高效液相色譜法測定脂肪酸組成柱前衍生條件的優(yōu)化研究

嚴開芹,蘇可盈,許洋琿,唐嘉穎,吳　青

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室,廣東廣州 510642)

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高效液相色譜法測定脂肪酸組成柱前衍生條件的優(yōu)化研究

嚴開芹,蘇可盈,許洋琿,唐嘉穎,吳青*

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室,廣東廣州 510642)

目的:制備脂肪酸苯酰肼對照品,通過該對照品計算衍生率,探究脂肪酸最優(yōu)的高效液相色譜(HPLC)柱前衍生條件。方法:選取正十四碳酸(myristic acid,MA)為代表,以吡啶為催化劑,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-EDC·HCl)為偶聯(lián)劑,MA與2-硝基苯肼鹽酸鹽(2-NPH·HCl)反應,合成正十四碳酸苯酰肼(myristic benzhydrazide,MBH);采用硅膠柱層析和重結晶對衍生產(chǎn)物MBH進行分離純化,MS和1H-NMR進行結構鑒定,TLC和HPLC進行純度檢測;以衍生率為指標,對影響MA衍生為MBH的HPLC的柱前衍生條件進行研究。結果:成功制備了純度為99.81%的MBH對照品,可用于脂肪酸衍生條件優(yōu)化研究中衍生率的測定;最優(yōu)的衍生條件為:2-NPH·HCl濃度為0.04 mol/L,1-EDC·HCl濃度為0.45 mol/L,60 ℃水浴加熱15 min,此時MA的衍生率達到99.85%。在此衍生條件下,衍生同摩爾濃度的亞油酸(linoleic acid,LA),經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn),LA衍生產(chǎn)物的峰面積與MA衍生產(chǎn)物的峰面積的相對差值僅為1.3%。結論:獲得了脂肪酸最優(yōu)的HPLC柱前衍生條件,該衍生條件能最大化地衍生脂質(zhì)中各種脂肪酸。

脂肪酸,衍生,高效液相色譜

目前,食品中脂質(zhì)的脂肪酸組成常用氣相色譜法(GC)檢測[1-2]。但是不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸在高溫下分析時其雙鍵易發(fā)生異構化甚至碳鏈斷裂,從而影響測定的準確性[3-4]。而高效液相色譜法(HPLC)可避免此問題,而且更具有選擇性,可更有效地分離脂肪酸的異構體,如立體異構和雙鍵位置異構[5-6]。但是,脂肪酸在可見和紫外區(qū)域沒有吸收官能團,也不具有熒光[7],因此需要在HPLC分析前進行柱前衍生,使脂肪酸分子帶上在紫外或可見光或熒光下有吸收的基團。

一些文獻報道[8-10]，2-硝基苯肼鹽酸鹽(2-NPH·HCl)是一種較好的衍生劑,在吡啶作催化劑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-EDC·HCl)作偶聯(lián)劑下的衍生反應可在溫和條件(弱酸環(huán)境,60 ℃加熱15 min)且在水相體系中進行,衍生化后的脂肪酸衍生物在400 nm有較強吸收,為此可提高HPLC分析的靈敏度。如何使脂肪酸最大化地衍生,是實現(xiàn)HPLC準確檢測的關鍵和前提。許多學者[11-12]在研究脂肪酸與2-NPH·HCl進行衍生反應的條件時,均以脂肪酸苯酰肼的液相色譜峰面積或峰高為依據(jù)進行篩選,峰面積越大或峰高越高,衍生化程度越高,衍生條件越好;但此類方法并不能了解真實的脂肪酸衍生率,判斷衍生化程度最準確的指標是衍生率。而要獲得衍生率,必須有純化的脂肪酸苯酰肼為對照品,以其在一定濃度下對應的色譜峰面積為理論值,脂肪酸在一定條件下衍生后經(jīng)HPLC分析獲得的峰面積為實際值,計算衍生率。

