穩(wěn)定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡細胞株AR42J的建立

李欽芳　吳敏　郭曉榕　李潔　顧曉霞　湛先保

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·論著·

穩(wěn)定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡細胞株AR42J的建立

李欽芳吳敏郭曉榕李潔顧曉霞湛先保

目的采用RNA干擾技術(shù)沉默大鼠胰腺腺泡細胞AR42J的Beclin1基因表達，構(gòu)建穩(wěn)定的Beclin1基因沉默的AR42J細胞系。方法設(shè)計并合成3種靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及陰性對照shRNA，分別插入質(zhì)粒GV112，重組質(zhì)粒分別命名為p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC。應(yīng)用lipo3000將重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入AR42J細胞，應(yīng)用RT-PCR檢測細胞Beclin1 mRNA表達，篩選出沉默效率最高的質(zhì)粒，在293T細胞內(nèi)經(jīng)慢病毒包裝(LV-shBeclin1)，感染AR42J細胞，應(yīng)用嘌呤霉素篩選，采用RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法分別檢測病毒感染細胞Beclin1 mRNA和蛋白表達。結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離及測序證實shRNA序列符合預(yù)期。p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC轉(zhuǎn)染后AR42J細胞Beclin1 mRNA表達抑制率分別為(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)% 。3個p-sh-Beclin1轉(zhuǎn)染細胞的表達抑制率均較未轉(zhuǎn)染細胞顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，而轉(zhuǎn)染p-shRNA-NC細胞的表達抑制率與未轉(zhuǎn)染細胞的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。抑制率最高的p-sh-Beclin1-3經(jīng)慢病毒包裝，感染AR42J細胞，感染細胞的Beclin mRNA表達抑制率為(86.1±1.2)%，蛋白表達抑制率為(87.9±2.8)%，與未感染細胞的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)。結(jié)論成功建立Beclin1基因沉默的AR42J細胞株，為探討B(tài)eclin1基因在急性胰腺炎發(fā)病機制中的作用提供新的細胞模型。

胰腺炎；RNA干擾；慢病毒感染；AR42J細胞系；Beclin1基因

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81170434)

急性胰腺炎(AP)是胰腺腺泡細胞內(nèi)酶原顆粒異?；罨碌难装Y性改變，目前發(fā)病機制尚不明確。Gukovsky等[1]認為，自噬、溶酶體及線粒體功能異常是AP發(fā)生的關(guān)鍵因素。自噬屬于程序性死亡,是細胞器選擇性降解的重要途徑，可以促進細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的有效循環(huán)利用。蛋白質(zhì)代謝活躍的胰腺腺泡細胞中生理性自噬水平較高。Beclin1是酵母Atg6在哺乳動物中的同源類似物，廣泛存在于細胞中，以胞質(zhì)為主。它與細胞因子相互作用，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)激酶Vps-34蛋白，促進Beclin1-Vps34-Vps15核心復(fù)合物形成，從而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生。Beclin1包括N端的BH3結(jié)構(gòu)域、中央的CCD結(jié)構(gòu)域和C端的ECD結(jié)構(gòu)域。Beclin1通過ECD調(diào)節(jié)細胞自噬功能和發(fā)揮抑癌作用；通過BH3與Bcl-2家族成員結(jié)合發(fā)揮抗凋亡功能；通過ECD和CCD共同與PI3KC3/Vps34相互作用促進細胞凋亡[2]。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默胰腺腺泡細胞株AR42J的Beclin1基因表達，為研究Beclin1在AP發(fā)病機制中的作用提供新的體外模型。

