油菜開花期QTL定位及與粒重的遺傳關聯(lián)性

黃吉祥，熊化鑫，2，潘 兵，3，倪西源，張曉玉，趙堅義

（1浙江省農業(yè)科學院作物與核技術利用研究所/植物有害生物防控國家重點實驗室省部共建培育基地，杭州 310021；2浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321000；3浙江大學農業(yè)與生物技術學院，杭州 310058）

油菜開花期QTL定位及與粒重的遺傳關聯(lián)性

黃吉祥1，熊化鑫1，2，潘 兵1，3，倪西源1，張曉玉1，趙堅義1

（1浙江省農業(yè)科學院作物與核技術利用研究所/植物有害生物防控國家重點實驗室省部共建培育基地，杭州 310021；2浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321000；3浙江大學農業(yè)與生物技術學院，杭州 310058）

【目的】明確中國和歐洲油菜開花期主控位點及其對粒重的影響，為早熟油菜品種選育提供科學依據。【方法】以歐洲冬油菜Sollux和中國品種高油605的選系（Gaoyou）雜交F1經小孢子培養(yǎng)產生的DH群體為材料，采用7年9種環(huán)境下的開花期表型數(shù)據和新版SG圖譜定位開花期QTL，并采用條件遺傳學和QTL分析相結合的條件QTL定位方法，解析開花期對千粒重QTL的影響，最后對各20個極端開花期株系的基因型和表現(xiàn)型進行性狀-標記的符合度測定，為標記篩選用于輔助選育提供依據?！窘Y果】應用WinQTLCart 2.5復合區(qū)間作圖法，共檢測到7個在3種以上環(huán)境中穩(wěn)定表達的控制開花QTL，加性效應值在0.58—3.85 d，解釋了表型總變異的84%。8對上位性QTL效應總和為加性總效應的41.8%。QTL與環(huán)境互作效應只在少數(shù)位點和個別環(huán)境中顯著。在3個主效QTL峰值或相近位置上定位了4個在擬南芥中調控開花的關鍵基因FT、API、FLC和FY的6個同源拷貝，為發(fā)掘控制這些QTL的候選基因提供了有價值的參考信息。條件QTL分析表明，在4個增重效應均來自Gaoyou的千粒重QTL位點（qSWA2、qSWA3、qSWA4和qSWC2），大粒等位基因效應可能與開花早、籽粒灌漿期長有關。通過選擇這些位點的早開花標記基因型有望同時提高種子千粒重，這也部分給出了開花期與千粒重之間極顯著負相關的遺傳解釋，但2個粒重主效位點（qSWA7和qSWC8）的遺傳效應不受開花期影響。根據SG群體極端開花期株系在3個效應值最大的QTL（qFTA2、qFTC2和qFTC6）區(qū)域標記基因型和開花期表現(xiàn)型的關聯(lián)分析，篩選獲得6個高質量、高吻合度的共顯性標記推薦育種應用。qFTA2位點，標記輔助準確率為70%-80%；qFTC2 和qFTC6位點的選擇效率達到80%-100%?；蛐徒M配分析顯示，聚合qFTA2、qFTC2和qFTC6的早開花等位基因，可顯著提早開花期，同步增加千粒重但不影響含油量和角果粒數(shù)?！窘Y論】7個QTL均顯示早開花等位基因來自中國親本。擬南芥中調控開花關鍵基因FT、API、FLC和FY的6個同源拷貝定位到3個主效QTL峰值位置。開花遲、早顯著影響4個千粒重QTL位點，但2個最重要的粒重位點（qSWA7和qSWC8）不受影響；3個主效QTL（qFTA2、qFTC2和qFTC6）的6個共顯性標記可用于早熟基因的轉育和早熟材料的篩選。