本文選取正十四碳酸(MA)為代表,與2-NPH·HCl進行衍生反應,通過萃取、硅膠柱分離和重結晶進行純化,獲得了純度高的正十四碳酸苯酰肼(MBH)對照品,將其用于衍生條件優(yōu)化中衍生率的測定。以衍生率為指標,探索了2-NPH·HCl濃度、1-EDC·HCl濃度、水浴溫度及時間對MA衍生率的影響,以確定最優(yōu)的衍生條件;并在此衍生條件下,衍生同摩爾濃度的亞油酸,比較其衍生產(chǎn)物的峰面積與MA衍生產(chǎn)物的峰面積,來驗證建立的衍生條件是否能最大化地衍生脂質(zhì)中各種脂肪酸。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

MA(≥99.5%)、1-EDC·HCl(98%)、吡啶(≥99%)阿拉丁生化科技公司;亞油酸(LA,≥98.5%)美國Sigma公司;2-NPH·HCl(98%)安耐吉公司;乙腈(色譜純)廣州綠百草生物科技有限公司;氫氧化鉀、鹽酸、乙醇、甲醇(均為分析純)天津大茂化學試劑廠。

LC-20AT高效液相色譜儀(配UV-VIS檢測器)日本島津公司;Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)美國Waters公司;DK-8D三孔電熱恒溫水槽上海齊欣科學儀器有限公司;KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗器Fisher公司;N1001DWA旋轉蒸發(fā)儀日本EYELA公司;5424R高速離心機Eppendorf公司;WX-80A混合器上海精科實業(yè)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1試劑的配制

1.2.1.1MBH對照品合成所用試劑的配制0.02 mol/L 2-NPH·HCl溶液:用體積分數(shù)80%乙醇溶解2-NPH·HCl配成;體積分數(shù)3%吡啶溶液:用無水乙醇溶解吡啶配成;0.25 mol/L 1-EDC·HCl溶液:用體積分數(shù)80%乙醇溶解1-EDC·HCl配成;0.125 mol/L 1-EDC·HCl工作液:將3%吡啶溶液與0.25 mol/L 1-EDC·HCl溶液等體積混合;質(zhì)量分數(shù)15%KOH溶液:用V(甲醇)∶(水)=4∶1溶解KOH制成;3 mol/L HCl溶液:用V(乙醇)∶V(水)=4∶1稀釋鹽酸制成。

1.2.1.2衍生化條件優(yōu)化所用試劑的配制1600 nmol/mL MA溶液:用體積分數(shù)80%乙醇溶解MA配成;0.04 mol/L 2-NPH·HCl溶液:用體積分數(shù)80%乙醇溶解2-NPH·HCl配成;0.45 mol/L 1-EDC·HCl溶液:用體積分數(shù)80%乙醇溶解1-EDC·HCl配成;0.225 mol/L 1-EDC·HCl工作液:將3%吡啶溶液與0.45 mol/L 1-EDC·HCl溶液等體積混合;1 mg/mL MBH貯備液:稱取MBH對照品10 mg,用甲醇溶解配成。

1.2.2MBH對照品的制備

1.2.2.1MBH的合成稱取100 mg十四酸標準品溶于100 mL無水乙醇中,加入 0.02 mol/L 2-NPH·HCl溶液200 mL、0.125 mol/L 1-EDC·HCl工作液400 mL,于80 ℃水浴中反應5 min,然后加入15% KOH溶液100 mL,80 ℃下繼續(xù)加熱5 min以破除副產(chǎn)物和過量試劑,取出用流水冷卻,加入3 mol/L HCl溶液250 mL進行中和,得到顯黃色的產(chǎn)物混合液,最后加入正己烷進行萃取,萃取2次,合并正己烷層,旋轉蒸發(fā)干正己烷后,用少量乙酸乙酯溶解。

1.2.2.2MBH的純化在裝有硅膠的750 mm×14.5 mm玻璃柱頂端加入溶有產(chǎn)物的乙酸乙酯溶液,用V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)混合液=1∶6 進行洗脫,收集各段有顏色的洗脫液,取少量洗脫液,滴加KOH溶液,若顯紫色表明洗脫液含有MBH產(chǎn)物。將該洗脫液濃縮,再分別用甲醇和正己烷溶解,進行兩次重結晶,得到黃色針狀晶體。

