姜黃素對A549細胞亞群SP和NON-SP的NF-κB、VEGF及Notch通路的影響*

李小江，賈英杰，張文治，張瑩，許文婷（.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津009；.天津神經(jīng)外科研究所，天津00060；.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津009）

姜黃素對A549細胞亞群SP和NON-SP的NF-κB、VEGF及Notch通路的影響*

李小江1，賈英杰1，張文治2，張瑩1，許文婷3
（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300193；2.天津神經(jīng)外科研究所，天津300060；3.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津300193）

［目的］通過動物實驗了解姜黃提取物-姜黃素抗腫瘤血管生成的具體作用機制。［方法］將40只BALB/C雄性裸小鼠分為4組，每組10只。分別為A組（SP亞群細胞姜黃素組）、B組（SP亞群細胞荷瘤對照組）、C組（NONSP亞群細胞姜黃素組）、D組（NON-SP亞群細胞荷瘤對照組）。A、B兩組于實驗前建立肺腺癌A549 SP細胞亞群荷瘤模型，C、D兩組建立肺腺癌A549 NON-SP細胞亞群荷瘤模型，建立模型后觀察16 d，于A組、C組小鼠腹腔注射姜黃素，隔天1次，B、D兩組注射生理鹽水。16 d后將小鼠稱重后處死，剝離瘤塊組織，比較各組瘤質(zhì)量；免疫組化法檢測腫瘤組織中血管生長因子（VEGF）、核因子-κB（NF-κB）的表達；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測Notch1 mRNA含量。［結(jié)果］肺腺癌A549 SP細胞亞群荷瘤模型組小鼠瘤體與NON-SP細胞亞群荷瘤模型組小鼠相比體積較大；SP亞群細胞姜黃素組抑瘤作用及抗腫瘤血管生成優(yōu)于NON-SP亞群細胞姜黃素組，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義。［結(jié)論］姜黃素可以抑制腫瘤生長，考慮可能與其抑制NF-kB的表達，下調(diào)Notch1 mRNA含量，阻斷Notch信號通路，抑制腫瘤組織中VEGF的表達有關(guān)。

姜黃素；血管生長因子；核因子-κB；人肺腺癌A549；NON-SP細胞；SP細胞

姜黃色素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，是姜黃發(fā)揮作用的主要活性成分。研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫功能、保護肝腎等多種藥理作用。血管生成是實體腫瘤生長、侵襲、擴散和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，是腫瘤治療的靶點之一［1］。近年來研究表明姜黃素具有抗腫瘤血管生成的作用，但具體機制仍不明確［2］。本實驗旨在研究姜黃素抗腫瘤血管生成作用及機制。

1　材料

1.1材料BALB/C裸小鼠、人肺腺癌A549瘤株，上海坤肯生物化工有限公司；SP（side population）亞群細胞，天津灝洋生物公司提供；NON-SP（NON-side population）亞群細胞，由天津灝洋生物公司提供；姜黃素，天津化標生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器及試劑Notch1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、生物顯微鏡，LYMPUS-BX40日本；電子分析天平，梅特勒-托得多儀器設(shè)備有限公司；低溫高速離心機，BECKMAN allegraTM64 Centrifuge；MDF-192型超低溫冰箱，日本三洋電機株式會社；PCR儀，Alpha unit Block Assembly for PTC DNA Engine Systems；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

2　方法

2.1實驗方法取BALB/C裸小鼠40只，按照隨機數(shù)字表分為4組，每組10只。分為SP亞群細胞和NON-SP亞群細胞兩組，每組分別設(shè)為姜黃素組及荷瘤空白對照組。具體分組情況如下：A組（SP亞群細胞姜黃素組）、B組（SP亞群細胞荷瘤對照組）、C組（NON-SP亞群細胞姜黃素組）、D組（NON-SP亞群細胞荷瘤對照組）4組。

2.2動物模型建立取分離后的A549 SP亞群細胞及NON-SP亞群細胞調(diào)整細胞數(shù)為1×109/L癌細胞懸液，取0.2 mL原液常規(guī)方法將SP亞群細胞接種于A、B組小鼠左、右大腿內(nèi)側(cè)皮下，將NON-SP亞群細胞接種于C、D組小鼠左、右大腿內(nèi)側(cè)皮下。