甘藍型油菜；QTL定位；開花期；千粒重；條件QTL定位

0　引言

【研究意義】油菜開花期與籽粒成熟期高度相關［1］，育種中通常將其作為選擇早熟性的重要指標［2］。開花時間是植物在自然演化過程中對當?shù)丨h(huán)境的一種適應，關于油菜作物開花基因的研究，目前多數(shù)仍停留在QTL和生物信息學分析層面。因此，進一步對主效開花期QTL作精細定位，結合擬南芥基因庫信息資源、圖位克隆基因、發(fā)展基因標記或緊密連鎖分子標記用于育種研究，為創(chuàng)制新的親本資源提供依據?！厩叭搜芯窟M展】DETJEN等［3］和DICKSON等［4］通過對蕓薹屬作物甘藍和花椰菜開花性狀進行遺傳分析，估算遺傳力、基因效應及基因數(shù)目。20世紀90年代后，隨著分子生物學理論和技術的發(fā)展，從 QTL （quantitative trait loci）水平上對油菜開花期進行深入的解析。1995年，TEUTONICO等［5］首先在白菜LG2 （A2）和LG8（A8）連鎖群上定位到2個主效開花期QTL。此后，F(xiàn)ERREIRA等［6］以甘藍型冬油菜和春油菜雜交F1衍生的DH群體為材料，在A9、C2、C6上定位到3個主效QTL，其中A9連鎖群上的QTL貢獻率達到28%。接著，OSBORN等［7］在此基礎上通過添加大量分子標記，重新定位QTL，使得A9上的QTL貢獻率由28%增加到46.9%，A9、C2和C6上3個QTL解釋群體遺傳總變異的 63.5%。BUTRUILLE等［8］1999年利用冬、春油菜間雜交和回交群體，在連鎖群A2、A3、A7、A8、A9、C2和C5上定位到開花期QTL，總貢獻率達到59%。ZHAO等［1］2005年用德國品種 Sollux和中國油菜 Gaoyou為親本構建的SG-DH群體，在德國、中國杭州和西安3種環(huán)境下定位分析開花期性狀，檢測到7個主效QTL，分別位于A1、A2、C1、C2、C4、C6和C9上。其中，A1、C2 和C6相同位點上檢測到控制成熟期QTL。LONG等［9］于2007年利用歐洲冬油菜Tapidor和中國品種寧油7號構建的TN群體，在中國冬油菜和春油菜區(qū)共11種環(huán)境下進行定位試驗，發(fā)現(xiàn)36個SL-QTL（顯著），遍布油菜大多數(shù)連鎖群，其中A10和C6連鎖群上獲得春、冬油菜環(huán)境中效應值最大、貢獻率分別達到52% 和26%—52%的主效QTL。除此，蔡長春等［10］在油菜A4和C6上定位到貢獻率達到48.0%和20.6%的QTL。近期，XU等［11］利用60K油菜芯片對523個品種進行SNP位點多態(tài)性檢測，并對開花期性狀進行全基因組關聯(lián)分析，在A2、A4、A10、C3和C5上關聯(lián)到在多環(huán)境中表達的控制開花期QTL。WE等［12］在C2上定位到貢獻率達到20%以上的主效開花QTL。NELSON等［13］在溫、光控制條件下研究油菜開花性狀，在A2、A7和C3上定位到控制開花主效QTL，解釋群體遺傳變異的57.7%?？傊刂朴筒碎_花遲早的共性基因位點主要分布在A2、A3、A8、A9、A10以及C2 和C6染色體上。在模式植物擬南芥中，開花基因和調控網絡的研究很清楚［14-15］。據統(tǒng)計，超過 300個基因參與擬南芥開花的調控網絡［16］。近年來，通過基因組DNA序列線性比對和QTL位置的比較分析，在油菜共性開花期主效 QTL峰值或附近位置均搜索到一系列擬南芥同源開花關鍵基因［7，9，17］，作為多倍體的油菜作物，其開花期的控制機制相對擬南芥更為復雜，因而QTL數(shù)量更多，互作關系更趨網狀結構。迄今為止，油菜 19條連鎖群上幾乎都檢測到控制開花期的QTL。HOU等［18］首次對甘藍型油菜A10連鎖群上的開花期主效QTL進行圖為克隆，精細定位至80 kb區(qū)間，確定含F(xiàn)LC同源基因，發(fā)現(xiàn)上游啟動子區(qū)域一個621 bp的插入與油菜冬性特征有關。據報道，油菜開花期與產量性狀有較大關聯(lián)，每果粒數(shù)與開花遲、早顯著正相關，與千粒重顯著負相關［19-20］，開花期平均相差約4 d即可導致千粒重顯著增減［20］。油菜千粒重是產量形成中最重要的構成因素之一，是一個典型的數(shù)量性狀，19條連鎖群上都檢測到千粒重QTL，其中分布在A1、A2、A5、A7、C2、C3、C4、C7、C8 和C9上的QTL被多次報道［21-24］。LIU等［25］通過圖位克隆，成功獲得控制 A9連鎖群上主效粒重 QTL的功能基因?！颈狙芯壳腥朦c】近20年中，針對油菜開花期性狀，已進行了大量的QTL定位研究，通過不同方法和不同研究材料獲得一系列共性主效QTL，但從QTL水平上解析開花期對產量構成性狀的影響和相互關系則尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用添加了372個標記的新版SG圖譜［26］和新增6個試驗共9種環(huán)境的開花期表型數(shù)據，重新對SG群體進行開花期定位分析；同時利用條件QTL分析方法研究開花期對千粒重QTL的影響，為早熟油菜品種選育提供科學依據。

