L-賴氨酸免疫磁性微球制備及其應(yīng)用研究

李鶴，徐丹，李曉鳳（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039）

L-賴氨酸免疫磁性微球制備及其應(yīng)用研究

李鶴，徐丹，李曉鳳
（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039）

采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4納米微粒，并對其粒徑大小、磁響應(yīng)性和磁分散性進行綜合分析。利用反向懸浮包埋法，以Fe3O4納米微粒為載體制備L-賴氨酸高分子微球，并將其運用于豬血清中蛋白的分離。以豬血清蛋白偶聯(lián)率為指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化L-賴氨酸高分子微球作用于豬血清蛋白的最佳作用條件。結(jié)果表明：最佳作用條件為反應(yīng)溫度40℃，作用時間3h，血清用量20mL，在此條件下測得豬血清蛋白的偶聯(lián)率達到18.59%。

Fe3O4納米微粒；L-賴氨酸；豬血清蛋白；偶聯(lián)率

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1設(shè)備

JJ-1型精密增力電動型攪拌器：上海雷韻試驗儀器制造有限公司；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波

納米微粒是指顆粒尺寸為納米量級的超細(xì)微粒，它的尺度大于原子簇（cluster），小于通常的微粉，一般在1 nm～200 nm之間。納米微粒具有巨大的比表面積、表面原子數(shù)、表面能和表面張力。當(dāng)小粒子尺寸進入納米量級（1 nm～200 nm）時，其本身具有量子尺寸效應(yīng)，小尺寸效應(yīng)，表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，因而展現(xiàn)出許多特有的性質(zhì)，在熱、磁、光、敏感特性和表面穩(wěn)定性等方面展現(xiàn)出有別于常規(guī)粒子的特性［1-2］。

磁性高分子微球具有很好的磁性，在磁場作用下可定向運動到特定部位，或迅速從周圍介質(zhì)中分離出來，且質(zhì)輕，易加工，流動性好，在細(xì)胞生物學(xué)（細(xì)胞分離、細(xì)胞標(biāo)記等），生物醫(yī)學(xué)（靶向藥物、臨床診斷等）和生物工程（酶的固定化等）等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的研究和應(yīng)用前景［3-4］。尤其是納米級磁性高分子微球，由于粒徑小，比表面積大，可偶聯(lián)的生物分子容量大，且能分散在體系中不易沉降，非常適合在生物體系中使用。這些性能使其具有廣闊的應(yīng)用前景，因而在生化分離、新芝生物科技股份有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海昂拉儀器有限公司；ZK-82B型真空干燥箱：上海精密儀器儀表有限公司；ME100系列生物顯微鏡：浙江賽因科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2試劑

FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、NaOH、聚乙二醇（PEG）、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸鉀、乙腈、溴化氰（CNBr）、瓊脂糖、四硼酸鈉、二氯乙烷、司班-80、液體石蠟、環(huán)氧氯丙烷、十六醇、檸檬酸三鈉、L-賴氨酸鹽酸鹽（C6H14N2O2·HCl）等（均為分析純）：購于成都科龍試劑化學(xué)試劑廠。Sepharose 4B：上海榮君生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2方法

1.2.1Fe3O4納米粒子的制備

1.2.1.1Fe3O4納米粒子的制備［8-9］

采用化學(xué)共沉淀法，將0.8 mol/L FeCl2溶液與0.8 mol/L FeCl3溶液各50 mL加入三頸瓶中，攪拌，混合均勻，加熱并冷凝回流；升溫至50℃時，緩慢滴加6 mol/L的NaOH溶液80 mL，再加熱至80℃熟化30 min，攪拌，冷卻；加入表面活性劑聚乙二醇（PEG），降至室溫后，抽濾，用去離子水洗滌，真空干燥，即得純黑色的Fe3O4粒子。該反應(yīng)的方程式為：

FeCl2+2FeCl3＋8NaOH=Fe3O4↓+8NaCl+4H2O（1）

1.2.1.2Fe3O4納米粒子的磁懸浮性的測定

利用ME100系列生物顯微鏡初步測定粒子粒徑；用752型紫外可見分光光度計測定粒子磁懸浮性及磁響應(yīng)性［10］。在1500高斯的磁鐵環(huán)境下沉降10 min后，吸取試管1/2處溶液，檢測其透光率，透光率值間接反映磁響應(yīng)效果。其中，透光率越高則磁響應(yīng)性越高；自然條件下沉降5 h后，吸取試管1/2處溶液，檢測其透光率，透光率值間接反映磁分散效果，如果透光率越低則磁懸浮性越好。