1.2. 3MBH的結構確證

1.2.3.1紫外光譜鑒定取純化得到的MBH適量,用甲醇配成400 nmol/mL的溶液,采用HPLC-PDA檢測器對該化合物進行全波長掃描,采集光譜圖,以獲得最大吸收波長。

1.2.3.2質(zhì)譜鑒定稱取MBH 10 mg,用甲醇制成1 mg/mL溶液,在負離子模式下采集ESI-MS(高分辨)質(zhì)譜圖,以獲得分子質(zhì)荷比。

1.2.3.3核磁鑒定稱取MBH 7 mg、馬來酸(內(nèi)標物)2 mg,用氘代氯仿(CDCl3)溶解,在一定核磁條件下采集氫譜圖,以獲得1H-NMR(CDCl3)δ數(shù)據(jù)。

1.2.4MBH的純度檢測

1.2.4.1薄層色譜檢測取純化得到的MBH適量,用甲醇配成1 mg/mL的溶液,在同一硅膠板上以不同點樣量點樣,用V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=1∶2展開劑進行展開。

1.2.4.2HPLC檢測稱取MBH10 mg,用甲醇制成1 mg/mL溶液,采用以下色譜條件:Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相V(乙腈)∶V(水)=86∶14,流速1 mL/min,進樣量20 μL分別采集254、230和215 nm波長下的色譜圖;再改變流動相組成,分別在254、230和215 nm波長下采集色譜圖。

1.2.5衍生方法吸取1600 nmol/mL MA溶液100 μL于1 mL刻度試管中,依次加入0.04 mol/L 2-NPH·HCl溶液200 μL和0.225 mol/L 1-EDC·HCl工作液200 μL,渦旋振蕩30 s,混勻,置于60 ℃水浴中反應15 min,反應結束后,加入15% KOH溶液100 μL,反應5 min,流水冷卻后加入3 mol/L HCl溶液100 μL中和,用80%乙醇定容,渦旋振蕩混勻,12000 r/min離心,取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6HPLC條件色譜柱:Sunfire C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:V(乙腈)∶V(水)=86∶14,等度洗脫;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:400 nm;進樣量:10 μL。

1.2.7衍生率的測定

1.2.7.1MBH對照品標準曲線的繪制分別吸取不同體積的MBH貯備液,用甲醇稀釋配制成濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的系列溶液,用1.2.6中的色譜條件,以各濃度峰面積y對相應濃度x作直線回歸,繪制標準曲線。其線性回歸方程為:y=5123.1x-867.46,R2=1。

1.2.7.2衍生率的計算上機樣液中MBH的質(zhì)量濃度按下式計算:

式中:W-上機樣液中MBH的質(zhì)量濃度(μg/mL);X-衍生時所用MA的納摩爾濃度(nmol/mL);100-衍生時所用MA體積(μL);363-MBH的摩爾質(zhì)量。

將W代入標準曲線獲得MBH的理論峰面積B,再按下式計算衍生率D:

式中:D-MA的衍生率;A-MA衍生為MBH的實際峰面積;B-MA衍生為MBH的理論峰面積。

1.2.8衍生條件優(yōu)化

1.2.8.12-NPH·HCl濃度對衍生率的影響在1-EDC·HCl濃度為0.25 mol/L,水浴溫度為80 ℃,水浴時間為5 min的條件下,研究2-NPH·HCl濃度分別為0.02、0.03、0.04和0.05 mol/L水平下對MA衍生率的影響。

1.2.8.21-EDC·HCl濃度對衍生率的影響在2-NPH·HCl濃度為0.04 mol/L,水浴溫度為80 ℃、水浴時間為5 min的條件下,研究1-EDC·HCl濃度分別為0.15、0.25、0.35、0.45和0.55 mol/L水平下對MA衍生率的影響。

1.2.8.3水浴溫度和水浴時間對衍生率的影響在2-NPH·HCl濃度為0.04 mol/L,1-EDC·HCl濃度為0.45 mol/L的條件下,研究水浴溫度分別為40、60、80 ℃水平,水浴時間分別為5、10、15、20 min水平下對MA衍生率的影響。