材料與方法

一、插入靶向Beclin1基因shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)大鼠Beclin1的gene ID:114558及GenBank的NM_001034117信息設(shè)計3個靶向Beclin1的shRNA序列：sh-Beclin1-1靶向序列為5′-GGATGGTGTCTCTCGAAGA-3′，起始位點442，GC含量52.63%；sh-Beclin1-2靶向序列為5′-CTCACAGCTCCATTACTTA-3′，起始位點344，GC含量42.11%；sh-Beclin1-3靶向序列為5′-GAGGAGCCATTTATTGAAA-3′，起始位點416，GC含量36.84%。同時設(shè)計不針對任何基因的陰性對照shRNA-NC,序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。shRNA均委托上海吉凱基因科技有限公司合成。載體質(zhì)粒的編號為GV112，元件順序為hU6-MCS-CMV-Puromycin，含有AgeI、EcoRI酶切位點及嘌呤霉素抗性基因。通過雙酶切方法將3個sh-Beclin1及shRNA-NC分別插入質(zhì)粒GV112，4個重組質(zhì)粒分別命名為p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3、p-shRNA-NC。質(zhì)粒經(jīng)擴增、DNA抽提、瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，并應(yīng)用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收、純化，送上海吉凱基因科技有限公司測序。

二、細胞轉(zhuǎn)染及基因沉默效果鑒定

AR42J細胞由本科實驗室保存，復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng),傳代。取對數(shù)生長期AR42J細胞，接種于24孔板，每孔2×105個細胞。培養(yǎng)過夜后采用脂質(zhì)體法將4個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染AR42J細胞，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞為陰性對照，以孔內(nèi)只加ddH2O為空白對照。在eppendof試管內(nèi)分別加入50 μl optiMEM、2 μl助轉(zhuǎn)劑、0.8 μg重組質(zhì)粒、1 μl lipo3000混均。棄培養(yǎng)過夜的1640培養(yǎng)液，換成350 μl optiMEM培養(yǎng)液，再加入上述混合液，培養(yǎng)8 h，然后換成1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞。采用Trizol提取細胞總RNA，采用RT試劑盒(Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實時PCR法檢測各組細胞Beclin1 mRNA表達。Beclin1引物上游為5′-CACTCTGATCGGGGAGGCAT-3′，下游為5′-TCCAACATCTCCAAACAGCGT-3′，擴增產(chǎn)物215 bp。引物由英駿公司合成，采用聚丙烯凝膠電泳方法純化。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。通過羅氏Lightcycler 480II自帶分析軟件，經(jīng)最大二階導(dǎo)數(shù)法的高置信度算法獲得Ct值，通過高級相對定量分析法計算細胞Beclin1 mRNA相對表達量。Beclin1 mRNA表達抑制率=1-(轉(zhuǎn)染細胞組Beclin1 mRNA表達量/未轉(zhuǎn)染細胞組Beclin1 mRNA表達量)×100%。實驗重復(fù)5次，取均值。

三、慢病毒包裝及滴度測定

取對數(shù)生長期293T細胞，以1×106/孔的密度接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)過夜。第三代慢病毒包裝系統(tǒng)(pCMV-VSV-G/pMDLg/pRSV-Rev)由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物實驗室提供。在eppendof試管內(nèi)分別加入0.222 μg pMDLg、0.166 μg pRSV-Rev、0.166 μg pCMV-VSV-G、0444 μg 抑制效率最高的p-sh-Beclin1，吹打混勻，再加入50 μl optiMEM、2 μl助轉(zhuǎn)劑、1 μl lipo3000，吹打混勻后靜置10 mins。將細胞培養(yǎng)液換成350 μl optiMEM，加入上述混合液后培養(yǎng)8 h，更換成DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，再更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集培養(yǎng)上清，即為包裝好的慢病毒(LV-shBeclin1)。采用稀釋梯度法檢測病毒滴度，并將包裝好的慢病毒保存于-80℃冰箱。

四、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株建立、篩選及鑒定

取對數(shù)生長期的AR42J細胞，以5×105/孔的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜。棄培養(yǎng)液，加入700 μl 1640培養(yǎng)基、1×108TU/ml的LV-shBeclin1、7 μg/ml聚凝胺，培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入終濃度為2.5 μg/ml的嘌呤霉素(Biosharp公司)篩選5 d。以未感染慢病毒的AR42J細胞作為對照組。收集兩組細胞，用Trizol抽提細胞總RNA，采用RT-PCR檢測細胞Beclin1 mRNA表達，方法同上。應(yīng)用Ripa裂解液(上海威奧生物科技有限公司)提取蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞Beclin1蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參。兔抗人Beclin1抗體購自CST公司，工作濃度1∶1 000；抗GAPDH抗體購自上海威奧生物科技有限公司，工作濃度1∶2 000；山羊抗兔IgG購自CST公司，工作濃度1∶5 000。最后ECL發(fā)光，X膠片曝光、顯影、定影。應(yīng)用ImageJ進行灰度值分析。Beclin1蛋白表達抑制率=1-(LV-shBeclin1感染組灰度值/未感染組灰度值)×100%。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

