LEF1在卵巢上皮癌中的表達(dá)及意義

郭玉霞，馬利國(guó)，陳遞林，李明娥，石麗云，葉芷芬，鄭繪霞，梁　鋼（深圳市人民醫(yī)院婦科，深圳58000；山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科）

LEF1在卵巢上皮癌中的表達(dá)及意義

郭玉霞1，馬利國(guó)1，陳遞林1，李明娥1，石麗云1，葉芷芬1，鄭繪霞2，梁鋼2（1深圳市人民醫(yī)院婦科，深圳518000；2山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科）

目的研究淋巴增強(qiáng)因子1（LEF1）在卵巢上皮癌腫瘤組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法收集手術(shù)切除的卵巢上皮腫瘤新鮮標(biāo)本:卵巢良性上皮腫瘤24例，交界性上皮腫瘤17例，惡性上皮腫瘤35例；另選取因子宮肌腺瘤、乳腺癌、宮頸癌疾病切除的正常卵巢組織13例作為對(duì)照。提取組織蛋白，采用Western blot檢測(cè)不同組織LEF1的表達(dá)情況，分析惡性上皮腫瘤組織中LEF1的表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度等臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果與子宮良性疾病、良性、交界性卵巢上皮腫瘤相比，惡性上皮腫瘤中LEF1的表達(dá)顯著增高（P＜0.05），良性及交界性腫瘤與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。在卵巢惡性上皮腫瘤中，LEF1在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)高于漿液性癌及黏液性癌（P＜0.05），漿液性癌與黏液性癌組織中LEF1的表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例腫瘤組織中的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例（P＜0.05）；在FIGO分期Ⅲ期+Ⅳ期病例腫瘤組織中的表達(dá)高于Ⅰ期+Ⅱ期病例（P＜0.05）；LEF1在不同年齡及不同分化程度腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與原發(fā)灶相比，LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論LEF1在卵巢上皮癌組織中表達(dá)上調(diào)，與組織類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，可能參與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的病理過(guò)程。

卵巢上皮腫瘤；淋巴增強(qiáng)因子1；蛋白印跡法

卵巢上皮性腫瘤是最常見(jiàn)的卵巢腫瘤，約占所有卵巢腫瘤的90%，從生物學(xué)行為上分為良性、交界性及惡性（卵巢癌）三類(lèi)。卵巢癌惡性程度高，早期起病隱匿，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首［1］。淋巴增強(qiáng)因子1（lymphoid enhancer factor-1，LEF1）屬T細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄家族，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的重要效應(yīng)分子［2］，近年來(lái)研究表明，LEF1在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］。本實(shí)驗(yàn)初步觀察LEF1在卵巢良性、交界性及惡性上皮性腫瘤中的表達(dá)情況，為卵巢上皮腫瘤的研究提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　對(duì)象與方法

1.1臨床資料

收集深圳市人民醫(yī)院及山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2014-05～2015-05間手術(shù)切除的卵巢上皮腫瘤組織新鮮標(biāo)本，對(duì)于大體取材所見(jiàn)高度可疑的盆/腹腔播散病灶或可疑轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，在不影響病理診斷的前提下，留取少許播散病灶及淋巴結(jié)組織（同一塊組織如病理診斷證實(shí)非轉(zhuǎn)移灶或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則放棄留存，全部用于病理診斷，以免影響臨床分期），所有標(biāo)本置于低溫冰箱保存。所有患者均為初發(fā)，術(shù)前未經(jīng)任何放化療，術(shù)后經(jīng)病理診斷確診。其中:卵巢良性上皮腫瘤24例，平均年齡（43.3±9.9）歲；交界性上皮腫瘤17例，平均年齡（46.4±12.2）歲；惡性上皮腫瘤35例（漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌），平均年齡（45.2±11.8）歲；另選取因子宮肌腺瘤、乳腺癌、宮頸癌切除的正常卵巢組織13例作為對(duì)照，平均年齡（47.8±9.7）歲。該研究方案經(jīng)倫理審查通過(guò)。

1.2方法

采用Western blot檢測(cè)良性、交界性、惡性卵巢腫瘤組織，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織，盆/腹腔轉(zhuǎn)移灶及正常對(duì)照組織中LEF1的表達(dá)情況，分析惡性上皮腫瘤組織中LEF1的表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度等臨床病理特征之間的關(guān)系。

1.3主要試劑

WIP組織裂解液（北京賽馳生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；彩色預(yù)染中分子蛋白及硝酸纖維素薄膜（武漢博士德生物工程有限公司）；LEF1兔抗鼠抗體（武漢AB-clonal公司）；GAPDH抗體及鼠抗兔IgG-HRP（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