2.3給藥及標本制備各組均于接種瘤株16 d后采用腹腔注射給藥，隔日1次，共8次。實驗組予姜黃素腹腔注射100 mg/kg，0.2 mL；對照組予生理鹽水腹腔注射25 mL/kg，隔日1次，共8次。實驗動物均于接種瘤株16 d后稱質(zhì)量，處死小鼠，立即將瘤塊組織剝離，稱重測量大小后用甲醛固定并進行常規(guī)石蠟包埋，切片5 μm，免疫組織化學染色。免疫組織化學用SP法，按試劑說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。免疫組化染色陽性為棕色或黃褐色。

2.4免疫組化法檢測血管生長因子（VEGF）、核因子-κB（NF-κB）的表達二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS振洗，采用專用微波爐進行抗原微波熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗、三抗各37℃孵育45 min，DAB顯色2 min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。

2.5RT-PCR檢測Notch1表達組織總RNA的變性，抽提，沉淀，洗滌，溶解，NOTCH1引物長度：182 bp上游引物：5'TCC GCG GCT CCA TCG TCT ACC 3'下游引物：5'CTG CAC GGC CTC GAT CTT GTA 3'；β-actin擴增長度169 bp上游引物5'GCA CCC AGC ACA ATG AAG ATC 3'下游引物5'CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC 3'；RT反應(yīng)后，目的基因退火，1%Agrose凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

2.6統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 18.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANONA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnet’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結(jié)果

3.1小鼠一般情況及瘤體比較實驗后4組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)不同程度的下降，與實驗前比較，差異具有統(tǒng)計學意義。A組、B組兩組小鼠瘤體質(zhì)量較大，且與C、D兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義，其中B組瘤質(zhì)量大于A組，D組瘤質(zhì)量大于C組，說明SP細胞腫瘤組織較NON-SP生長速度快，并且姜黃素對腫瘤組織的生長具有一定的抑制作用，A、B兩組及C、D兩組組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表1。

表1　各組小鼠瘤質(zhì)量比較（±s）Tab.1Comparison of tumor weight of each group of mice（±s）

表1　各組小鼠瘤質(zhì)量比較（±s）Tab.1Comparison of tumor weight of each group of mice（±s）

注：B組與其他3組比較，*P＜0.05；B組與C組、D組比較，**P＜0.01；A組與B組、C組與D組比較，*P＜0.05。

組別動物數(shù)瘤質(zhì)量（g）A組101.009±0.376* B組101.289±0.238** C組100.746±0.301* D組100.837±0.289*

3.2對小鼠腫瘤組織中VEGF的表達的影響在積分光度中，A、C兩組明顯低于C、D兩組，其中A組最低，與其他各組比較，差異具有統(tǒng)計學意義，A組與C組比較，差異具有統(tǒng)計學意義，B、D兩組比較，差異不具有統(tǒng)計學意義?？偯娣e結(jié)果與積分光度大體一致。說明姜黃素可以明顯抑制VEGF的表達，并且姜黃素對SP亞群細胞荷瘤組的VEGF的表達最低。結(jié)果見表2、圖1。

表2　各組小鼠腫瘤組織VEGF圖像分析結(jié)果（±s）Tab.2VEGF image analysis results in tumor tissue of each group（±s）

表2　各組小鼠腫瘤組織VEGF圖像分析結(jié)果（±s）Tab.2VEGF image analysis results in tumor tissue of each group（±s）

注：在積分光度中，A組與B、D兩組比較，△△P＜0.01；A組與C組比較，△P＜0.05；B、D兩組比較，*P＞0.05；C組與B、D兩組比較，#P＜0.01。在總面積中，A組與B、D兩組比較，△△P＜0.01；A組與C組比較，△P＜0.05；B、D兩組比較，*P＞0.05；C組與B、D兩組比較，#P＜0.01。