1.2.9驗證最優(yōu)衍生化條件的適用性以含多不飽和雙鍵的脂肪酸亞油酸LA為代表,采用獲得的最佳衍生條件,衍生LA,比較 LA衍生產(chǎn)物的峰面積與同摩爾濃度的MA衍生產(chǎn)物的峰面積的相對差值,來驗證建立的衍生條件是否能最大化地衍生脂質(zhì)中各種脂肪酸。峰面積相對差值計算公式如下:

式中:R-LA與MA衍生產(chǎn)物峰面積的相對差值;S1-LA衍生產(chǎn)物的峰面積;S2-MA衍生產(chǎn)物的峰面積。

1.2.10數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,進行組間兩兩比較時,若方差齊時,采用LSD檢驗;若方差不齊時,采用Tamhane’s檢驗,差異顯著性水平為p<0.05。

2　結果與分析

2.1MBH的結構確證

純化得到的MBH為黃色針狀晶體,易溶于甲醇、乙醇和乙腈。光譜掃描結果如下:λmax(MetOH):230 nm和400 nm。ESI-MS(高分辨)在負離子模式下獲得的分子質(zhì)荷比m/z:362[M-H]-;以馬來酸為內(nèi)標物,1H-NMR(CDCl3)δ數(shù)據(jù)如下:10.10(s,1H)、9.18(s,1H)、8.08(dd,J=1.44,8.51 Hz,1H)、7.55(m,1H)、7.05(dd,J=1.05,8.65 Hz,1H)、6.85(m,1H)、6.26(s,4H)、2.21(t,J=7.4 Hz,2H)、1.253(m,22H)、0.845(t,J=7.0 Hz,3H)。其中,δ=6.26為內(nèi)標物馬來酸的H;δ=0.845為MBH分子中甲基上的3個H,δ=2.21為與羰基相連的亞甲基上的H,δ=1.253為其余亞甲基上的H,δ=10.10為與羰基相連的N上的H,δ=9.18為與苯環(huán)相連的N上的H,δ=8.08、7.55、7.05、6.85為苯環(huán)上的4個H。以上數(shù)據(jù)可確證該化合物為正十四碳酸苯酰肼MBH,結構見圖1。

圖1　正十四碳酸苯酰肼的結構Fig.1　The structure of myristic benzhydrazide

2.2MBH的純度檢測

薄層色譜檢測結果顯示,只見單一的黃色斑點,未見雜質(zhì)斑點,表明制備的MBH純度較高。1.2.4.2色譜條件下的HPLC檢測結果顯示,254 nm波長下的色譜圖只見1個主峰(圖2),保留時間為13.5 min,質(zhì)量分數(shù)以峰面積歸一化法計算為99.81%。在上述色譜條件下采集的230 nm和215 nm下的色譜圖,同樣也只見1個主峰;改變流動相組成,分別在254、230和215 nm下獲得的色譜圖亦只見1個主峰,未見其他峰,進一步表明該MBH化合物純度高。

圖2　正十四碳酸苯酰肼的色譜圖Fig.2　The HPLC of myristic benzhydrazide

2.32-NPH·HCl濃度對衍生率的影響

2-NPH·HCl濃度對MA衍生率的影響見圖3。由圖可見,MA衍生為MBH的衍生率隨著衍生劑2-NPH·HCl濃度的增加而增加。當2-NPH·HCl濃度為0.02 mol/L時,MA的衍生率為75.75%,而濃度增加到0.04 mol/L時,MA的衍生率可增加到87.51%,經(jīng)差異顯著性檢驗發(fā)現(xiàn),2-NPH·HCl濃度為0.04 mol/L時的衍生率顯著高于濃度0.03 mol/L時的衍生率,而與濃度為0.05 mol/L時的衍生率相比較,則無顯著性差異,因此選取2-NPH·HCl濃度為0.04 mol/L。

圖3　2-NPH·HCl 濃度對衍生率的影響Fig.3　Effect of the concentration of 2-NPH·HCl on derivatization yield 注:圖中不同字母代表差異顯著(p<0.05)；圖4、圖5同。

