青皮竹中酚酸類和碳苷黃酮類HPLC分析方法的建立

馬　娜,劉孟華,丁林偉,付衛(wèi)明,,*,何敬愉,*

(1.廣州中國科學(xué)院先進技術(shù)研究所生物工程研究中心,廣東廣州 511458;2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510515;3.廣州海關(guān)化驗中心,廣東廣州 510623)

?

青皮竹中酚酸類和碳苷黃酮類HPLC分析方法的建立

馬娜1,劉孟華2,丁林偉3,付衛(wèi)明1,2,*,何敬愉1,*

(1.廣州中國科學(xué)院先進技術(shù)研究所生物工程研究中心,廣東廣州 511458;2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510515;3.廣州海關(guān)化驗中心,廣東廣州 510623)

建立了一種高效液相色譜(HPLC)法對青皮竹提取物中的三種酚酸和四種碳苷黃酮進行定量分析的方法,并進行了方法學(xué)考察。得到最佳色譜條件為:C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以甲醇:0.1%磷酸水為流動相,流速為1.0 mL/min,UV檢測波長254 nm,洗脫程序為0～10 min,10%～22%甲醇;10～30 min,22%～35%甲醇;30～40 min,35%～60%甲醇。結(jié)果表明,對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊苷的線性范圍分別在0.08～100、0.04～100、0.25～50、0.24～60、0.22～56、0.06～56、0.12～60 μg/mL之間,R2大于0.9996,加標回收率在96%～103%之間,RSD小于3%,日內(nèi)精密度和日間精密度都小于3.48%,該方法靈敏度高,重復(fù)性好,方法學(xué)驗證符合要求。此方法可用于青皮竹中三種酚酸和四種碳苷黃酮的含量檢測。

青皮竹,酚酸,碳苷黃酮,HPLC

竹子是重要的森林資源,不僅在工業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面具有很高的經(jīng)濟價值,而且具有食用和多種藥用價值。有研究表明,竹葉中含有多種生物活性成分,包括黃酮及其苷類、活性多糖、氨基酸、有機酸等,具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗癌等多種生理功能[1]。

青皮竹(BambusatextilesMcClure)屬竹亞科(Bambusoideae)簕竹屬(Bambusa),主要分布在華南地區(qū),是我國一種常見經(jīng)濟竹種[2]。許周典等人對青皮竹葉中化學(xué)成分進行了研究,鑒定了12個酚類化合物,其中10個是黃酮及其苷類[3]?，F(xiàn)有的文獻一般采用分光光度法和高效液相色譜法測定竹葉中黃酮類物質(zhì)的含量,但是分光光度法測定容易受到花青素、酚酸等成分的干擾,僅能用于總黃酮含量的測定。高效液相色譜法在分析過程中存在色譜條件優(yōu)化的問題,因為葒草苷和異葒草苷、牡荊素和異牡荊苷的結(jié)構(gòu)和極性極其相似,樣品中的成分很難達到基線分離[4]。Yu Zhang[5]和Zhaolin Lv[6]等人采用高效液相色譜法對竹葉粗提物中的四種碳苷黃酮進行了定量分析,但沒有取得很好的分離效果。郭妍等[7]人采用HPLC波長切換法同時測定了淡竹葉中香草酸、對香豆酸和牡荊素,該方法取得了較好的分離度,但是波長切換法不夠簡便。王進[8]采用高效液相色譜法測定了7種簕竹屬竹葉中的碳苷黃酮,該方法未能檢測到青皮竹中的葒草苷和牡荊苷。本研究提出一種簡便有效的HPLC分析方法,建立同時測定青皮竹提取物中對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊苷的分析方法,并對此方法進行方法學(xué)考察。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青皮竹(BambusatextilesMcClure)不同采集點的3批次,分別標為青皮竹-1、青皮竹-2、青皮竹-3,廣東省廣寧縣;色譜級甲醇賽默飛世爾科技(中國)有限公司;葒草苷(純度≥98%)、異葒草苷(純度≥98%)、牡荊素(純度≥98%)、異牡荊苷(純度≥98%)成都曼斯特生物技術(shù)有限公司;對羥基苯甲酸(純度純度≥97%)、對香豆酸(純度≥97%)中國藥品生物制品鑒定所;香草酸(純度≥97%)阿拉丁試劑(上海)有限公司。

Agilent 1260系列高效液相色譜美國安捷倫公司;PURELAB Classic超純水儀威立雅水處理技術(shù)(上海)有限公司;BS110S電子天平瑞士Sartorius公司;KQ600DE超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準品溶液的制備精密稱取標準品至容量瓶中,加入甲醇至刻度,搖勻,即得對羥基苯甲酸(0.1 mg/mL)、香草酸(0.1 mg/mL)、對香豆酸(0.1 mg/mL)、葒草苷(0.06 mg/mL)、異葒草苷(0.056 mg/mL)、牡荊素(0.056 mg/mL)、異牡荊苷(0.06 mg/mL)單標儲備液,4 ℃保存不超過一周。

