M IF降低子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度

李　建，胡玉紅，張　燕（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，佳木斯154000；通訊作者，E-mail:liam jiam@gmail. com）

M IF降低子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度

李建，胡玉紅*，張燕（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，佳木斯154000；*通訊作者，E-mail:liam jiam@gmail. com）

目的探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥（EMT）患者腹腔液中巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響。方法選取2015-03～2015-10在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)治療的EMT和子宮肌瘤患者（對(duì)照組）各30例。采用腹腔鏡囊腫穿刺針于手術(shù)操作前抽取腹腔液5ml。運(yùn)用光學(xué)顯微鏡觀察4h內(nèi)巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)情況，使用Cell Sense Standard軟件每2min對(duì)運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行圖像記錄。Image J軟件計(jì)算巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率。ELISA法測(cè)定腹腔液中MIF的濃度。結(jié)果與子宮肌瘤患者相比，EMT患者腹腔液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率顯著降低（P＜0.05），其在月經(jīng)周期增殖期的運(yùn)動(dòng)速率低于分泌期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EMT患者腹腔液中MIF的濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），其在增殖期的水平高于分泌期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EMT患者腹腔液中MIF濃度與巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。結(jié)論EMT患者腹腔液中MIF的異常表達(dá)使巨噬細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)受抑制，間接參與EMT患者腹腔液巨噬細(xì)胞的增加過(guò)程，巨噬細(xì)胞被MIF滯留于盆腔并活化，與MIF共同參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病。

子宮內(nèi)膜異位癥；腹腔液；巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子；速度

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）在育齡期女性的發(fā)病率約10%，臨床主要表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性加重盆腔痛、不孕，合并不孕的幾率可高達(dá)50%［1］。EMT雖為良性病變，卻表現(xiàn)出惡性腫瘤的生物學(xué)行為，如浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等［2］，EMT發(fā)病涉及激素、基因、免疫調(diào)控等多種因素［3］。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體腹腔免疫系統(tǒng)最為關(guān)鍵的細(xì)胞成分被發(fā)現(xiàn)在EMT患者的腹腔液中顯著增加［4］。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）被認(rèn)為是引起EMT患者腹腔液巨噬細(xì)胞聚集的重要因子之一，而一種與細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的因子—巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophagemigration inhibitory factor，MIF）在EMT患者腹腔液也顯著增加［5］。MIF是一種主要由活化T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，最初被發(fā)現(xiàn)可抑制體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的遷移，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其在血管生成、腫瘤形成和許多炎性、自身免疫性疾病中也發(fā)揮作用，是一種多功能細(xì)胞因子，許多研究表明MIF在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過(guò)程中扮演著重要角色［6-8］。對(duì)于MIF是否會(huì)通過(guò)降低腹腔液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率，從而使巨噬細(xì)胞滯留于腹腔，間接參與EMT患者腹腔中巨噬細(xì)胞的聚集過(guò)程，目前尚缺乏相關(guān)研究，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定腹腔液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率及MIF的濃度，分析腹MIF對(duì)巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率的影響，為MIF間接增加EMT患者腹腔液巨噬細(xì)胞數(shù)目提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2015-03～2015-10于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者41例，以其中術(shù)后病理證實(shí)為卵巢巧克力囊腫患者30例為實(shí)驗(yàn)組，平均年齡（34.5±8.1）歲，處于月經(jīng)周期增殖期者17例，分泌期13例。另選取同期我科收治的子宮肌瘤患者50例，以其中行腹腔鏡手術(shù)治療者30例為對(duì)照組，平均年齡（32.5± 9.6）歲，處于月經(jīng)周期增殖期者18例，分泌期12例。兩組患者年齡、身高、體重等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者均未絕經(jīng)，既往月經(jīng)規(guī)律；無(wú)婦科內(nèi)分泌、生殖道炎癥、免疫系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤史；術(shù)前6個(gè)月未使用任何激素類、抗生素及Gn-RH類似物治療；子宮內(nèi)膜無(wú)其他病理改變；無(wú)前次內(nèi)異癥手術(shù)史。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1腹腔液采集及處理采用腹腔鏡囊腫穿刺套針，術(shù)中進(jìn)入腹腔后未進(jìn)行任何操作時(shí)采集腹腔液5ml，剔除穿刺過(guò)程中被血液污染標(biāo)本。將采集的標(biāo)本置于冰盒轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。將1.0ml轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)菌EP管中，以5 000r/min速度4°C下離心10min，取上清液分裝置-80℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。余下腹腔液轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌管，以1 200r/min于4℃下離心5min，取2ml上清液置于培養(yǎng)皿，立即在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2觀察巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)使用萊卡光學(xué)倒置顯微鏡（LEICAdMI 4000B）在10×40倍視野（視野中包含3個(gè)及以上巨噬細(xì)胞）下觀察單細(xì)胞懸液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，使用Cellsens Standard軟件控制圖像采集儀器，使其每2min自動(dòng)采集1幀圖像，觀察時(shí)間共4h。

1.2.3計(jì)算巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率使用Image J圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析處理，通過(guò)Manual-Tracking插件對(duì)巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤并計(jì)算出其運(yùn)動(dòng)速率，取所有巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率的均值作為腹腔液巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率。