一、shRNA測序及重組質(zhì)粒鑒定

3個p-sh-Beclin1重組質(zhì)粒的DNA電泳結(jié)果見圖1，插入的sh-Beclin1片段大小符合預(yù)期。它們的測序結(jié)果見圖2，序列正確，符合實驗要求。

二、靶向Beclin1的shRNA基因沉默效應(yīng)

p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3、p-shRNA-NC瞬轉(zhuǎn)后AR42J細胞Beclin1 mRNA表達抑制率分別為(17.8±4.0)%、(30.6±2.8)%、(45.8±7.7)%、(7.0±11.8)%。3個p-sh-Beclin1轉(zhuǎn)染細胞的表達抑制率均較未轉(zhuǎn)染細胞顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為6.32、15.29、8.40，P值均<0.05)，其中以p-sh-Beclin1-3的表達抑制率最高，而轉(zhuǎn)染p-shRNA-NC的表達抑制率與未轉(zhuǎn)染細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.84，P>0.05)。

三、穩(wěn)定的LV-shBeclin1感染的AR42J細胞株鑒定

LV-shBeclin1感染的AR42J細胞Beclin1 mRNA表達抑制率為(86.1±1.2)%，蛋白表達抑制率為(87.9±2.8)%(圖3)，與未感染細胞的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為98.98、44.39,P值均<0.01)， 提示穩(wěn)定的Beclin1基因沉默的AR42細胞系構(gòu)建成功。

注：1：空白對照；2：陰性對照；3：Mark

圖2　p-sh-Beclin1-1(2A)、p-sh-Beclin1-2(2B)、p-sh-Beclin1-3(2C)重組質(zhì)粒測序圖

圖3　未感染細胞(1)、LV-sh-Beclin1感染AR42J細胞(2)Beclin1蛋白表達

目前為止，人們對AP發(fā)病機制的了解還處于探索階段。通過對多種小鼠模型的觀察發(fā)現(xiàn)AP中存在自噬受損，而溶酶體功能障礙就是其原因之一。Gukovskaya等[3]提出，溶酶體或自噬功能障礙在AP中發(fā)揮重要作用，甚至是多種降解途徑的共同通路。因此，自噬的探討對闡明AP的發(fā)病機制至關(guān)重要，也為疾病的預(yù)防及治療奠定基礎(chǔ)。Beclin1是自噬相關(guān)基因，參與自噬體的形成，在基礎(chǔ)研究中常常作為自噬的標志物反映自噬的水平。AR42J細胞源于大鼠胰腺外分泌部的種植性腫瘤，在裸鼠中具有成瘤性，是目前唯一的在培養(yǎng)狀態(tài)下具有正常胰腺腺泡細胞各種特性的細胞系，被廣泛地用于胰腺外分泌部的體外研究，包括鈣離子通路的研究、炎癥的研究等。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默AR42J細胞Beclin1基因表達，構(gòu)建穩(wěn)定的Beclin1基因沉默的AR42J細胞株，為探討自噬在AP發(fā)病機制中的作用提供細胞模型。

RNA干擾(iRNA)是內(nèi)外源雙鏈RNA在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達的一種生物學(xué)機制，于1998年首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)，是目前在多數(shù)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域沉默基因表達、了解基因功能的經(jīng)典方法[4]。iRNA主要分為3種途徑，其中以shRNA途徑沉默效果最為穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于哺乳動物細胞。shRNA是化學(xué)合成的具有單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，它以質(zhì)?；虿《緸檩d體進入細胞內(nèi)，在Dicer作用下分解成21～23 nt的siRNA，siRNA與RISC特異性結(jié)合降解靶mRNA，進而沉默靶基因的表達[5]。