1.2.2供試品溶液的制備取1 g經(jīng)干燥、粉碎后的青皮竹葉-1,精密稱定,加入25 mL甲醇,在室溫條件下超聲(600 W,80 kHz)提取3次,每次20 min,過濾后合并濾液,減壓濃縮到約25 mL,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,加入甲醇至刻度,搖勻,即得供試品溶液。

1.2.3色譜條件色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸水;檢測波長254 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。

洗脫程序:0～10 min,10%～22%甲醇;10～30 min,22%～35%甲醇;30～40 min,35%～60%甲醇。

1.2.4線性關(guān)系考察精密量取對照品儲備液至10 mL容量瓶,加甲醇至刻度,搖勻,得到對羥基苯甲酸溶液(0.08、0.4、4、20、50、100 μg/mL),香草酸溶液(0.04、0.4、4、20、50、100 μg/mL)、對香豆酸(0.25、1、2、5、20、50 μg/mL)、葒草苷(0.24、1.2、6、12、30、60 μg/mL)、異葒草苷(0.22、1.1、5.6、11.2、28、56 μg/mL)、牡荊素(0.06、1.1、5.6、11.2、28、56 μg/mL)、異牡荊苷(0.12、1.2、6、12、30、60 μg/mL),按1.2.3中色譜條件進樣,記錄峰面積,以濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸,得標準曲線方程。

1.2.5重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗精密吸取混合標準品溶液(對羥基苯甲酸4 μg/mL、香草酸4 μg/mL、對香豆酸4 μg/mL、葒草苷6 μg/mL、異葒草苷5.6 μg/mL、牡荊素5.6 μg/mL、異牡荊苷6 μg/mL)和青皮竹-1樣品溶液各10 μL,按1.2.3色譜條件,同一日重復(fù)進樣5次,連續(xù)進樣3 d,記錄峰面積,計算峰面積的RSD值。

1.2.6加標回收率考察取青皮竹-1樣品約1 g,精密稱取,以約1∶1加標量加入1.0 mL混合標準品溶液(對羥基苯甲酸0.07 mg/mL、香草酸0.14 mg/mL、對香豆酸0.03 mg/mL、葒草苷0.21 mg/mL、牡荊素0.01 mg/mL、異牡荊苷0.12 mg/mL)及異葒草苷1.10 mg,按照1.2.2供試品溶液的制備方法及1.2.3色譜條件進樣,記錄峰面積,計算三種酚酸和四種碳苷黃酮化合物的含量和回收率。

1.2.7供試樣品中三種酚酸和四種碳苷黃酮類含量的測定取3批次的青皮竹葉按照1.2.2中供試品溶液的制備方法制備成青皮竹葉提取物溶液,采用1.2.3中液相條件對青皮竹葉提取物樣品中的三種有機酸和四種碳苷黃酮類進行測定。

2　結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察

表1結(jié)果表明,在一定的濃度范圍內(nèi),青皮竹提取物中三種酚酸和四種碳苷黃酮類化合物的峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9996。

表1　7種化合物的標準曲線及線性范圍Table 1　Standard curves and linear ranges of seven compounds

圖1　七種化學(xué)成分標準品(A)和青皮竹葉 甲醇提取物(B)高效液相色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of a mixture of seven standard compounds(A)and the methanol extract of B. textilis leaves(B) 注:1,對羥甲苯甲酸;2,香草酸;3,對香豆酸;4,葒草苷; 5,異葒草苷;6,牡荊素;7,異牡荊苷。

2.2重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗

由表2可知,三種酚酸和四種碳苷黃酮標準品的RSD均小于3.36%,該結(jié)果表明方法的重復(fù)性好。青皮竹葉提取物中各成分的日內(nèi)及日間精密度的RSD均小于3.48%,表明方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。

2.3加標回收考察

由表3可知,三種酚酸和四種黃酮類化合物的加樣回收率在96%～103%之間,RSD小于3%,結(jié)果表明方法準確。

表2　重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 2　Results of precision and stablity

表3　回收率測定結(jié)果(n=6)Table 3　Results of recovery test(n=6)

2.4供試樣品中7種化合物的測定

表4結(jié)果表明,測定的7種化合物都能在青皮竹葉樣品中檢出,異葒草苷是青皮竹中的主要成分,但不同批次間香草酸和葒草苷的含量差異較大。

3　結(jié)論

針對青皮竹提取物中的三種酚酸和四種碳苷黃酮,本研究建立了一種高效液相色譜方法對其進行

表4　青皮竹葉提取物成分測定(n=3)Table 4　Results of composition determination(n=3)

