五味子乙素對腦膠質(zhì)瘤細胞U87增殖的影響及其機制探討

呂紅，蘇子博，付仁，鄭立影，潘正，齊玲，金宏

(吉林醫(yī)藥學院臨床醫(yī)學院，吉林吉林 132013)

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·論著·

五味子乙素對腦膠質(zhì)瘤細胞U87增殖的影響及其機制探討

呂紅，蘇子博，付仁，鄭立影，潘正，齊玲，金宏

(吉林醫(yī)藥學院臨床醫(yī)學院，吉林吉林 132013)

目的觀察五味子乙素(Sch B)對腦膠質(zhì)瘤細胞U87增殖的影響，并探討其可能機制。方法培養(yǎng)U87細胞，分為A、B、C、D組，D組加入含5%血清的培養(yǎng)液200 μL，A、B、C組分別加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培養(yǎng)液，比較各組細胞增殖情況、細胞周期及細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2。結(jié)果與D組比較，A、B、C組48 h和72 h的細胞OD值降低(P均<0.05)。與A、D組比較，B組Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2的A值及陽性表達率高(P均<0.05)。與D組比較，C組Caspase-3、Bax/Bcl-2的A值及陽性表達率高(P均<0.05)。與A組相比，C組Caspase-3的A值及陽性表達率高(P均<0.05)。與D組比較，A組G1期、G2/M期細胞比例增加,P均<0.05。結(jié)論Sch B能明顯抑制U87細胞增殖，誘導其凋亡，且呈一定的量效關系；其機制可能與上調(diào)細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2表達有關。

五味子乙素；腦膠質(zhì)瘤；Caspase-3蛋白；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

腦膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，由于腫瘤所在位置極為特殊，對人體的影響和危害很大。目前，對于腦膠質(zhì)瘤的治療以手術和化療為主，但化療藥物不良反應大，且易產(chǎn)生耐藥性[1]。五味子為木蘭科植物，具有保肝、抗氧化、抗衰老等作用，是一種上品中藥。研究[2～5]表明，五味子具有一定的抗腫瘤活性，乙素則是其中的一種抗腫瘤有效成分，其通過多種途徑發(fā)揮著作用。本研究觀察了五味子乙素(Sch B)對腦膠質(zhì)瘤細胞U87增殖的影響，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1細胞株、藥物及試劑U87細胞由吉林大學提供。Sch B，白色結(jié)晶，用DMSO配成濃度20 mg/mL備用，置于4 ℃冰箱保存，實驗時再用高糖培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。DMEM培養(yǎng)基 (Thermo公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，胰蛋白酶(EDTA，Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，Thermo公司)。Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.2U87細胞培養(yǎng)將U87細胞接種于含F(xiàn)BS濃度為10%的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換液1次。

1.3U87細胞增殖情況觀察采用MTT法。取對數(shù)生長期U87細胞，接種于平底96孔板中，使細胞數(shù)為1×104/孔。培養(yǎng)24 h使細胞同步化后分為A、B、C、D組，D組加入含5%血清的培養(yǎng)液200 μL，A、B、C組分別加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培養(yǎng)液，各組作用24、48、72 h后棄上清。用MTT還原法在酶標儀490 nm波長處檢測各孔光密度值(OD值)，用不加細胞的空白孔調(diào)零。

1.4U87細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2檢測①ELISA法:將生長狀態(tài)良好的U87細胞接種于放有無菌玻片的24孔板中，分為A、B、C、D組，D組加入含5%血清的培養(yǎng)液200 μL，A、B、C組分別加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培養(yǎng)液，作用72 h，每組5個復孔。取培養(yǎng)上清，與包被液以1∶1比例加入96孔酶標板，4 ℃過夜。37 ℃封閉1.5 h，加入Caspase-3、Bax和Bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。次日加入二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1.5 h，DAB避光顯色，有顏色變化時終止，于酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(A值)。②免疫組化法:分組及各組干預方法同上，作用72 h后吸出上清，10%甲醛固定30 min，空氣干燥；內(nèi)源性過氧化物酶滅活；一抗4 ℃過夜，滴加試劑1，37 ℃、20 min，加試劑2，37 ℃、30 min，DAB溶液顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細胞質(zhì)中呈彌漫性分布黃色到棕褐色顆粒定義為陽性，計數(shù)Caspase-3、Bax、Bcl-2表達陽性細胞，陽性表達率=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.5U87細胞周期觀察采用流式分析儀。取對數(shù)生長期U87細胞，1×106接種于細胞培養(yǎng)瓶中，24 h后加入Sch B(濃度為200、0 μg/mL)，分別計為A、D組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化后用80%冷甲醇固定過夜，經(jīng)Annexin V/PI染色，上機檢測各組細胞周期。

2　結(jié)果

2.1各組細胞OD值比較細胞OD值見表1。

表1　各組細胞OD值比較

注：與D組比較，△P<0.05。

2.2各組細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽性表達率比較細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽性表達率比較見表2。