組別動物數(shù)積分光度總面積（μm2）A組10198.21±5.89143.23±2.84 B組10365.54±7.26△△175.65±3.89△△C組10223.76±4.53△#163.86±1.08△#D組10342.22±3.42△△*188.64±3.86△△*

3.3對小鼠腫瘤組織中NF-κB表達的影響NF-κB在A組中表達最低，其次為C組，兩組比較，差異不具有統(tǒng)計學意義，A組與B、D兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。B、D兩組NF-κB在小鼠腫瘤組織中表達較高，但兩組比較差異不具有統(tǒng)計學意義。說明NF-κB在腫瘤組織中表達，但是姜黃素組（A組和C組）可顯著抑制NF-κB的表達，姜黃素對SP亞群細胞荷瘤組的抑制作用最明顯，與NONSP亞群細胞荷瘤組比較差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表3、圖2。

表3　各組小鼠腫瘤組織NF-κB圖像分析結(jié)果（±s）Tab.3 NF-κB image analysis results in tumor tissue of each group（±s）

注：A組與B、D兩組比較，**P＜0.01；A組與C組比較，*P＜0.05；B、D兩組比較，△P＞0.05。

組別動物數(shù)NF-κB的表達A組1094.1±4.21 B組10145.2±3.87** C組10113.6±4.32* D組10136.4±5.17**

3.4各組小鼠腫瘤組織中Notch-1mRNA的表達經(jīng)PCR分析后顯示，結(jié)果處理如下：ΔCt=Ct（Survivin）-Ct（β-actin）；ΔΔCt=空白對照組ΔCt-各觀察組ΔCt；Ratio值=2ΔΔCt。結(jié)果顯示，A組Notch-1 mRNA的表達低于其他各組，且與C組比較，差異具有統(tǒng)計學意義，B、D兩組高于A、C兩組，差異具有顯著性。同樣證明，姜黃素可抑制Notch-1 mRNA的表達，并且姜黃素對SP細胞荷瘤裸小鼠腫瘤組織Notch-1 mRNA的抑制作用優(yōu)于NON-SP細胞荷瘤裸小鼠。結(jié)果見表4。

圖1　各組腫瘤組織VEGF染色結(jié)果Fig.1 VEGF dye results in tumor tissue of each group

圖2　各組腫瘤組織NF-κB染色結(jié)果Fig.2 NF-κB dye results in tumor tissue of each group

表4　各組小鼠腫瘤組織中Notch-1 mRNA的表達（±s）Tab.4Notch-1 mRNA expression in tumor tissue of each group（±s）

表4　各組小鼠腫瘤組織中Notch-1 mRNA的表達（±s）Tab.4Notch-1 mRNA expression in tumor tissue of each group（±s）

注：A組與B、D兩組比較，**P＜0.01；A組與C組比較，*P＜0.05；B、D兩組比較，*P＜0.05。

組別動物數(shù)Ratio值A(chǔ)組1017.46±2.86** B組1039.43±3.21 C組1020.12±4.66* D組1043.22±3.60*

4　討論

腫瘤血管生成及侵襲是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件。VEGF是一種高效、特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子，對血管內(nèi)皮細胞具有強烈的促分化作用。它是一種高度特異性的有絲分裂原，能直接刺激新生血管的形成；被公認為是最重要和最強的促血管生成因子［3］。VEGF是誘導(dǎo)和促進血管生成最強有力的關(guān)鍵因子，也是抗血管生成的重要靶點；腫瘤組織往往過量表達VEGF因子，該因子可以與血管內(nèi)皮細胞表面VEGF受體特異性結(jié)合，活化其包內(nèi)酪氨酸激酶，并最終促進血管內(nèi)皮細胞增殖和游走，構(gòu)成血管樣結(jié)構(gòu)［4］。