1　材料與方法

1.1 研究材料

以先前構建的歐洲油菜 Sollux和中國材料Gaoyou雜交F1產生的282個DH株系為材料［2］。Sollux為典型歐洲冬油菜，而 Gaoyou是浙江大學育成的早熟品種高油605的選系，2個品種開花期差異近一個月。QTL定位圖譜包含481個分子標記，覆蓋甘藍型油菜基因組19條連鎖群，總長1 948.6 cM，標記間平均距離4.05 cM［27］。

1.2 田間試驗

田間試驗包括2001年中國杭州、西安以及德國哥廷根的Reinshof 3個試驗點［2］以及2004、2005、2007、2008、2009和2013年杭州（浙江省農業(yè)科學院試驗農場）共9個環(huán)境試驗結果。試驗采用完全隨機排列，2次重復。每株系種植2行，行長2.5—3.0 m，行距0.33 m，株距0.12 m。

1.3 開花期記載和千粒重測定

親本和DH株系的開花期記載以小區(qū)25%植株開第一朵花為標準，數(shù)據分析時換算成播種期到開花期的天數(shù)，取2次重復觀察值平均值。千粒重用BS 124S型電子天平稱量，隨機抽取小區(qū)混收種子測定，精確到小數(shù)點后3位，每樣品隨機稱量3次，重復間相差不超過0.02 g。

1.4 表型數(shù)據處理及條件效應預測

DH群體性狀表型統(tǒng)計以及性狀間相關系數(shù)采用SPSS17.0軟件。條件效應值的獲取采用ZHU［27］提出的基于混合線性模型的數(shù)量性狀條件分析方法，YT1/T2表示在消除性狀2的表型變異后性狀1的表型值，如YSW/FT指剔除開花期影響后千粒重（SW）的表型值。

1.5 QTL定位分析

首先運用WinQTLCart 2.5復合區(qū)間作圖法［28］，對開花期表型值按單環(huán)境進行全基因組 QTL掃描，以LOD＞2.5作為閥值判斷QTL是否真實存在。在每個連鎖群上間隔1 cM檢測QTL存在的可能性，確定各性狀QTL的數(shù)目及其連鎖圖上QTL的置信區(qū)間、加性效應值以及對性狀表型的貢獻率。若不同環(huán)境中檢測到的QTL置信區(qū)間（1-LOD）內有重疊區(qū)域，則認為是同一個QTL，重疊部分被定義為這個QTL的置信區(qū)間。進一步采用QTLNetwork 2.0軟件［29］，對9種環(huán)境下的表型數(shù)據進行聯(lián)合定位分析，估測QTL與環(huán)境的互作以及控制開花期基因位點之間的上位性效應。QTL的顯著性概率值為0.05，通過1 000次排列，檢驗推斷QTL及成對推斷QTL的效應顯著性，用檢驗出的顯著QTL構建QTL全模型，進一步對模型進行選擇，剔除可能的假陽性QTL，用基于Gibbs抽樣的Bayesian方法［30］估計QTL及其與環(huán)境互作的各項遺傳效應值。

QTL命名采用q+性狀英文縮寫開花期FT（千粒重SW）+所在連鎖群代號+QTL個數(shù)。如在油菜第2染色體上第1個開花期QTL，命名為：qFTA2-1。

1.6 候選基因定位

提取SG-DH群體雙親Sollux和Gaoyou抽苔現(xiàn)蕾期DNA，對其進行二代測序，獲得現(xiàn)蕾期轉錄組數(shù)據。根據CHALHOUB等［31］近期發(fā)表的油菜基因組信息，針對SG群體控制開花期主效QTL區(qū)間標記信息，通過分析比對，找出所有表達基因，將這些基因與NCBI上報道的擬南芥開花相關基因比對（P＜0.01），獲得相關的候選基因并確定候選基因在連鎖群上的物理位置。