1.2.2Fe3O4納米粒子制備條件優(yōu)化

改變電動攪拌器轉(zhuǎn)速、表面活性劑聚乙二醇（PEG）加入量并測定微球粒徑、磁懸浮及磁響應(yīng)性進行試驗，以Fe3O4納米粒子的粒徑為指標(biāo)，篩選得到Fe3O4納米粒子制備的優(yōu)化條件，試驗因素水平見表1。

表1　Fe3O4納米粒子制備因素水平表Table 1　The factors and levels of preparation of Fe3O4nanoparticles

1.2.3L-賴氨酸高分子微球的合成

1.2.3.1瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的活化

在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取0.566 g溴化氰，加12 mL乙腈，加蓋后溫和搖動，使之溶解。將Sepharose 4B用G3砂芯漏斗抽干，加入5 mol/L的磷酸鉀溶液并攪拌，滴加CNBr-乙腈溶液，10 min內(nèi)滴完，再攪拌10 min，然后洗凈，將濕凝膠冰箱備用。

1.2.3.2CNBr-瓊脂糖4B與L-賴氨酸鹽酸鹽的偶聯(lián)［11-12］

取L-賴氨酸1.125 g溶于36 mL 0.2 mol/L NaHCO3溶液中，混合均勻。取樣0.5 mL加入4.5 mL蒸餾水于280 nm波長測其吸光度為0.212。量取上述溶液32 mL，將已活化好的濕凝膠4 g溶于其中，得溶液（A液）35 mL，室溫下用磁力攪拌2 h，然后放入4℃冰箱中過夜。

次日，將上述溶液用G3砂芯漏斗抽濾，再用每升含0.2 mol NaCl 0.01 mol/L的磷酸鉀溶液100 mL沖洗凝膠，共得液體（B液）129.5 mL，取樣在280 nm波長處測吸光度為0.112，然后再用每升含0.15 molNaCl的0.01 mol/L的磷酸鉀溶液150 mL沖洗凝膠，收集得到的洗液共374 mL（C液），取樣在280 nm波長處測吸光度為0.125。

1.2.3.3L-賴氨酸高分子微球的制備

利用反向懸浮包埋法制備L-賴氨酸高分子微球。先將水相（L-賴氨酸-Sepharose 4B1.0 g、0.5 g鐵磁粉、5 mL、100 g/L的NaOH、50 mg NaBH4）混合均勻，70℃溶脹2 h，然后將水相迅速轉(zhuǎn)移至有機相（18mL液體石蠟、12 mL二氯乙烷、1.0 mL司班-80、1.0 mL環(huán)氧氯丙烷）中并加入0.2 g十六醇，70℃恒溫加熱并攪拌4 h。抽濾并用水、體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇水溶液、水依次洗滌以除去殘留的有機相，真空干燥得到產(chǎn)物，放入冰箱備用。

1.2.4L-賴氨酸高分子微球分離豬血清蛋白條件優(yōu)化

按表2，取一定量L-賴氨酸高分子微球與豬血清蛋白充分混合，水浴，在280 nm處測定其吸光度。在前期單因素試驗的前提下，以對試驗影響因素較大的反應(yīng)溫度、作用時間以及血清量進行三因素三水平的正交試驗，試驗因素水平見表2。

表2　正交試驗因素水平表L9（33）Table 2　The factors and levels of orthogonal experiment

2　結(jié)果與討論

2.1Fe3O4納米粒子的性能表征

2.1.1Fe3O4納米粒子的粒徑分析

利用顯微鏡，在目測尺的輔助下，放大1 000倍，用目測尺測量Fe3O4納米粒子的粒徑。為了盡量減小試驗誤差，本試驗采用多次測量取其平均值，試驗所測得的粒徑數(shù)據(jù)見表3，在不同PEG添加量及不同轉(zhuǎn)速下的Fe3O4納米粒子粒徑大小的曲線圖如圖1所示。

圖1　不同轉(zhuǎn)速及PEG添加量對Fe3O4磁性微球粒徑大小影響Fig.1　Effects of different rotational speed and PEG addition on Fe3O4magnetic microspheres particle size

表面活性劑在納米粉體分散中起到的作用主要有兩方面：一是在納米微粒表面吸附，形成表面膜，防止顆粒再團聚；二是形成的表面膜親油基部分與介質(zhì)相容性好，親和力強。由圖1可知，在轉(zhuǎn)速一定的情況下，隨著PEG用量的增加，F(xiàn)e3O4納米粒子的直徑也跟著變??；當(dāng)PEG用量一定的情況下，隨著轉(zhuǎn)速的增加，F(xiàn)e3O4納米粒子的直徑越來越小。這是因為在初始階段，液滴的存在是一個動態(tài)的過程，液滴不斷被聚并又不斷的重新生成，攪拌速度增大，剪切力增大，反應(yīng)體系處于湍流狀態(tài)，液滴周圍存在這較強的壓力波動和相對速度波動，當(dāng)液滴和周圍液體相對速度達到足以使液滴邊緣不穩(wěn)定時，小液滴就會從大液滴上脫離，形成若干個小液滴［13］。