1.2.4測(cè)定MIF濃度腹腔液中MIF蛋白的濃度采用ELISA法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone Corp公司，操作嚴(yán)格遵循說(shuō)明書進(jìn)行，在450nm處測(cè)吸光值，取2次測(cè)量結(jié)果的均值作為MIF蛋白的濃度。1.2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行，腹腔液中巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率和MIF蛋白濃度測(cè)定結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后符合正態(tài)性分布，結(jié)果采用ˉx±s表示，獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率

與對(duì)照組相比，EMT患者腹腔液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率顯著降低（P＜0.05，見(jiàn)圖1），隨月經(jīng)周期改變略有變化，在月經(jīng)周期的增殖期，巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率要略低于分泌期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　兩組患者腹腔液中巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的速率Figure1　ThemigrationVelocities ofmAcrophages in peritoneal fluid in twogroups

2.2MIF蛋白濃度

與肌瘤患者相比，EMT患者腹腔液中MIF蛋白的濃度顯著增加（P＜0.005，見(jiàn)表1）。MIF蛋白濃度在增殖期略高分泌期，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　兩組患者腹腔液中MIF 水平比較Table1　Comparison of levels of MIF in peritoneal fluid between two groups

表1　兩組患者腹腔液中MIF 水平比較Table1　Comparison of levels of MIF in peritoneal fluid between two groups

與對(duì)照組比較，*P＜0.005

分組n 增殖期分泌期對(duì)照組30 3.53±0.47*3.17±0.89*EMT組30 8.79±0.92 7.46±1.31

2.3MIF蛋白濃度與巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率的關(guān)系

MIF蛋白濃度與巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率的相關(guān)性分析采用Pearson法，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示EMT患者腹腔液中MIF蛋白濃度和巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率之間呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)（r=-0.785，P＜0.01），對(duì)照組患者二者間的相關(guān)性分析顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r= -0.146，P＞0.05，見(jiàn)圖2）。

圖2　兩組患者腹腔液MIF蛋白濃度和巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率間的線性關(guān)系Figure2　Correlation between the level ofmIF and themigrationVelocity ofmacrophage in eachgroup

2.4單細(xì)胞懸液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)圖像

單細(xì)胞懸液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)圖像見(jiàn)圖3，EMT組中的巨噬細(xì)胞，多處于輕微晃動(dòng)狀態(tài)，細(xì)胞突起少或無(wú)，胞體缺乏極性，胞膜未見(jiàn)明顯偽足伸出，而子宮肌瘤組中的巨噬細(xì)胞則處于游走狀態(tài)，細(xì)胞突起多，極性明顯，胞膜可見(jiàn)明顯的偽足伸出。

圖3　巨噬細(xì)胞分別在0，20，40，60min時(shí)的運(yùn)動(dòng)圖像（×1000）Figure3　Macrophagemigration photos at 0，20，40，60min（×1 000）

3　討論

細(xì)胞遷移是多種生理病理過(guò)程的前提，傷口愈合、免疫、炎癥反應(yīng)、感染和癌癥轉(zhuǎn)移等生理現(xiàn)象均涉及細(xì)胞遷移。細(xì)胞的遷移受到細(xì)胞骨架重構(gòu)、黏著斑、胞外信號(hào)通路等多種過(guò)程的精細(xì)調(diào)控，其中Rho家族GTP酶（Rho family ofgTPases）在細(xì)胞遷移信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的協(xié)調(diào)作用［9，10］。MIF是目前發(fā)現(xiàn)可抑制巨噬細(xì)胞遷移的重要因子，Hoover等［11］研究發(fā)現(xiàn)MIF可通過(guò)失活Rho-GTP酶介導(dǎo)細(xì)胞遷移抑制，MIF可先激活隨后失活RhoA、Rac1、CDc42等分子，在缺乏MIF經(jīng)典受體CD74的情況下，MIF也可與替代受體CXCR4結(jié)合介導(dǎo)遷移抑制效應(yīng)［12］。CDC42屬于Rho家族小分子GTP酶，在細(xì)胞遷移過(guò)程中主要起確定方向和協(xié)調(diào)胞質(zhì)前部肌動(dòng)蛋白聚合的作用，CDC42受抑制后可導(dǎo)致細(xì)胞突起、胞體極性形成受阻，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移。這些均與我們實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所觀察到的EMT組巨噬細(xì)胞缺乏突起和極性，胞膜未見(jiàn)明顯偽足等結(jié)果一致。