2　結果

2.1 親本及DH群體開花期表型變異

通過對親本和DH群體開花期表型的統(tǒng)計（表1），2個親本在9種不同環(huán)境下的開花期相差17—30 d，平均相差24 d；DH群體株系播種至開花天數(shù)9種環(huán)境平均最大值196 d，和Sollux相同，最小值170 d，較Gaoyou早2 d，沒有明顯的超雙親現(xiàn)象，說明控制遲和早開花的等位基因主要分別來自 Sollux和Gaoyou。

表1　DH群體開花期9種環(huán)境下的表型變異Table 1 Phenotypic variation of flowering time in SG-DH population across nine environments

2.2 開花期QTL分析

利用WinQTLCart2.5軟件對9種環(huán)境下的開花期進行QTL掃描，共檢測到在3種以上環(huán)境中穩(wěn)定表達的QTL有7個（表2），分布在9條不同的染色體（qFTA2、qFTA3、qFTA4、qFTA10、qFTC2、qFTC6 和 qFTC8）上，平均加性效應值 0.98—2.93。qFTC2 和 qFTC6在 9種環(huán)境中穩(wěn)定表達，峰值集中，平均LOD值達到17.3和15.4（圖1-a—圖1-b），平均遺傳貢獻率分別達19.1%和14.9%。qFTA2也在7種環(huán)境中被檢測到，平均加性效應值為1.52（圖1-c），貢獻率為7.9%。qFTA3和qFTA10分別在6和5種環(huán)境中顯著。所有7個QTL位點，其遺傳效應均表現(xiàn)為Sollux等位基因使開花延遲而 Gaoyou等位基因致提早開花。當7個QTL位點分別聚合Sollux和Gaoyou等位基因時，可致開花期相差21.8 d，解釋群體內遺傳總變異的約84%（DH群體內最遲和最早開花的株系相差26 d）。通過對雙親花蕾轉錄組測序、基因表達分析和序列比對，在3個主效QTL（qFTA2、qFTC2 和qFTC6）區(qū)間，發(fā)現(xiàn)與擬南芥中控制開花關鍵基因FLOWERING LOCUS T（FT）的2個同源拷貝BnFT-A2 和 BnFT-C6；春化途徑中關鍵基因 FLOWERING LOCUS C（FLC）以及與FLC相關的酵母多聚腺苷酸化因子pfs2p的同源基因BnFLC-C2和BnFY-C2；還有 APETALA 1-1（AP1-1）和 AP1-2的同源基因BnAP1-C6a和BnAP1-C6b分別位于SG群體中最重要的3個QTL的峰值或附近位置。根據這些同源基因的油菜序列設計標記，已將這6個基因拷貝定位在相應的QTL峰值或相近位置上（圖1）

圖1　SG-DH群體在9種環(huán)境中檢測到的3個主效開花期QTL qFTA2（a）， qFTC2（b）和qFTC6（c）Fig. 1 Three major QTL of flowering time qFTA2（a）， qFTC2（b） and qFTC6（c）from 9 environments in SG DH population

2.3 開花期QTL的上位性及與環(huán)境的互作

為解析油菜開花期QTL之間以及QTL與環(huán)境之間的互作關系，進一步采用QTLnetwork2.0軟件對9種環(huán)境下的開花期進行 QTL聯(lián)合定位，共檢測到 8對顯著的上位性QTL，5對發(fā)生在QTL×QTL之間、2對是QTL×標記位點互作、只有1對是標記位點間互作（表3）。除1對A基因組間和1對C基因組間互作外，其余6對均發(fā)生在A和C基因組之間；所有上位性QTL的效應值為負值，說明雙親在這些QTL或標記位點之間雜結合時會相對延遲開花；上位性QTL的效應值在0.32—1.53。總和是加性總效應的41.8%。