表2　各組細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽性表達率比較

注：與D組比較，△P<0.05；與A組比較，※P<0.05。

2.3兩組細胞周期比較A組和D組G1期細胞分別為8.10%、3.12%，G2/M期細胞分別為16.17%、12.28%，兩組比較，P均<0.05；A組和D組G0/G1期細胞分別為52.37%、58.95%，S期細胞分別為23.36%、25.65%，兩組比較，P均>0.05。

3　討論

腦膠質(zhì)瘤是惡性程度較高的原發(fā)性腫瘤，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見，約占顱內(nèi)腫瘤的45%[6]。惡性膠質(zhì)瘤生長呈浸潤性，邊界不清楚，手術難根除，具有發(fā)病率、復發(fā)率、病死率高和治愈率低的特點，目前沒有滿意的治療方法[7]。齊玲等[8,9]通過對人新鮮腦腫瘤標本進行分離，直接培養(yǎng)，獲得腦腫瘤干細胞；這種干細胞的存在可能是導致腦腫瘤發(fā)生、耐藥以及復發(fā)的根源。

五味子是常用的滋補固澀類中藥，性味溫和，具補益強壯之功、奏固澀生津之效，對心、肝、脾、肺、腎發(fā)揮平衡作用[10]，能明顯影響機體多種組織器官的生物學活性[11]。Sch B作為五味子的主要活性成分之一，在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用[12,13]。最近研究[14]發(fā)現(xiàn)，Sch B低、中、高劑量組均可抑制結(jié)腸癌SW480細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡，其機制可能是通過激活p38MAPK/p53信號通路來參與抗腫瘤作用。Sch B聯(lián)合順鉑對H22腫瘤的抑制作用比單獨應用時效果更強，具有一種類似正反饋的作用使細胞凋亡，其抗瘤作用與抑癌基因p53的高表達相關[15]。Sch B對多柔比星使用過程中產(chǎn)生的心臟毒性有限制作用，同時顯著增強DOX誘導SMMC7721、MCF-7的凋亡能力[16]。Sch B還能通過調(diào)節(jié)相關凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、NF-κB、PARP、CDK-4的表達來引導膽囊癌細胞凋亡[17]。

本課題組前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，高濃度Sch B能夠抑制U87細胞的增殖，但并未進一步研究其機制。Caspase-3是凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行蛋白酶，起著最終樞紐作用[19]。Bcl-2也是一個調(diào)解細胞凋亡的重要基因，其表達升高可抑制細胞凋亡。而Bax的作用與Bcl-2相反，二者產(chǎn)生負反饋作用，影響細胞存活，通過二者的比值，可了解細胞的生存狀況[20]。本研究顯示，與D組比較，A、B、C組細胞OD值降低，Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽性表達率升高，G1期及G2/M期細胞比例高。提示Sch B能明顯抑制U87細胞增殖，誘導其凋亡，且呈一定的量效關系；其機制可能與上調(diào)Caspase-3、Bax、Bcl-2表達有關。

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Influence of Schisandrin B on proliferation of glioma U87 cells and its mechanism

LYU Hong, SU Zibo, FU Ren, ZHENG Liying, PAN Zheng, Qi Ling, JIN Hong

(Clinical Medical College of Jilin Medical College, Jilin 132013, China)

Objective To investigate the effect of Schisandrin B (Sch B) on the proliferation of glioma U87 cells and to explore its possible mechanism. MethodsGlioma U87 cells were cultured and were divided into groups A, B, C and D. Group D was added with culture solution that containing 5% serum 200 μL, and groups A, B and C were added with the same amount of nutrient solution which respectively contained 50, 100 and 200 μg/ml Sch B. The cell proliferation was compared between these groups. The cell cycle and the expression of Caspase-3, Bax, Bcl-2 and Bax/Bcl-2 were respectively detected by ELISA and immunohistochemistry. ResultsCompared with group D, the A value at 48 h and 72 h in the groups A, B and C was decreased. Compared with groups D and A, the A values of Caspase-3, Bax and Bax/Bcl-2 and the positive expression rate of group B were increased (all P<0.05). Compared with group D, the A values of Caspase-3 and Bax/Bcl-2, and the positive expression of group C were increased (all P<0.05). Compared with group A, the A value of Caspase-3 and the positive expression rate of group C were increased (all P<0.05). Compared with group D, the cell percentage of the G1 and G2/M phases of group A was increased, all P<0.05. ConclusionSch B can significantly inhibit the proliferation of U87 cells, induce the apoptosis, and it has a dose-effect relationship, whose mechanism may be related with the up-regulation of Caspase-3, Bax and Bcl-2 expression.

Schisandrin B; glioma; Caspase-3 protein; Bax protein; Bcl-2 protein

吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2014039)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究規(guī)劃項目(吉科教合字2015第408號)。

呂紅(1992-)，女，本科，主要研究方向為腦腫瘤藥物。E-mail: lvhong1026@163.com

簡介：金宏(1975-)，女，碩士，副教授，主要研究方向為腦腫瘤藥物。E-mail: jinhong0706@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.001

R739.4

A

1002-266X(2016)15-0001-03

2015-11-09)