MIF通過(guò)失活巨噬細(xì)胞胞膜上的Rho-GTP酶，從而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移抑制，使腹腔液中巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率顯著降低，巨噬細(xì)胞被滯留，是MIF參與EMT腹腔液巨噬細(xì)胞數(shù)目增加的間接證據(jù)，與MCP-1共同作用使巨噬細(xì)胞在腹腔液中聚集。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示MIF濃度與巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率間呈負(fù)相關(guān)，表明MIF濃度越高，巨噬細(xì)胞遷移被抑制越顯著，其被滯留的機(jī)率越高。MIF的濃度在月經(jīng)周期增殖期高于分泌期，故巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率在增殖期要略低于分泌期。既往研究表明腹腔液中巨噬細(xì)胞的數(shù)目隨月經(jīng)周期的改變會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化［5］，經(jīng)期過(guò)后其數(shù)目上升，也就是說(shuō)增殖期時(shí)腹腔液中的巨噬細(xì)胞數(shù)目要高于分泌期，與巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率變化的時(shí)間呈一致性。這些結(jié)果間接表明MIF抑制巨噬細(xì)胞的遷移，共同參與腹腔液巨噬細(xì)胞的聚集，在EMT的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示在月經(jīng)周期的增殖期腹腔液中MIF的濃度略高于分泌期，而美國(guó)學(xué)者M(jìn)ahutte等［13］研究結(jié)果顯示MIF的濃度在分泌期會(huì)略高于增殖期。除試劑用品差異外，二者在實(shí)驗(yàn)方法、標(biāo)本采集上基本一致，故可除外實(shí)驗(yàn)方法學(xué)差異。2010 年Lin等［14］采用FQ-PCR法定量MIF在內(nèi)膜組織mRNA的表達(dá)及免疫組化法測(cè)定MIF蛋白，結(jié)果表明MIF蛋白和mRNA的表達(dá)在增殖期高于分泌期，此外MIF的mRNA在不同月經(jīng)周期的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。近來(lái)研究也表明MIF基因表達(dá)的多態(tài)性是東、西方人群某些疾病患病率及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)差異的原因之一［15］，這提示EMT患者的MIF基因表達(dá)也可能存在東、西方差異，這可能是本研究結(jié)果與Mahutte等［13］結(jié)論矛盾的主要原因。此外，研究表明MIF可活化子宮內(nèi)膜異位病灶處的芳香化酶促進(jìn)雌激素高表達(dá)，而雌激素也可促進(jìn)MIF表達(dá)，二者間形成一個(gè)正反饋通路。在增殖期雌激素水平增加，在雌激素的作用下MIF表達(dá)增加，也可能使其在增殖期的濃度高于分泌期。此外，MIF還具有促血管生成、活化巨噬細(xì)胞特性，EMT患者腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集及活化在EMT發(fā)病過(guò)程中起重要作用，活化的巨噬細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)，其分泌的大量促炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子（VEGF、TNF、IL、MIF等）均被發(fā)現(xiàn)在EMT發(fā)病中扮演不同的角色，這些因子和MIF及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在EMs的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用［16］。關(guān)于MIF在EMT發(fā)病中的作用及其臨床意義仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，MIF可能通過(guò)介導(dǎo)Rho家族GTP酶失活進(jìn)而發(fā)揮巨噬細(xì)胞遷移抑制作用，間接參與EMT盆腔巨噬細(xì)胞的聚集。MIF還可活化滯留的巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞與MIF共同參與EMT發(fā)病的病理生理過(guò)程。

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M acrophagem igration inhibitor factordecreases themacrophagem igrationVelocity in peritoneal fluid of patients with endometriosis

LIJian，HU Yuhong*，ZHANG Yan（Departmentofgynecology and Obstetrics，F(xiàn)irst Affiliatedhospital of JiamusiUniversity，Jiamusi 154000，China；*Corresponding author，E-mail:liam jiam@gmail.com）

Objective To explore the effectofmacrophagemigration inhibitor factor（MIF）onmacrophagemotion in peritoneal fluid of patientswith endometriosis.Methods Thirty patientswith endometriosis and thirty patientswith uterinemyoma（controlgroup）were enrolled in First Affiliatedhospital of JiamusiUniversity frommArch to October2015.Cell sense standard softwarewas used to observemAcrophagemovement，and the cellmigration image wasrecorded every 2m in for 4h in total.MacrophagemotionVelocity was calculated using Image Jsoftware.ELISA was used tomeasure the peritoneal fluidmIF.Results ThemigrationVelocities ofmacrophages in peritoneal fluid of patientswith endometriosisweremarkedlydecreased compared with patientswith uterinemyoma（P＜0.05）.MigrationVelocities were alsohigher in secretory phase patients than in proliferative phase patients，but thedifference was not statisticallydifferent（P＞0.05）.The concentration ofmIF in the peritoneal fluid washigher in patientswith endometriosis than that in women with uterinemyoma（P＜0.001）.ThemigrationVelocity ofmacrophagewas negatively correlated with the level ofMIF in peritoneal fluid of patientswith endometriosis（P＜0.01）.Conclusion Theresult suggestsmIF abnormal expressionmAy inhibit themAcrophagemigration，which is indirectly involved in themAcrophages accumulation in peritoneal fluid of patients with EMT.Macrophages areretained and activated bymIF，andmIF and the activatedmAcrophages contribute to thedevelopment of endometriosis.

endometriosis；peritoneal fluid；macrophagemigration inhibitory factor；velocity

R711.71

A

1007-6611（2016）04-0373-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.017

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目（LM-2015-020；佳木斯大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（SZ-2014-008）

李建，男，1987-10生，在讀碩士，E-mail:451061134@qq.com

2016-01-28