結果顯示，開花期QTL受環(huán)境影響較小，互作（QE）只發(fā)生在個別環(huán)境的極少數(shù) QTL位點。qFTA4在2001德國和2012年杭州環(huán)境中各出現(xiàn)效應值方向相反的 QE互作，效應值分別是 0.8和-0.40。qFTA10在2001的西安和德國環(huán)境中存在顯著的QE互作，效應值分別為-0.46和0.41，其余QTL未檢測到顯著的 QE互作，上位性 QTL只在德國Reinshof 環(huán)境下，ZAAS1029/qFTC2位點檢測到微效的AAE互作。

表2　SG-DH群體在9種環(huán)境下的開花期QTL信息Table 2 QTL information of flowering time in SG population over 9 environments

表3　SG-DH群體中開花期的上位性效應Table 3 Epistatic interactions estimated from SG-DH population for flowering time

2.4 開花期與種子千粒重的遺傳關聯(lián)

選用9種環(huán)境下SG群體282個株系開花期平均值（播種到開花天數(shù)）分別與相應的含油量、千粒重、角果粒數(shù)和角果長度均值進行相關分析，結果是開花期與含油量、角果長度和角果粒數(shù)的相關系數(shù)分別為0.018、0.056和0.008，基本無相關，但和千粒重的相關系數(shù)達到-0.403，極顯著負相關（P＜0.001）。說明開花早的材料可能通過較長的籽粒灌漿周期增加千粒重。為了揭示開花期對千粒重QTL的影響，根據條件QTL定位方法，用9種環(huán)境下的平均千粒重和排除開花期變異后的條件千粒重平均值進行條件前、后的QTL分析和比較（表4），當排除開花期條件因素后，在10個千粒重QTL中，6個（qSWA1、qSWA7、qSWC7、qSWC1-2、qSWC1-1和qSWC8）基本保持效應值穩(wěn)定，除qSWC1-1和qSWC1-2顯著性保持不變和略有下降外、其余4個QTL LOD值均有上升。6個QTL位點中，4個增加粒重等位基因來自歐洲親本 Sollux；值得注意的是，中國親本Gaoyou等位基因提高粒重的4 個QTL（qSWA2、qSWA3、qSWA4和qSWC2），當給定群體株系間開花期無變化時，均不存在顯著的QTL，說明開花期對種子千粒重在這些QTL位點上有顯著影響。qSWA7和qSWC8（圖2-a—圖2-b）是2個顯著性最高效應值最大的粒重QTL，顯然開花遲、早對其未發(fā)生大的影響；qSWC2大粒等位基因來自Gaoyou，是受到開花期調控的典型基因位點，假定以開花期無變化為條件時，LOD值由條件前的5.27降至1左右，qSWC2SW|FT效應不顯著（圖2-c）。開花期對qSWC7的影響則表現(xiàn)另一種調控模式，非條件qSWC7 的LOD值剛過閥值（2.70），但條件QTL qSWC7SW|FT的LOD值升至3.81，效應值也略增大（圖2-d）。

圖2　開花期對SG群體中4個主效千粒重QTL的影響模式Fig. 2 The genetic regulation of flowering time to 1000-seed weight on four major QTL for seed weight in SG population

2.5 主效開花期QTL連鎖標記的育種應用

為驗證主效開花期QTL的遺傳效應，探討通過標記篩選，聚合提早開花等位基因，獲得早熟育種材料的可能性。根據SG群體282個株系在9種環(huán)境下的開花期平均值，選取開花最早和最遲的株系各20個，用效應值最大、顯著性最高的3個主效QTL（qFTA2、qFTC2和qFTC6）峰值及相近位置12個標記進行基因型和性狀表現(xiàn)型的關聯(lián)分析，從中篩選出6個高度關聯(lián)的共顯性標記（表5）。在播種到開花平均為176 d的 20個最早開花的株系中，qFTA2連鎖標記ZAAS548b和DNAPL的基因型70%和80%顯示早開花等位基因帶型，qFTC2和qFTC6各2個標記符合率則達到80%和95%；在播種到開花平均為192 d的20個最遲開花的株系中，qFTA2位點2標記顯示80%和75%條帶為遲開花基因型而qFTC2和qFTC6位點，遲開基因型高達100%和90%。因此，選用這些標記轉育早花早熟基因尤其是通過回交和復交，將中國油菜中的早熟基因導入和聚合于歐洲油菜品種中，創(chuàng)制適合長江流域油菜主產區(qū)種植環(huán)境而以歐洲油菜為主要遺傳背景的育種新資源，在雜交油菜育種中將發(fā)揮重要作用。另最早和最遲開花的各20個株系，平均千粒重差值達0.328 g，差異極顯著（P=0.015）；但早花和遲花二組間含油量和角果粒數(shù)均無顯著差異（P=0.274和0.189）。

