,這兩種膠原蛋白都存在β、α1和α2鏈,符合Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征。對(duì)兩種膠原蛋白的變性溫度研究后發(fā)現(xiàn),PSC為34.5 ℃,高于ASC的33.9 ℃。保濕率研究結(jié)果顯示,PSC低于ASC,吸濕率比較差異不顯著(p>0.05),這兩種膠原蛋白的相對(duì)溶解度比較也無(wú)顯著性差異(p>0.05)。ASC和PSC的理化性質(zhì)略有差異,可以根據(jù)這兩種膠原蛋白不同的理化特征應(yīng)用在不同領(lǐng)域。

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Effects of different methods on physico-chemical properties of collagen deprived from Rana chensinensis(Ranadybowskii)skins

LI Liang,LI Hui-ping,SHAO Ying,FAN Ning,LIU Shao-hua,WEI Gong-qing*

(Jilin Agricultural University,Traditional Chinese Medicine Material College,Changchun 130118,China)

Rana chensinensis skins as raw materials,two methods,being acid and pepsin respectively,were used to prepare collagen,eventually,getting two collagens:acid-solubilized collagen(ASC)and pepsin-solubilized collagen(PSC),of which physico-chemical properties and functional characteristics were compared and studied. Results showed that there was a strong absorption peak at 234 nm by analyzing UV spectrums,which demonstrated the two kinds of collagens were in accordance with collagens,characteristics. ASC and PSC had absorption peaks at 3346.0,2952.0,1662.0,1548.0,1242.0 cm-1and 3322.0,2944.0,1662.0,1551.0,1236.0 cm-1respectively by analyzing IR spectrums,which proved the existences of amide A,amide B,amide Ⅰ,amide Ⅱ,amide Ⅲ,indicating that triple helical conformation of the two kinds of collagens were reserved completely. According to analyze amino acids compositions,there were 18 kinds of amino acids in ASC and PSC,including 8 kinds of necessary amino acids humans need,of which were a little different between ASC and PSC. SDS-PAGE electrophoresis results showed that both collagen existedβ,α1andα2chain,in line with structural features of collagen typeⅠ. Compared with ASC,PSC was higher in denaturation temperature,but was lower in moisturizing efficiency,there were not significant for them in moisture absorption rate and the relative solubility(p<0.05). These results described above suggested that different extraction methods have certain influence on the structure,functional characteristics of collagen from Rana chensinensis skins,but did not affect the quality of collagen.

Rana chensinensis(Ranadybowskii)skins;collagen;extraction methods;physico-chemical properties;functional characteristics

2015-11-30

李梁(1992-)，男，碩士研究生，研究方向:動(dòng)物藥材研究與開發(fā)，E-mail：597919662@qq.com。

衛(wèi)功慶(1966-)，男, 博士，教授，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和藥材研究，E-mail：wgq6611@126.com。

吉林省科技支撐項(xiàng)目(20130206027YY)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.020