Notch信號通路是保守的受體配體信號通路，在細胞的增殖、凋亡和分化中起重要作用，影響多個器官的發(fā)育和功能。在不同組織起源的腫瘤中，或同種腫瘤的不同階段，Notch信號通路發(fā)揮抑制或促進腫瘤的作用。對于絕大多數(shù)人類腫瘤來說，Notch信號通路起促癌作用。Notch信號通路的活性與腫瘤患者生存率密切相關(guān)，并且可以作為判斷腫瘤患者預(yù)后的一個指標。近年來，對肺癌發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)［5-7］，不同類型肺癌有不同Notch組分表達。在非小細胞肺癌細胞中，Notch1、Notch3、HES-1表達很常見。有學者證實［8］，Notch1在成人肺腺癌、鱗癌中高表達，在小細胞肺癌中低表達。Sriuranpong等［9］證實Notch1、Notch2的過量表達使SCLC細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞生長。由此推斷Notch信號通路與肺癌的發(fā)病有密切關(guān)系，在不同類型肺癌中表現(xiàn)促癌或抑癌作用。姜昕等［10］檢測到在NSCLC中Notch1、HIF-1、VEGF及Notch1 mRNA表達均上調(diào)，提示其在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，并認為檢測Notch1蛋白及mRNA可作為腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移指標。此外，Notch信號通路可以影響其他細胞信號通路的活性，如NF-κB、Akt、mTOR、Ras、Wnt、EGFR、PDGF等［11-15］，在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用，是一個非常復(fù)雜的信號通路［16-17］。Donnem等［18］認為在NSCLC中Notch1與VEGFA共表達提示預(yù)后差。實驗發(fā)現(xiàn)，肺腺癌A549 SP細胞亞群荷瘤模型組小鼠瘤體與NON-SP細胞亞群荷瘤模型組小鼠相比體積較大；姜黃素可以抑制腫瘤生長［19］，并可以降低VEGF的表達，抑制NF-kB的表達，通過RT-PCR檢測出其可下調(diào)Notch1 mRNA含量，對腫瘤血管的生成有一定的抑制作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，SP亞群細胞姜黃素組抑瘤作用及抗腫瘤血管生成優(yōu)于NON-SP亞群細胞姜黃素組，說明姜黃素能夠通過某種途徑阻斷Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)該通路的關(guān)鍵表達因子Notch-1和調(diào)節(jié)因子NF-κB的表達，抑制了腫瘤細胞的生成長。

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Curcumin extract influence on tumor angiogenesis of A549 cell subsets SP and NON-SP cells

LI Xiao-jiang1，JIA Ying-jie1，ZHANG Wen-zhi2，ZHANG Ying1，XU Wen-ting3
（1．The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Neurosurgery Institute，Tianjin 300060，China；3.Graduate School，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Through the animal experiment further understand the main ingredient in turmeric extract curcumin-of tumor angiogenesis of the specific mechanism.［Methods］The 40 BALB/C mice were divided into four groups of male nude，one group is only 10.group A（SP and group of cells curcumin group），group B（SP and group of cells tumor-burdened control group），group C（as SP and group of cells curcumin group），group D（as SP and group of cells tumor-burdened control group）.A and B two groups in lung adenocarcinoma before the establishment A549SP cells subsets tumor-burdened model，C，D two groups establish lung adenocarcinoma A549 cells subsets as SP tumor-burdened model，and after 16 days the model are observated，in group A，C intraperitoneal injection of mice curcumin，the next day 1，eight times，B and D two groups of injection saline.16 days later executed mice，will tumor piece of tissue dissection，comparison of the heavy；immunohistochemical method to detect tumor tissue VEGF，CD34，NF-kB expression；PT-PCR detected Notch1 mRNA content.［Results］The group of cells SP curcumin group of suppression effect was better than the group of cells as SP curcumin group that cancer stem cells and tumor angiogenesis closely related.［Conclusion］Curcumin can inhibit tumor growth，and may inhibit the expression of NF-kB，down regulate the content of mRNA Notch，block the Notch1 signaling pathway and inhibit the expression of VEGF in tumor tissues.

curcumin；VEGF；NF-κB；human lung adenocarcinoma A549；NON-SP cell；SP cell

R73-3

A

1672-1519（2016）03-0164-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.10

國家自然科學基金資助項目（81001578）；抗癌重大專項攻關(guān)計劃（12ZCDZSY15800）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃重點項目（14JCZDJC36900）。

李小江（1980-），女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤學研究。

（2015-09-25）