3　討論

3.1 不同遺傳背景下開花期QTL比較

表4　千粒重條件和非條件QTL 的加性效應Table 4 Additive effect of conditional and unconditional QTLs for 1000-seed weight

本研究在ZHAO等［2］前期研究基礎上，利用新增6種環(huán)境的開花期表型數(shù)據和添加356個分子標記后的新版SG圖譜，對共9種環(huán)境下的開花期性狀重新進行QTL掃描，共檢測到在3種以上環(huán)境中穩(wěn)定表達的QTL有7個。其中，3個效應值最大的QTL是qFTA2、 qFTC2和qFTC6，Gaoyou等位基因純合并存時，可相應提早開花約3、6和4 d，是創(chuàng)制油菜早熟親本的候選QTL位點。油菜開花期QTL的研究已有眾多報道，幾乎在所有 19條連鎖群上均檢測到相關基因位點，但出現(xiàn)頻率最高、效應值最大的QTL主要分布在A2、C2和C6連鎖群上［1，5-9］，與本研究結果相吻合。比較先前3環(huán)境下的定位結果［1］，qFTA2、qFTC2和qFTC6的顯著性和效應值均有提高，qFTA3、qFTA4、qFTA10和qFTC8是新定位的QTL，分別在6、4、5 和3種環(huán)境中表達顯著，而之前在3種環(huán)境聯(lián)合定位分析中檢測到的A1、C1、C4和C9上的QTL只在1 —2種環(huán)境中顯著，未計入在內。這可能是隨著圖譜上標記飽和度的增加和全基因組覆蓋率的提高，以及試驗環(huán)境數(shù)的增加和試驗誤差減小，使得統(tǒng)計精確性加強，QTL的檢出率提高而只在少數(shù)環(huán)境下檢測到的效應值又較小的QTL很可能是假陽性QTL。

包括油菜在內的多個蕓薹屬作物全基因組的測序完成為QTL的精細定位、候選基因篩選和圖位克隆提供了強大的信息資源和技術支撐。通過序列比對，首先將qFTA2、qFTC2和qFTC6確定在油菜或甘藍基因組相應物理區(qū)間，分別位于油菜ChrA2∶4—8 Mb、甘藍C02∶1—4.5 Mb和油菜ChrC6∶25—29 Mb區(qū)間。擬南芥基因組同源比對，在qFTA2和qFTC6峰值位置發(fā)現(xiàn)擬南芥中調控開花關鍵基因FLOWERING LOCUS T（FT）的2個同源栲貝BnFT-A2（GSBRNA2T00090951001）和BnFT-C6（GSBRNA2T00067517001）。BnFT-C6兩側還發(fā)現(xiàn)BnAP1-1（GSBRNA2T00118005001）和BnAP1-2 （GSBRNA2T00054833001）2個開花相關基因，這個結果與LONG等［9］和WANG等［14］的報道相一致（圖1-a和圖1-c）。除此，擬南芥中“春化途徑”的重要基因 FLOWERING LOCUS C（FLC）的同源基因BnFLC-C2 （GSBRNA2T00068991001）和與開花有關的酵母多聚腺苷酸化因子 pfs2p同源基因 BnFY-C2 （GSBRNA2T00151903001）位于 qFTC2區(qū)間峰值位置（圖1-b），該區(qū)間同源于KOORNNEEF等［32］早年報道的擬南芥第5染色體上包含F(xiàn)LC、CO和FY等開花基因的區(qū)域，與 RAMAN等［17］報道的貢獻率最大（22.39%）的QTL Qdtf（g）.wwai-C2a，可能屬于相同QTL。研究結果為后續(xù)功能確認提供重要參考。