①提取組織總蛋白:稱(chēng)取200mg各組織，剪碎后加入WIP組織裂解液，于冰上提取總蛋白后檢測(cè)595nm波長(zhǎng)的吸光度A值，計(jì)算蛋白含量:蛋白濃度=測(cè)定管吸光度A1/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度A2×標(biāo)準(zhǔn)管濃度。②SDS-PAGE凝膠電泳:配制10%分離膠及8%濃縮膠，加入各組蛋白樣品及蛋白分子量marker。預(yù)電泳65V，30min后120V電泳60min。③轉(zhuǎn)膜:制備轉(zhuǎn)膜用“三明治”，正極、纖維墊、濾紙、凝膠、NC膜、濾紙、纖維墊、負(fù)極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，電壓100V，電流350mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間約30min。④封閉:將裁好的膜置于5%蛋白干粉封閉液中，室溫輕搖1h。⑤顯色:滴加LEF1一抗（ABclonal公司，濃度1∶500）中，4℃冰箱過(guò)夜反應(yīng)。滴加二抗（濃度1∶3 000）中，室溫輕搖1h。采用ECL電化學(xué)發(fā)光法顯色，成像儀下曝光攝片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析法，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2　結(jié)果

2.1LEF1在對(duì)照組、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，LEF1在37 kD處出現(xiàn)顯影條帶，GAPDH在36 kD處出現(xiàn)顯影條帶（見(jiàn)圖1），經(jīng)灰度分析:LEF1在對(duì)照組、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.773，P=0.000，見(jiàn)表1）。與對(duì)照組相比，良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中LEF1的表達(dá)逐漸增高，其中惡性卵巢上皮腫瘤組織中LEF1的表達(dá)顯著增高（P=0.000），良性及交界性腫瘤與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（對(duì)照組vs良性組，P=0.427；對(duì)照組vs交界性組，P=0.099）。與良性及交界性腫瘤相比，惡性上皮腫瘤組織中LEF1的表達(dá)顯著增高（惡性組vs良性組，P=0.000；惡性組vs交界性組，P=0.004）。

2.2LEF1與惡性卵巢上皮腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系

在卵巢惡性上皮腫瘤中，LEF1在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)高于漿液性癌及黏液性癌（F= 7.648，P=0.005），漿液性癌與黏液性癌組織中LEF1的表達(dá)無(wú)顯著差異（P=0.502）；LEF1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例腫瘤組織中的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例（P=0.011），在FIGO分期Ⅲ期+Ⅳ期病例腫瘤組織中的表達(dá)達(dá)高于Ⅰ期+Ⅱ期病例（P=0.002）；LEF1在不同年齡（P=0.896）及分化程度（P=0.128）腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異。

2.3LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織、盆/腹腔轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶中的表達(dá)

LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織、腹腔轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶中的相對(duì)表達(dá)量依次為0.715 6±0.084 9，0.585 0 ±0.0802，0.5245±0.0728。與原發(fā)灶相比，LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），腹腔轉(zhuǎn)移灶組織中LEF1的表達(dá)略有增高，但差異不明顯（P=0.202，見(jiàn)圖2）。

圖1　LEF1在對(duì)照、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的表達(dá)Figure1　Expression of LEF1 in benign ovarian epithelial tumor tissues，borderline epithelial tumor tissues，malignant epithelial tumor tissues and benign control tissues by Western blot

表1　LEF1在對(duì)照、良性、交界性及惡性卵巢上皮腫瘤中的表達(dá)Table1　Expression of LEF1 in benign ovarian epithelial tumor tissues，borderline epithelial tumor tissues，malignant epithelial tumor tissues and benign control tissues

表2　LEF1與惡性卵巢上皮腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系Table2　relationship between LEF1 expression and clinicopathological features inmAlignant epithelial tumor

圖2　LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織、盆腔轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶中的表達(dá)Figure2　Expression of LEF1 in lymph nodemetastasis，pelvicmetastasis，primary tumor

3　討論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活將導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變和人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生［6，7］。LEF1是一個(gè)具有雙向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與Wnt/β-catenin下游相關(guān)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它一方面能夠與β-catenin結(jié)合，形成β-catenin/LEF復(fù)合物，從而促進(jìn)Wnt信號(hào)通路下游靶基因c-myc、Cyclind1等的表達(dá)，另一方面它能夠募集Groucho家族的協(xié)同抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄執(zhí)行，具有Wnt信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控作用［8，9］。LEF-1蛋白在多種組織的發(fā)生中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)和功能異?？蓪?dǎo)致組織的發(fā)育失常。正常情況下，LEF-1在許多動(dòng)物細(xì)胞的胚胎組織中是高表達(dá)的，隨著個(gè)體出生，其表達(dá)量會(huì)迅速下降，研究報(bào)道顯示，LEF1在多種腫瘤中高表達(dá)［10，11］，在這些腫瘤中，Wnt信號(hào)是亢進(jìn)和失控的，Wnt信號(hào)通路中胞質(zhì)集β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與LEF/TCF結(jié)合而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄是惡性腫瘤最重要的特征［12，13］。

