響應(yīng)面法對栗蘑多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

趙建英 賀瑩

摘 要：該文采用統(tǒng)計學(xué)方法對栗蘑虹灰1號菌株進行液體發(fā)酵配方優(yōu)化，以得到適合栗蘑多糖發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配比。以栗蘑多糖含量為指標，首先采用前期單因素實驗得出的6個因素，再進行Plackett-Bumrman設(shè)計篩選出影響栗蘑多糖含量的關(guān)鍵因素，通過響應(yīng)面法確定關(guān)鍵因素的最佳用量和配比。結(jié)果表明：栗蘑菌株虹灰1號液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為：黃豆粉15g/L、玉米粉17.25g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀2.237g/L、硫酸鎂2g/L、蛋白胨5.88g/L，并在pH自然、25℃、140r/min條件下培養(yǎng)，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了76.03%。

關(guān)鍵詞：栗蘑；胞外多糖；發(fā)酵優(yōu)化；響應(yīng)面分析

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）14-0030-05

Abstract：The objective of the present study was the optimization of liquid fermentation medium for producing polysaccharide by Chestnut mushroom by the single factor tests and response surface methodology. Overall research was preceded by rational design. Technological condition parameters were determined according to regression analysis by Design-Expert 7.1.6. The RSM is feasible for optimum extraction process and this will improve the liquid fermentation medium for producing polysaccharide . The optimum condition was as follows：soybean powder 15g/L，corn flour 17.25g/L，glucose 20g/L ，KH2PO4 2.237g/L，MgSO4 2g/L and peptone 5.88g/L，pH7.0，25℃，140r/min，production increased by 76.03% than before optimization.

Key words：Chestnut mushroom；Extracellular polysaccharide；Fermentation optimization；Response surface analysis

栗蘑，又名灰樹花、舞茸，是一種集食用和藥用于一體的菇類，味道和口感俱佳，并且具有良好的藥效，其中栗蘑多糖具有很好的抗癌作用[1]。栗蘑多糖是由葡聚糖及少量蛋白質(zhì)的異聚糖復(fù)合物組成的，主要是以通過β-（1-6）糖苷鍵結(jié)合為主鏈的葡聚糖和以通過β-（1-3）糖苷鍵結(jié)合為主鏈的葡聚糖的混合活性葡聚糖。傳統(tǒng)提取栗蘑多糖的方法是從野生栗蘑中獲得，然而野生栗蘑數(shù)量有限，并且只有在達到一定樹齡的老樹根部才會生長，難以規(guī)?；a(chǎn)[2-3]。而人工栽培栗蘑子實體同樣存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量有限的問題。通過現(xiàn)代的液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)可以在短時間內(nèi)獲到大量的栗蘑菌種的發(fā)酵產(chǎn)物，研究表明，液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的栗蘑菌絲體與野生或人工栽培得到的栗蘑在化學(xué)成分或生理功能上均很相似，并且發(fā)酵液中含有較多的栗蘑多糖。近年來，栗蘑多糖液體發(fā)酵的研究取得了長足進展，但由于栗蘑菌株及培養(yǎng)基配方等原因，使培養(yǎng)產(chǎn)物有諸多差異。為此，本研究分別采用單因素試驗、PB設(shè)計、中心組合試驗以及響應(yīng)面法，系統(tǒng)全面地對栗蘑多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化，以期篩選出最佳的培養(yǎng)基配方，從而對栗蘑多糖的發(fā)酵生產(chǎn)提供指導(dǎo)[4]。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑 菌種：栗蘑試管菌種（購自唐山食用菌社）。試劑：土豆，黃豆，玉米粉（均購自同達森客超市）；葡萄糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硝酸銨，氯化銨，硫酸銨（均為分析純），蛋白胨，酵母粉，實驗室已具有。

1.2 儀器與設(shè)備 KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司），生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器有限公司；型號 SPX-250），手提式蒸汽滅菌器（江陰濱江設(shè)備有限公司），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），100g手提式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），超凈工作臺（上海智誠；型號ZHJH-C1112B），恒溫震蕩培養(yǎng)器（上海智誠；型號ZWY-100D），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊；型號GZX-9146MBE）。

1.3 方法

1.3.1 試驗流程及操作要點 菌種的活化→種子液的制備→單因素試驗→響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件→驗證試驗。具體步驟為：先將菌種在PDA培養(yǎng)基上活化，并用搖床培養(yǎng)法制備種子液，條件為25℃、140r/min。種子液制備好后進行單因素試驗，即選擇不同碳源、氮源、無機鹽對其進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，條件同上，測定栗蘑多糖含量，初步得出各因素對其的影響。再用響應(yīng)面法對其營養(yǎng)條件進一步優(yōu)化，通過驗證性試驗證明響應(yīng)面方法優(yōu)化得出栗蘑多糖的最佳發(fā)酵工藝條件是否具有良好的效果。

1.3.2 菌種的活化 將買回的菌種用已消毒的器具挖取1cm2大小，然后接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃通風(fēng)培養(yǎng)20d左右，待長出菌絲體后，存于4℃冰箱備用[7]。

1.3.3 接種及培養(yǎng)方法 選取250mL錐形瓶緩慢倒入100mL已經(jīng)配好的種子培養(yǎng)液，從制好的菌株中挖取少許菌絲體，加入錐形瓶中，25℃、140r/min條件下培養(yǎng)5d，制成種子液。選取500mL錐形瓶加入150mL發(fā)酵培養(yǎng)液，接入15mL種子液，25℃、140r/min條件下培養(yǎng)6d[7]。