2.41-EDC·HCl濃度對衍生率的影響

1-EDC·HCl濃度對MA衍生率的影響見圖4。由圖4可見,MA衍生化為MBH的衍生率隨著偶聯(lián)劑1-EDC·HCl濃度的增加而增加。當1-EDC·HCl濃度為0.15 mol/L時,MA的衍生率為79.47%,而濃度增加到0.45 mol/L時,MA的衍生率可增加到91.32%。經(jīng)差異顯著性檢驗發(fā)現(xiàn),1-EDC·HCl濃度為0.45 mol/L時的衍生率顯著高于濃度為0.35、0.25、0.15 mol/L時的衍生率,而與濃度為0.55 mol/L時的衍生率相比較,則無顯著性差異,因此選取1-EDC·HC濃度為0.45 mol/L。

圖4　1-EDC·HCl 濃度對衍生率的影響Fig.4　Effect of the concentration of 1-EDC·HCl on derivatization yield

2.5水浴溫度和時間對衍生率的影響

由圖5可見,在溫度恒定時,衍生率隨著衍生反應時間的增加而增加,在反應10 min后,衍生率增加較慢,而當時間一定時,衍生率隨著衍生反應溫度的升高而增加。但多次實驗的結果表明,當溫度過高,如選用80 ℃時,衍生反應重現(xiàn)性較差;因此,衍生反應溫度選擇低于80 ℃為宜。溫度為60 ℃,時間為5 min時,MA的衍生率為95.34%,而時間增加到10 min時,MA的衍生率可增加到99.03%。經(jīng)差異顯著性檢驗發(fā)現(xiàn),時間為10 min時的衍生率顯著高于時間5 min時的衍生率,而與時間為15、20 min時的衍生率相比較,則無顯著性差異,但為了確保所有的脂肪酸能最大化的衍生,適當延長衍生反應時間為宜。因此選取水浴溫度為60 ℃、時間為15 min。

圖5　溫度和時間對衍生率的影響Fig.5　Effect of the temperature and time on derivatization yield

2.6驗證MA最優(yōu)衍生化條件的適用性

將同納摩爾濃度(4000 nmol/mL)的LA和MA在衍生條件為0.04 mol/L 2-NPH·HCl、0.45 mol/L 1-EDC·HCl,水浴溫度60 ℃、水浴時間15 min下進行衍生,各自衍生產(chǎn)物的峰面積見表1。由表1可知,兩者的峰面積相對差值很小,僅為1.3%,說明建立的衍生條件能最大化地衍生脂質(zhì)中各種脂肪酸。

表1　MA和LA衍生產(chǎn)物的峰面積比較表Table 1　The comparison of peak area between MA derivative and LA derivative

3　結論

本研究合成了衍生產(chǎn)物MBH,采用硅膠柱層析和重結晶對衍生產(chǎn)物進行了分離純化,經(jīng) MS和1H-NMR鑒定,TLC和HPLC檢測,顯示MBH對照品制備成功,其純度達到99.81%。以衍生率為指標,研究了影響MA衍生反應的HPLC柱前衍生的條件,確定了最優(yōu)的衍生條件:2-NPH·HCl濃度為0.04 mol/L,1-EDC·HCl濃度為0.45 mol/L,60 ℃水浴加熱15 min,此時MA的衍生率達到99.85%。在此衍生條件下,衍生同摩爾濃度的亞油酸LA,LA衍生產(chǎn)物的峰面積與MA衍生產(chǎn)物的峰面積的相對差值僅為1.3%,說明建立的衍生條件能最大化地衍生脂質(zhì)中各種脂肪酸。

[1]GB 28404-2012,保健食品中α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的測定[S]. 北京：中國標準出版社,2012.

[2]農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心. GB 5413.27-2010,嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定[S]. 北京：中國標準出版社,2010.

[3]林抗美,馬麗娜,朱育菁,等. 樂果液相色譜與氣相色譜檢測方法的比較[J]. 中國農(nóng)學通報,2008,24(10):453-456.