本實(shí)驗(yàn)研究了LEF1在正常卵巢、良性、交界性及惡性上皮腫瘤中的表達(dá)情況，蛋白印跡定量分析結(jié)果顯示:LEF1的表達(dá)水平在卵巢癌組織中顯著增高，雖然在正常卵巢組織、良性病變及交界性病變之間的差異不明顯，但從整體水平上而言呈逐漸增高的趨勢(shì)，提示LEF1可能參與了從正常卵巢組織到卵巢癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。進(jìn)一步，我們分析了在卵巢癌組織中LEF1的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，LEF1在不同年齡及不同分化程度腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異，但在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)明顯高于漿液性癌及黏液性癌，這提示我們:①不同分化方向的卵巢上皮惡性腫瘤其發(fā)生的分子機(jī)制不同。②LEF1參與的分子生物事件在卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌中可能更容易發(fā)生，或者作用更為顯著。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期是影響卵巢癌患者預(yù)后的重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)，與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期Ⅰ期+Ⅱ期病例相比，LEF1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ期+Ⅳ期病例腫瘤組織中的表達(dá)明顯增高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，我們分析了LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織、盆/腹腔轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LEF1在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)比原發(fā)灶顯著增高，說(shuō)明LEF1可能參與了卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移等疾病進(jìn)展過(guò)程。盆/腹腔轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)雖然略有增高，但差異不明顯，可能是由于:①盆/腹腔轉(zhuǎn)移灶來(lái)源于脫落播散的腫瘤細(xì)胞，而非直接侵襲所致；②入組樣本量較少，差異不明顯。

綜上，LEF1在卵巢上皮癌組織中表達(dá)上調(diào)，與組織類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，可能參與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的病理過(guò)程。LEF1在卵巢癌中作用的具體分子機(jī)制尚待功能性研究進(jìn)一步證實(shí)。

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Expression and significance of LEF1 in epithelial ovarian carcinoma

GUO Yuxia1，MA Liguo1，CHENdilin1，LIMinge1，SHI Liyun1，YE Zhifen1，ZHENGhuixia2，LIANGgang2（1department ofgynecology，Shenzhen People'sHospital，Shenzhen 518000，China；2Department of Pathology，F(xiàn)irst Clinicalmedical College，Shanximedical University）

Objective To explore the expression and significance of lymphoid enhancer factor-1（LEF1）in tissues ofhuman epithelial ovarian carcinoma.Methods The expression of LEF1 in 24 cases of benign ovarian epithelial tumor tissues，17 cases of borderline epithelial tumor tissues，35 cases ofmalignantepithelial tumor tissues and 13 control tissueswasdetected byWestern blot.The correlation between LEF1 and clinicopathologicaldata was analyzed inmalignant epithelial tumor patients.Results The expression of LEF1 inmAlignant epithelial tumors was significantlyhigher than that in control tissues and benign ovarian epithelial tumor tissues and borderline ovarian tumor tissues（P＜0.05），but therewas no statisticaldifference between control tissues and benign ovarian epithelial tumor tissues，borderline ovarian tumor tissues（P＞0.05）.LEF1 expression in endometrial adenocarcinomawashigher than that in serous andmucinous carcinoma（P＜0.05），higher in lymph nodemetastasis tumor tissues than that in non-lymph nodemetastasis tissues（P＜0.05），higher in FIGO stageⅢ+Ⅳcases than that of stageⅠ+Ⅱ（P＜0.05），but the expression of LEF1 indifferent age anddifferentdegree ofdifferentiation of tumor tissues showed no significantdifference（P＞0.05）.Compared with the primary tumor，LEF1 expression inmetastatic lymph node tissuewas significantly increased（P＜0.05）.Conclusion LEF1 is up-regulated inmalignant ovarian epithelial tumor，andrelated withhistological type，lymph nodemetastasis and clinical stage，which indicates that itmay be involved in the pathological processes of invasion andmetastasis.

ovarian epithelial tumor；lymphoid enhancer factor 1；Western blot

R737.31

A

1007-6611（2016）04-0325-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.006

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（基礎(chǔ)研究）（JCYJ20140416122812029）

郭玉霞，女，1962-12生，本科，副主任醫(yī)師，E-mail:gyx_szsrmyy@sina.com

2016-01-15