安定對(duì)高皮質(zhì)激素血癥小鼠絕望樣行為的改善作用及其機(jī)制探討

邵靖，戴建國(guó)，馬健

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

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·基礎(chǔ)研究·

安定對(duì)高皮質(zhì)激素血癥小鼠絕望樣行為的改善作用及其機(jī)制探討

邵靖，戴建國(guó)，馬健

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

目的觀察安定對(duì)高皮質(zhì)激素血癥小鼠絕望樣行為的改善作用，并探討其可能機(jī)制。方法將50只C57BL/6N小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組各10只，A、B、C、D組均制備高皮質(zhì)激素血癥模型，E組不作任何處理。制模后，D、E組以蒸餾水灌胃，A、B、C組分別以0.1 mg/kg安定、0.2 mg/kg安定、3.6 mg/kg鹽酸氟西汀灌胃，1次/d，連續(xù)4周。觀察各組小鼠絕望樣行為(懸尾不動(dòng)時(shí)間、游泳不動(dòng)時(shí)間)，Western blotting法檢測(cè)海馬組織神經(jīng)微絲蛋白輕鏈(NF-L)和突觸素(SYP)。結(jié)果與E組比較，D組懸尾不動(dòng)時(shí)間短，游泳不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)；與D組比較，A、B、C組懸尾不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，游泳不動(dòng)時(shí)間短；P均<0.05。與E組比較，D組NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量降低；與D組比較，A、B、C組的NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量升高；P均<0.05。結(jié)論安定可改善高皮質(zhì)激素血癥小鼠絕望樣行為，其機(jī)制可能與上調(diào)NF-L、SYP表達(dá)有關(guān)。

安定；高皮質(zhì)激素血癥；絕望樣行為；神經(jīng)微絲蛋白輕鏈；突觸素

高皮質(zhì)激素血癥患者因多種原因?qū)е卵獫{皮質(zhì)激素水平升高，常與精神壓力過(guò)大所致長(zhǎng)期慢性應(yīng)激，或臨床應(yīng)用皮質(zhì)激素導(dǎo)致的血漿皮質(zhì)激素水平上升有關(guān)，可引起焦慮、抑郁等臨床癥狀[1]。長(zhǎng)時(shí)間血漿中皮質(zhì)激素維持在一定的高水平，可導(dǎo)致抑郁癥，對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)有嚴(yán)重?fù)p害，甚至可致神經(jīng)元死亡。迄今尚未發(fā)現(xiàn)能對(duì)抗高皮質(zhì)激素血癥致神經(jīng)損傷的特效藥物，因其發(fā)病部位主要位于腦部，一般臨床醫(yī)師采用作用于神經(jīng)系統(tǒng)或腦血管的藥物。安定具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用，可作為預(yù)防應(yīng)激和治療抑郁癥患者的主要治療藥物之一，但其對(duì)高皮質(zhì)激素血癥引發(fā)的絕望樣行為是否有影響以往鮮有報(bào)道。本研究觀察了安定對(duì)高皮質(zhì)激素血癥小鼠絕望樣行為的影響，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57BL/6N小鼠50只，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，溫度(23±1)℃，相對(duì)濕度40%～70%，明暗交替時(shí)間為12 h(6∶00～18∶00開(kāi)燈)，自由飲食、飲水。

1.2藥品及試劑安定購(gòu)自江蘇濟(jì)川制藥有限公司，皮質(zhì)酮購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，鹽酸氟西汀購(gòu)自蘇州制藥有限公司。β-actin和突觸素(SYP)單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(SC81178和SC17750)，小鼠神經(jīng)微絲輕鏈(NF-L)單克隆抗體購(gòu)自Invitrogen公司，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Gene Script公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑公司。

1.3高皮質(zhì)激素血癥模型制備及安定的用法將50只C57BL/6N小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組各10只，A、B、C、D組均制備高皮質(zhì)激素血癥模型，E組不作任何處理。制模后，D、E組以蒸餾水灌胃，A、B、C組分別以0.1 mg/kg安定、0.2 mg/kg安定、3.6 mg/kg鹽酸氟西汀灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4小鼠絕望樣行為評(píng)價(jià)

1.4.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[2]。在2 000 mL的玻璃燒杯中，加入25 ℃左右10 cm深的水，然后分別放入各組實(shí)驗(yàn)小鼠。保持C57BL/6N小鼠在燒杯中游泳6 min，記錄小鼠在實(shí)驗(yàn)中后4 min的不動(dòng)時(shí)間。