[4]Heather M,WU J J. Chromatographic Separation of Bioactive Oxycholesterols by GC,HPLC and SFC[J]. Current Topics in Medicinal Chemistry,2012,2(11):25-28.

[5]鄧澤元,余迎利,Kramer J K G. GC和HPLC對共軛亞油酸的測定[J]. 中國油脂,2015,30(3):36-39.

[6]Sehat N,Yurawecz M P,Roach J A G,et al. Silver-ion high performance liquid chromatographic separation and identification of conjugated linoleic acid isomers[J]. Lipids,1998,33(2):217-221.

[7]Ilia B. Development of fatty acid analysis by high performance liquid chromatography,gas chromatography and related techniques[J]. Analytica Chimica Acta,2002,465(1):1-37.

[8]Miwa H,Hiyama C,Yamamoto M. High performance liquid chromatography of short-and long-chain fatty acids as 2-nitrophenylhydrazides[J]. Chromatography,1985(321):165-174.

[9]Miwa H. High performance liquid chromatographic determination of mono-,poly-and hydroxycarboxylic acids in foods and beverages as their 2-nitrophenylhydrazides[J]. Chromatography A,2000,881(1-2):365-385.

[10]Miwa H. High performance liquid chromatographic determination of free fatty acids and esterified fatty acids in biological materials as their 2-nitrophenylhydrazides[J]. Analytica Chimica Acta,2002,465(1/2):237-255.

[11]Peris-Vicente J,Gimeno-Adelantado J V,Doménech-Carbó M T,et al. Identification of drying oils used in pictorial works of art by liquid chromatography of the 2-nitrophenylhydrazides derivatives of fatty acids[J]. Talanta,2004,(64):326-333.

[12]Henderson G C,Tuazon M A. Separation of positional and geometrical fatty acid isomers as 2-nitrophenyl-hydrazide derivatives by high performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry,2011,413(1):66-68.

Optimization of pre-column derivatization condition of fatty acid by high performance liquid chromatography

YAN Kai-qin,SU Ke-ying,XU Yang-hui,TANG Jia-ying,WU Qing*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Objective:Fatty acid benzhydrazide was produced which was used as a reference substance for determination of derivatization yield. The best conditions for the pre-column derivatization of fatty acids using high performance liquid chromatography were studied. Methods:Myristic acid(MA)was selected to represent all of fatty acids(FAs)in the experiment. MA reacted with 2-nitrophenylhydrazine hydrochloride(2-NPH·HCl)in the case of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(1-EDC·HCl)as coupling agent and pyridine as catalyst,and Myristic benzhydrazide(MBH)was produced. The MBH was separated and purified by silica gel column chromatography and recrystallization. Its structure was identified by MS and1HNMR. Its purity was detected by TLC and HPLC. Derivatization yield as a indicator,the pre-column derivatization conditions of MA using high performance liquid chromatography were studied. Results:MBH was obtained and it purity was 99.81% which could be used as a reference substance for determination of derivatization yield in the study of optimization of derivatization condition of fatty acid. The best conditions for the pre-column derivatization were as follows:the concentration of 2-NPH·HCl was 0.04 mol/L,the concentration of 1-EDC·HCl was 0.45 mol/L,the temperature of the derivatization reaction was 60 ℃,the time of the derivatization reaction was 15 min. The derivatization yield was 99.85% under above the derivatization condition. Linoleic acid derivative was prepared using same derivatization condition. The difference between the peak area of LA derivative and MA derivative was only 1.3%. Conclusion:The optimal pre-column derivatization condition of fatty acid by HPLC was obtained and various fatty acids could be maximum derivatized under above the derivatization condition.

fatty acids;derivatization;HPLC

2016-01-06

嚴開芹(1991-)，女，碩士研究生，研究方向:食品質(zhì)量與安全，E-mail:flyqsxf@163.com。

吳青(1964-)，女，博士，副教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail:wuqing@scau.edu.cn。

2014年國家級大學生創(chuàng)新訓練項目(201410564175)；廣東省科技計劃項目(2010A032000001-4)；廣東省教育部產(chǎn)學研結合項目(2010B090400362)。

TS207.3

B

1002-0306(2016)14-0054-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.002