定性定量分析,得到最佳色譜條件為:C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以甲醇:0.1%磷酸水為流動相,流速為1.0 mL/min,UV檢測波長254 nm,洗脫程序為0～10 min,10%～22%甲醇;10～30 min,22%～35%甲醇;30～40 min,35%～60%甲醇。對該方法進行方法學(xué)考察,對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊苷的線性范圍分別在0.08～100、0.04～100、0.25～50、0.24～60、0.22～56、0.06～56、0.12～60 μg/mL之間,R2大于0.9996,加標回收率在96%～103%之間,RSD小于3%,日內(nèi)精密度和日間精密度都小于3.48%,實驗結(jié)果表明,該方法靈敏度高,重復(fù)性好,方法學(xué)驗證符合要求。本研究建立的方法可以對青皮竹提取物中三種有機酸和四種碳苷黃酮同時進行有效分離,實現(xiàn)對青皮竹葉中酚酸和碳苷黃酮成分準確的定量,為青皮竹葉功能性產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了一種簡便可靠的方法。

[1]馮磊,沈健.竹葉提取物降低小鼠脂質(zhì)過氧化、升高GSH-Px和SOD活力的作用研究[J].現(xiàn)代康復(fù),1999,3(3):

334-336.

[2]楊淑敏,江澤慧,任海青.青皮竹研究進展及展望[J].竹子研究匯刊,2007,26(1):15-19,26.

[3]許周典,孫嘏,王進,等. 青皮竹BambusatextilisMcClure竹葉化學(xué)成分研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,40(6):1013-1017.

[4]薛月芹,袁珂,樓爐煥,等.淡竹葉中葒草苷的微波萃取-HPLC法測定[J].中草藥,2008,39(11):1665-1667.

[5]Yu Zhang,Jingjing Jiao,Chengmei Liu,et al.Isolation and purification of four flavone C-glycosides from antioxidant of bamboo leaves by macroporous resin column chromatography and preparative high-performance liquid chromatography[J].Food Chemistry,2008,107:1326-1336.

[6]Zhaolin Lv,Jing Dong,Bolin Zhang.Rapid identification and detection of flavonoid compounds from bamboo leaves by LC-(ESI)-IT-TOF/MS[J].Bioresources,2012,7(2):1405-1418.

[7]郭妍,郭晏華. HPLC波長切換法同時測定淡竹葉中3種成分的含量[J].中成藥,2010,32(9):1624-1626.

[8]王進. 簕竹屬竹葉活性組分篩選、檢測及揮發(fā)性成分研究[D].北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院,2012:32-33.

HPLC method development for analysis of phenolic acids and flavone C-glycosides inBambusatextilesMcClure

MA Na1,LIU Meng-hua2,DING Lin-wei3,FU Wei-ming1,2,*,HE Jing-yu1,*

(1.Bioengineering Research Center,Guangzhou Institute of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 511458,China;2.School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3.Guangzhou Customs Laboratory,Guangzhou 510623,China)

An analytical method based on high performance liquid chromatography(HPLC)was developed for quantification of three phenolic acids and four flavone C-glycosides inBambusatextilesMcClure,and was also validated. The optimum chromatographic conditions were determined using a C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)at the detection wavelength of 254 nm and a flow rate of 1.0 mL/min. Mobile phase was a binary eluent of methanol(A)and 0.1% aqueous phosphoric acid(v/v)(B)with gradient conditions as follows:0～10 min,10%～22% A,10～30 min,22%～35% A,30～40 min,35%～60% A. As a result,p-hydroxybenzoic acid,vanillic acid,p-coumaric acid,orientin,isoorientin,vitexin and isovitexin had good linearity(R2≥0.9996)within range of 0.08～100,0.04～100,0.25～50,0.24～60,0.22～56,0.06～56 and 0.12～60 μg/mL,respectively. The recoveries of the analytes were between 96% to 103%(RSD<3%),and the RSD of intraday and interday precisions were all less than 3.48%. The method was of high sensitivity,good reproducibility,and meets the methodological requirements. The method could apply to determine the contents of three phenolic acids and four flavone C-glycosides inB.textiles.

BambusatextilesMcClure;phenolic acid;flavone C-glycosides;HPLC

2016-01-20

馬娜(1988-)，女，碩士，研究方向:食品添加劑與營養(yǎng)控制，E-mail：na.ma@giat.ac.cn。

付衛(wèi)明(1976-)，男，副研究員，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail：wm.fu@giat.ac.cn。

何敬愉(1983-)，男，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：jy.he@giat.ac.cn。

國家自然科學(xué)基金項目(81503376)；廣州市科技計劃項目(2014J4100045)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)14-0090-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.009