3.2 開花期QTL對環(huán)境的響應以及基因間的互作

9環(huán)境下檢出的在3種以上環(huán)境中表達的7個開花期QTL，除qFTA10中國西安環(huán)境中被檢測到微效QE互作，其余QTL與環(huán)境的互作效應均未達顯著，上位性QTL與環(huán)境互作也只在德國Reinshof環(huán)境下，ZAAS1029/qFTC2位點檢測到微效的AAE互作，說明開花期是一個相對穩(wěn)定的性狀，環(huán)境互作不大。8對互作上位性QTL，效應均較微，累計不到加性主效的一半，值得注意的是7個加性主效QTL中，除了qFTC8外，其余 6個均有上位性效應，2個最重要的QTLqFTC2和qFTC6分別與4和2個QTL/標記位點發(fā)生互作，qFTA2、qFTA3和qFTA10也分別參與上位互作1—2次。因此，借助標記輔助轉育早熟基因時因考慮到與其他QTL或位點的互作而帶來的影響。

開花性狀在模式植物擬南芥中已研究得相當清楚，由幾百個基因共同參與，是一個復雜的基因網絡［16］，如“春化途徑”關鍵基因 FLC同時又受到SHORTVEGETATIVEPHASE（SVP）、TEMPRANILLO1 （TEM1）、SUPPRESSOR、OFFRIGIDA4（SUF4）、FRIGIDA（FRI）、EARLYFLOWERING7（ELF7）、EARLYFLOWERINGINSHORTDAYS（EFS）、VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）、VERNALIZATION2（VRN2）等多個基因、多條途徑調控，因而含BnFLC-C2（GSBRNA2T00068991001）的qFTC2區(qū)域參與多個上位互作是可以理解的。

3.3 開花期對種子千粒重的影響

比較千粒重在非條件和給定開花期為條件時的QTL分析結果，可以看出開花期對千粒重QTL的作用模式有 3種情況。（1）當開花期被條件后，LOD值急劇下降至閥值以下，QTL效應不再顯著，如效應值較小的4個QTL qSWA2、qSWA3、qSWA4和qSWC2，大粒等位基因均來自中國親本Gaoyou。其中qSWC2 與qFTC2同位點，qSWA2和qSWA3相鄰處有qFTA2 和qFTA3 2個開花期QTL，早開花等位基因均來自Gaoyou，顯然在這些位點上，大粒等位基因效應可能與開花早、籽粒灌漿期長有關。當早開花優(yōu)勢消失后，粒重QTL不覆存在。通過選擇這些位點的早開花標記基因型有望同時提高種子千粒重，這也部分給出了開花期與千粒重之間極顯著負相關的遺傳解釋；（2）開花期的變化對粒重 QTL基本無影響，如 qSWA1、qSWA7、qSWC7和qSWC8，LOD值雖出現(xiàn)小幅上升，效應值基本不變。除qSWC8，其他3個QTL位點，歐洲親本Sollux增加粒重。qSWA7和qSWC8是SG群體中2個效應值最大，顯著性最高的QTL，當給定開花期不變時，LOD值和貢獻率有所提高，效應值穩(wěn)定。因此，這兩個效應值最大的粒重QTL推薦育種應用可有效提高千粒重但不影響開花期；（3）如qSWC1-1和qSWC1-2，當開花期給定不變時，QTL的LOD值下降或效應值同時下降，說明開花遲早對其在一定范圍內有一定影響。

3.4 QTL連鎖標記的篩選和育種潛力分析

根據SG群體極端開花期株系在3個效應值最大的QTL（qFTA2、qFTC2和qFTC6）區(qū)域標記基因型和開花期表現(xiàn)型的關聯(lián)分析（表5），篩選獲得6個高質量、高吻合度的共顯性標記?；谶@3個QTL的標記輔助，目前，筆者正在試圖通過回交導入和自交純合，將中國油菜中的早花早熟基因導入和聚合到歐洲油菜遺傳背景中，創(chuàng)制出以優(yōu)良歐洲油菜品種為遺傳背景但開花期可提早約半個月的育種新材料，這對擴大中國油菜親本材料的遺傳基礎，增加強優(yōu)勢組合的父本來源產生積極作用，是分子育種設計和創(chuàng)新育種理念的新途徑和新思路。這些標記目前已投入育種應用并收到了較好的選育效果（數(shù)據未列出）。

另外。本研究發(fā)現(xiàn)遲、早開花組各20個株系除開花期相差19 d，早開花組千粒重平均值高于遲開花組0.3218 g，差異極顯著，但含油量和角果粒數(shù)基本持平。因此，通過標記輔助導入早花基因可同時提高千粒重，但不影響含油量和角果粒數(shù)，對群體產量的正向作用有待下一步試驗確認。