本研究合成3種靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA,構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染AR42J細胞，采用RT-PCR方法篩選具有最佳沉默效果的執(zhí)行質(zhì)粒，再進行慢病毒包裝。本研究采用的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)有很多優(yōu)勢。首先產(chǎn)生RCV的可能性降低，其次擴大了宿主細胞范圍，且形成的慢病毒顆粒更加穩(wěn)定，容易離心濃縮成高滴度病毒，再次可以大幅度地減少病毒復(fù)制的可能性，提高生物安全性[6]。聚凝胺通過降低病毒和細胞表面之間的電荷排斥促進病毒進入細胞內(nèi)，從而提高轉(zhuǎn)染效率[7]。將慢病毒感染AR42J細胞后，通過嘌呤霉素的反復(fù)篩選，最后獲得穩(wěn)定的Beclin1基因表達抑制率高達86%的AR42J細胞株，為探索Beclin1與AP的關(guān)系提供了全方位可操作的細胞模型。

[1]Gukovsky I, Pandol SJ, Mareninova OA, et al. Impaired autophagy and organellar dysfunction in pancreatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012,27(Suppl 2):27-32.

[2]Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2011,18(4):571-580.

[3]Gukovskaya AS, Gukovsky I. Autophagy and pancreatitis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012,303(9):G993-G1003.

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[7]吳敏,李潔,劉曉，等.穩(wěn)定表達EGFP-LC3的AR42J細胞系的建立[J].中華胰腺病雜志, 2015,(15):112-115.DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.011

(本文編輯：屠振興)

Establishment of pancreatic acinar cell line AR42J with stable knockdown of Beclin1

LiQinfang,WuMin,GuoXiaorong,LiJie,GuXiaoxia,ZhanXianbao.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZhanXianbao,Email:zhanxianbao@126.com

ObjectiveTo silence the beclin1 gene expression by using RNA interference technology in AR42J rat pancreatic acinar cells, and build a stable AR42J line silencing beclin1. MethodsThree kinds of shRNA targeting rat beclin1 mRNA and negative control shRNA were designed and synthesized, and were inserted into the plasmids GV112, respectively. The recombinant plasmids were named asp-sh-Beclin1-1,p-sh-Beclin1-2,p-sh-Beclin1-3 andp-shRNA-NC. Lipo3000 was used to transfect the recombinant plasmid into AR42J cells, the expression of beclin1 mRNA were detected by RT-PCR to screen for the most efficient silencing plasmid, and then it was packaged into lentiviral(LV). AR42J cells were infected with LV and screened by puromycin. Beclin1 mRNA and protein expression was determined by RT-PCR and Western blot. ResultsThe recombinant plasmid was confirmed by agarose gel electrophoresis and sequencing showed that shRNA sequences were in line with expectations. The beclin1 mRNA inhibition rates of AR42J cells afterp-sh-Beclin1-1,p-sh-Beclin1-2,p-sh-Beclin1-3 andp-shRNA-NC transfection were (17.8±4.0)%, (30.6±2.8)%, (45.8±7.7)%, (7.0±11.8)%, respectively. The inhibition rates of threep-sh-Beclin1 transfection cells were significantly higher than that in non-transfection cells, and the difference was statistically significant (P<0.05). While the inhibition rate ofp-shRNA-NC transfection cells was not significantly different from that of non-transfection cells.p-sh-Beclin 1-3 with highest rate of inhibition was packaged by LV, and infected AR42J cells, then puromycin was applied to screen, inhibition rate of beclin mRNA expression in LV infection cells was (86.1±1.2)%, and the protein expression inhibition rate was (87.9±2.8)%, and the difference between infection and non-infection groups was statistically significant (P<0.05). ConclusionsThe stable AR42J line silencing beclin1 is successfully established, which can provide a new cell model for future research of the role of beclin1 in the pathogenesis of acute pancreatitis.

Pancreatitis;RNA interference;Leativirus infections;AR42J cell line;Beclinl genes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.006

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化科

湛先保，Email: zhanxianbao@126.com

國家自然科學(xué)基金(81170434)

2015-11-16)