2.1.2Fe3O4納米粒子的磁響應(yīng)及磁分散測定

透光率值可以間接地反映磁響應(yīng)和磁分散效果，將在不同PEG添加量和不同轉(zhuǎn)速下得到的Fe3O4納米粒子分別稱取1.0 g放入試管中，再加入20 mL無水乙醇，在1 500高斯的磁鐵環(huán)境下沉降10 min，測定Fe3O4納米子粒的磁響應(yīng)性，在自然條件下沉降5 h Fe3O4納米子粒的磁分散性，其試驗結(jié)果的平均值見表4。不同轉(zhuǎn)速及PEG添加量對Fe3O4磁性微球磁響應(yīng)和磁分散性的影響分別如圖2和圖3所示。

圖2　不同轉(zhuǎn)速及PEG添加量對Fe3O4磁性微球磁響應(yīng)的影響Fig.2　Effects of different rotational speed and PEG addition on Fe3O4magnetic microspheres magnetic responsivity

圖3　不同轉(zhuǎn)速及PEG添加量對Fe3O4磁性微球磁分散的影響Fig.3　Effects of different rotational speed and PEG addition on Fe3O4magnetic microspheres magnetic dispersion

由圖2可知，在PEG用量一定的情況下，轉(zhuǎn)速越大，透光率越大，則表明Fe3O4納米粒子的磁響應(yīng)性越好；在轉(zhuǎn)速一定的情況下，隨著PEG劑用量的增加，透光率越來越大，則所制得的Fe3O4納米粒子的磁響應(yīng)性就越好；當(dāng)PEG添加量高于3 mL時，曲線趨于緩和，表明此時PEG添加量對Fe3O4納米粒子吸光度的影響越來越小，即對制得產(chǎn)品的磁響應(yīng)性影響也越來越小。

由圖3可知，在PEG用量一定的情況下，轉(zhuǎn)速越大，透光率越大，則表明Fe3O4納米粒子的磁分散性越好；在轉(zhuǎn)速一定的情況下，隨著PEG劑用量的增加，透光率呈略微下降趨勢，但其變化幅度不大，即PEG添加量對Fe3O4磁性微球磁分散的影響不大。

綜上所述，F(xiàn)e3O4磁性微球的制備條件為PEG添加量為3 mL及攪拌轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，能使Fe3O4磁性微球具有較好的響應(yīng)性和分散性。

2.2L-賴氨酸在高分子微球合成中的偶聯(lián)率計算

對合成L-賴氨酸高分子微球過程中的吸光值進行測定，其結(jié)果見表3，并按公式（1）計算得到CNBr-瓊脂糖4B與L-賴氨酸鹽酸鹽的偶聯(lián)率=17.88%。

2.3L-賴氨酸高分子微球分離豬血清蛋白正交試驗結(jié)果分析

將新鮮豬血離心后，在280 nm下用752型紫外可見分光光度計測定其血清的吸光度，吸光度值為2.699，根據(jù)公式（1），其正交試驗結(jié)果見表4，正交試驗結(jié)果分差分析見表5。

表3　CNBr-瓊脂糖4B與L-賴氨酸鹽酸鹽的偶聯(lián)中各種溶液的吸光度值Table 3　The absorbance values of various of solution in the coupling between CNBr-Sepharose 4B and L-lysine hydrochloride

表4　L-賴氨酸高分子微球分離豬血清蛋白正交試驗結(jié)果Table 4　The results of orthogonal experiment of IgG Separation with L-lysine polymer microsphere

表5　正交試驗的方差分析Table 5　Orthogonal analysis of variance

從表5可以看出影響血清蛋白偶聯(lián)率的主次因素為C（血清用量）＞B（作用時間）＞A（溫度）；根據(jù)各因素的主次關(guān)系和最大K值對應(yīng)的水平選出最佳試驗方案為C3B3A2，整理順序得A2B3C3。即反應(yīng)溫度為40℃、作用時間3 h、血清用量20 mL。

2.4驗證試驗

將反應(yīng)溫度設(shè)定為40℃、作用時間為2 h、血清用量20 mL進行3組驗證試驗，試驗結(jié)果如表6所示。

表6　驗證試驗結(jié)果Table 6　The results of verification test

驗證試驗結(jié)果表明：在反應(yīng)溫度為40℃、作用時間2 h、血清用量20 mL時，其血清蛋白偶聯(lián)率為18.55%，與正交試驗中最優(yōu)結(jié)果相差不大，綜合考慮，可確定反應(yīng)溫度為40℃、作用時間2h、血清用量20mL為最佳作用條件。