4　結論

7個QTL均顯示早開花等位基因來自中國親本。擬南芥中調控開花關鍵基因FT、API、FLC和FY的6個同源拷貝定位到了3個主效QTL峰值位置。開花遲、早顯著影響4個千粒重QTL，但2個最重要的粒重位點（qSWA7和 qSWC8）不受影響。3個主效 QTL （qFTA2、qFTC2和qFTC6）的6個共顯性標記可用于早熟基因的導入和早熟材料的選育。

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（責任編輯 李莉）

Mapping QTL of Flowering Time and Their Genetic Relationships with Seed Weight in Brassica napus

HUANG Ji-xiang1， XIONG Hua-xin1，2， PAN Bing1，3， NI Xi-yuan1， ZHANG Xiao-yu1， ZHAO Jian-yi1
（1Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control， Hangzhou 310021；2College of Chemistry and Life Sciences， Zhejiang Normal University， Jinhua 321000， Zhejiang；3College of Agriculture & Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058）

【Objective】The present research aimed to explore the major QTL controlling the flowering time in European andChinese rapeseed materials， to analyze the genetic influence of flowering time on QTL for 1000-seeds weight， and thus to provide available information for breeding purpose.【Method】The doubled haploid （DH） Sollux/Gaoyou population with 282 lines was used. The data set of flowering time was obtained from nine environments and over seven years. QTL identification of flowering time was performed using WinQTLCart 2.5. The candidate genes underlining QTLs were screened out by transcriptome analysis using RNA-Seq and alignment between QTL regions and Arabidopsis. Further， conditional QTL estimation was adopted to dissect the genetic relationships between flowering time and seed weight. Finally， using selected DH lines with extreme phenotypes of flowering time， an association evaluation between marker genotypes and phenotypes of flowering time was performed. 【Result】 Seven major QTLs were detected， which showing significant at least in three environments. Their additive effects ranged from 0.58-3.85 days and together accounted for around 84% of the phenotypic variation in population. The sum of eight pairs of epistatic loci （additive × additive） accounted for 41.8% of the total additive effects. QTL by environmental interactions were significant only in few environments with small amount of genetic effects. Four critical orthologous genes of Arabidopsis thaliana for flowering time were mapped in the peak positions of three most significant QTL regions （qFTA2， qFTC2， and qFTC6）. It provides valuable information to anchor candidate genes underling QTL. The conditional QTL analysis revealed large impact of flowering time on seed weight in four QTLs （qSWA2， qSWA3， qSWA4， and qSWC2）. This partly explained the significant negative correlation between flowering time and 1000-seed weight. While the most important two （qSWA7 and qSWC8） showed independent without being interfered. Six markers linked with three major QTLs showed good fitness between marker genotypes and trait phenotypes （70%-100%）， indicating their potentials for breeding purpose. The results demonstrated that the combination of early flowering alleles from qFTA2， qFTC2 and qFTC6 by marker assistant selection of ZAAS548， DNAPL， ZAAS619sa， ZAAS616s， ZAAS846a and C6SGFLO-22 induced not only early flowering but also significantly increased 1000-seed weight， while the oil content and seeds per silique between two extreme flowering time groups showed almost the same.【Conclusion】All seven QTLs of flowering time showed Chinese parent Gaoyou induced early flowering. Four important candidate genes homologous to Arabidopsis controlling flowering time （FT， FLC，AP1， and FY） were physically aligned and mapped underlining the peak positions of the three major QTL qFTA2， qFTC2 and qFTC6. The results indicated that the four loci corresponding to seed weight were genetically influenced by flowering time， however， the most important two （qSWA7 and qSWC8） were independent. Six markers linked to the 3 major QTL were of potentials in the practical breeding program.

Brassica napus L.； QTL mapping； flowering time； 1000-seeds weight； conditional QTL mapping

2016-02-25；接受日期：2016-05-10

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）（2015CB150200）、七大農作物育種專項（JFYS2016ZY03002156）、浙江省旱糧創(chuàng)新團隊項目（2011R50026-7）

聯(lián)系方式：黃吉祥，Tel：0571-86403406；E-mail：838107@163.com。熊化鑫，Tel：0571-86403406；E-mail：huaxinxiong_11@163.com。黃吉祥和熊化鑫為同等貢獻作者。通信作者趙堅義，Tel：0571-86403406；E-mail：2208086097@qq.com