1.4.2強(qiáng)迫懸尾實(shí)驗(yàn)強(qiáng)迫懸尾實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[3]。強(qiáng)迫游泳結(jié)束24 h后，將小鼠懸掛于支架上，支架距桌面58 cm，膠帶粘貼位置為小鼠尾尖1 cm處。每只小鼠懸掛5 min，記錄實(shí)驗(yàn)中小鼠不動(dòng)時(shí)間(小鼠被動(dòng)順從或完全不動(dòng))。

1.5海馬組織NF-L、SYP檢測(cè)方法采用Western blotting法。雙側(cè)海馬組織用1 mL的RIPA 緩沖液勻漿并取上清液。Qubit2.0測(cè)定蛋白含量。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉PBST(含0.05%Tween-20的PBS液)37 ℃振蕩1 h封閉。封閉結(jié)束后，一抗4 ℃靜置孵育過(guò)夜，PBST漂洗3次，5 min/次。二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，5 min/次，ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)信號(hào)，化學(xué)發(fā)光成像儀成像，以Image Lab5.0數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、游泳不動(dòng)時(shí)間比較小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、游泳不動(dòng)時(shí)間比較見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間、游泳不動(dòng)時(shí)間比較(s, ±s)

注：與E組比較，#P<0.01；與D組比較，△P<0.01，*P<0.05。

2.2各組小鼠海馬組織NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量比較小鼠海馬組織NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2　各組小鼠海馬組織NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量比較

注：與E組比較，#P<0.01；與D組比較，△P<0.01，*P<0.05。

3　討論

皮質(zhì)激素受體在人體分布廣泛，多種組織存在皮質(zhì)激素受體，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的皮質(zhì)激素受體主要分布在海馬組織及邊緣系統(tǒng)，而該腦區(qū)與機(jī)體學(xué)習(xí)記憶、情緒緊密相關(guān)[4]。長(zhǎng)期存在高皮質(zhì)激素血癥或行為應(yīng)激的效應(yīng)，能夠?qū)υ撃X區(qū)的正常功能甚至組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷作用，可導(dǎo)致海馬錐狀細(xì)胞萎縮及樹(shù)突回縮、數(shù)量減少[5]，減少海馬神經(jīng)再生功能[6]和突觸形成等，進(jìn)一步可致神經(jīng)元細(xì)胞核的碎裂和溶解，最終使海馬組織萎縮功能障礙[7]。高皮質(zhì)激素血癥在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為體質(zhì)量改變的同時(shí)還具有免疫抑制作用，長(zhǎng)期高水平的血漿皮質(zhì)激素可致免疫器官的減小和萎縮。

NF-L作為含量最為豐富的一種神經(jīng)元骨架蛋白，是神經(jīng)元細(xì)胞存活并發(fā)揮正常功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，其亞型與應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷關(guān)系最為密切[8]。SYP作為神經(jīng)元突觸前膜的囊泡蛋白，其作用與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，可反映突觸功能狀態(tài)[9]。NF-L、SYP的變化能夠?qū)ι窠?jīng)元組織結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)作出判斷。

安定具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用，成人失眠、患病需鎮(zhèn)靜時(shí)常用此藥[10]。安定可以降低腎上腺皮質(zhì)的激活程度下降，使應(yīng)激狀態(tài)水平降低，從而使血漿中的皮質(zhì)激素濃度降低，改善機(jī)體微循環(huán)和血流灌注，保護(hù)機(jī)體免受損傷；另有報(bào)道認(rèn)為，服用安定后能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，即上調(diào)腦內(nèi)5-羥色胺；同時(shí)安定還能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性氨基酸的毒性作用，抑制自由基合成保護(hù)神經(jīng)元不受損傷[8]。本研究顯示，與E組比較，D組懸尾不動(dòng)時(shí)間短，游泳不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)；與D組比較，A、B、C組懸尾不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，游泳不動(dòng)時(shí)間短。與E組比較，D組NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量降低；與D組比較，A、B、C組的NF-L、SYP相對(duì)表達(dá)量升高。提示安定可改善高皮質(zhì)激素血癥小鼠絕望樣行為，其機(jī)制可能與上調(diào)NF-L、SYP表達(dá)有關(guān)。

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國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科溫病學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(1022091002002)。

馬健(E-mail: majian67@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.010

R971

A

1002-266X(2016)15-0034-02

2015-12-03)