3　結(jié)論

采用化學(xué)共沉法制備Fe3O4納米粒子，表面活性劑聚乙醇（PEG）用量為3mL、電動攪拌器轉(zhuǎn)速2000r/min時，制得的Fe3O4納米粒子具有較好的磁響應(yīng)性和磁分散性、且粒徑達到200 nm以內(nèi)，在顯微鏡觀察下呈均勻分布狀態(tài)。

采用Fe3O4磁性微球作載體制備L-賴氨酸高分子微球，將其運用于豬血清中蛋白的分離，并采用正交試驗對其最佳作用條件進行了優(yōu)化，得到最佳作用條件為反應(yīng)溫度為40℃、作用時間3 h、血清用量20 mL，在此條件下測得血清蛋白的偶聯(lián)率達到18.59%。

［1］張立德，牟季美.納米材料和納米結(jié)構(gòu)［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：68-104

［2］李學(xué)忠.國外納米材料制備及應(yīng)用領(lǐng)域評述［M］.廈門：中國電子學(xué)會，1997：1-6

［3］吳頡，王君，景小燕，等.磁性高分子微球的制備及應(yīng)用［J］.化工新型材料，2002，30（8）：23-26

［4］丁小斌，孫宗華，萬國祥.磁性高分子微球的制備與應(yīng)用研究進展［J］.化學(xué)通報，1997（1）：1-5

［5］謝鋼，張秋禹，李鐵虎.磁性高分子微球［J］.高分子通報，2001，12 （9）：38-43

［6］Matsunaga T，Kawasaki M，Yu X，et al.Chemiluminescence enzyme immunoassay using bacterial magnetic particles［J］.Analytical Chemistry，1996，68（20）：3551-3554

［7］Solé S，Alegret S，Céspedes F，et al.Flow injection immunoanalysis based on a magnetoimmunosensor system［J］.Analytical Chemistry，1998，70（8）：1462-1467

［8］靳艷巧.高分子磁性微球的制備及應(yīng)用［D］.武漢：武漢理工大學(xué)，2004

［9］趙長杰.Fe3O4納米粒子的制備、包覆及IgG吸附性能研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2014

［10］李玉珍，劉學(xué)涌，陳曉凱，等.兩親磁性高分子微球與人血清白蛋白的相互作用［J］.中國醫(yī)學(xué)雜志，2004，39（9）：682-684

［11］馮萬祥，趙伯龍.生化技術(shù)［M］.長沙：湖南科技出版社，1989：202-208

［12］王期中，張順龍.提高人血丙種球蛋白制品穩(wěn)定性方法的研究［J］.中國生化藥物雜志，2001，22（1）：23-24

［13］靳艷巧，李曦，張超燦.微懸浮聚合法制備聚苯乙烯磁性微球的研究［J］.高分子材料科學(xué)與工程，2006，22（6）：87-89

Research on the Separation of L-lysine Immunomagnetic Microspheres Serum Protein

LI He，XU Dan，LI Xiao-feng
（School of Food and Biological Engineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

This experiment used chemical Co-precipitable to get Fe3O4particles，then analyzed its particle size，magnetic response and magnetic dispersion.Use Fe3O4nanoparticles as carriers for the preparation of L-lysine polymer microsphere by reverse suspension method，which was applied to the separation of pig serum protein.Coupled rate with the pig's serum was used as a target to optimize the technical conditions through the orthogonal experiments.The results showed that the best condition was as follow，the reaction temperature was 40℃，the reaction time was 3 h and the serum dosage was 20 mL，under these conditions the serum protein coupling rate could reach to 18.59%.

Fe3O4particles；L-lysine；pig'sserumproteins；coupledrate靶向制劑、固定化酶、免疫分析、催化研究等方面有極為廣泛的應(yīng)用［4-5］。Nakamura等［6］把細(xì)菌磁微球用于分離血清中免疫球蛋白IgG的含量。Fabregas等［7］將IMMS用磁場固定在一個平板換能器上，制得一種新型免疫傳感器，并將其應(yīng)用于流動分析系統(tǒng)，能夠分離出樣品中微摩爾級濃度的兔抗IgG。免疫高分子磁性微球具有巨大的應(yīng)用前景和潛力，但國內(nèi)的研究水平與國際水平相比還有很大的差距。本試驗采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4粒子，并對其磁響應(yīng)性、磁分散性和粒徑大小進行綜合分析，得到納米分散的Fe3O4粒子。利用反向懸浮包埋法將L－賴氨酸包裹于Fe3O4粒子磁性微球表面，得到L-賴氨酸高分子磁性微球，并將其運用于豬血清中蛋白的分離，優(yōu)化其最佳工藝條件，為L-賴氨酸高分子磁性微球的制備及其應(yīng)用提供一定的理論參考。

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.031

四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201510623055）

李鶴（1982—），女（白），講師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2015-08-10