1.3.4 多糖的提取及測定 參加文獻[8-9]。

1.3.5 單因素試驗 對碳源的5個水平（葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、玉米粉），氮源的5個水平（牛肉膏、蛋白胨、黃豆粉、氯化銨、硝酸銨），無機鹽的5個水平（磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、氯化鈣）分別進行發(fā)酵培養(yǎng)并測定栗蘑多糖含量，各因素均設(shè)有對照組，每一水平均設(shè)有3個平行實驗。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計 根據(jù)前期單因素試驗，選用N=12的Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計，對黃豆粉（A）、玉米粉（B）、葡萄糖（C）、磷酸二氫鉀（D）、硫酸鎂（E）和蛋白胨（F）這6個因素進行編排組合并通過試驗進行篩選，同時增加5個虛擬變量。每個因素取“一高一低”2個水平，以栗蘑多糖的含量（g/L）為響應(yīng)值，如表1所示。

1.3.7 最陡爬坡試驗 用最陡爬坡法可以快速有效地進入最優(yōu)點所在的臨近區(qū)域。而且可以根據(jù)Plackett-Burman（PB）試驗結(jié)果中篩選出的顯著因子的效應(yīng)大小來確定最陡爬坡試驗的方向和梯度，其他因素均取最大值，測定栗蘑多糖含量的變化趨勢，確定后續(xù)試驗因素的中心。

1.3.8 Box-Behnken Design響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)上述Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗中確定的試驗因素及最佳點，采用Box-Behnken Design法進行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，以此得到最佳的配方，如表2。

1.3.9 驗證試驗 將優(yōu)化后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方配置成培養(yǎng)液，以10%的接種量接入栗蘑菌種25℃，140r/min條件下培養(yǎng)6d，測定栗蘑多糖的含量，并重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果 單因素碳源、氮源、無機鹽對栗蘑多糖的含量均有影響，如圖1所示。由圖1可知，玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨3種因素對栗蘑多糖含量的影響較為明顯，為進一步確定發(fā)酵培養(yǎng)條件的最佳用量，需通過響應(yīng)面進一步優(yōu)化。

2.2 Plackett-Buman試驗篩選顯著因子 Plackett-Buman實驗設(shè)計和結(jié)果見表3，因素效應(yīng)分析和重要性評估見表4。從表4可以看到，A（黃豆粉）、B（玉米粉）、C（葡萄糖）、D（磷酸二氫鉀）、E（硫酸鎂）、F（蛋白胨）這6個因素的系數(shù)均為正數(shù)，即A、B、C、D、E、F這6個因素對栗蘑多糖含量影響都是正效應(yīng)，也就是說隨著這些因素水平的增加，栗蘑多糖含量逐漸增加。6個因素對實驗結(jié)果的F值（貢獻率）的大小排序依次為：D（磷酸二氫鉀）>F（蛋白胨）>B（玉米粉）>E（硫酸鎂）>C（葡萄糖）>A（黃豆粉）。其中磷酸二氫鉀的P值小于0.01，影響極為顯著；蛋白胨和玉米粉的P值小于0.05，影響顯著。所以選用這3個因素作為主要的研究對象作后續(xù)研究。

2.3 最陡爬坡試驗確定最大相應(yīng)區(qū)域 對Plackett-Buman實驗篩選出的顯著因子玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨進行最陡爬坡試驗，3個因子對栗蘑多糖含量的影響均為正效應(yīng)，所以各個因素梯度為上升方向。試驗設(shè)計見表5。

通過表5可以得到，隨著玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨濃度的增加，栗蘑多糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。栗蘑多糖含量出現(xiàn)最大值是在試驗3中，所以該處是最大的影響區(qū)域。因此選用此條件作為后續(xù)響應(yīng)面的中心點。

2.4 多元二次回歸的模型建立及分析方差 以玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨3個因子作為為變量并分別標號為X、Y、Z，以栗蘑多糖含量作為為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken Design試驗。以上數(shù)據(jù)均通過Design-Expert 7.1.6軟件輔助完成并進行分析，設(shè)計和結(jié)果見表6。

利用Design-Expert 7.1.6軟件對上表中數(shù)據(jù)進行編程，得到回歸方程：

由表7進行回歸模型的方差分析。

通過方差分析可以看出，該模型的Prob>F值是<0.000 1的，也就是說結(jié)果的額差異性只有0.01%的概率是由于誤差引起的，表明此模型差異極其顯著，可以接受；失擬項Prob>F值是0.760 6，大于0.05表明失擬項不顯著，說明模型在整個回歸區(qū)域內(nèi)有很好的擬合度，與真實的響應(yīng)面情況接近，說明模型建立合理。CV表示模型的精確度，CV值越低，說明模型可信度越高，本次試驗?zāi)Ｐ偷腃V=0.17%比較低，可信度高，表明試驗可以信服。模型的決定系數(shù)R2=99.53%，說明預(yù)測值和實際值間具有高度相關(guān)性，能解釋的響應(yīng)值變化，所以可以用此模型對栗蘑多糖的含量進行測量。

2.5 響應(yīng)面交互作用分析及尋求最優(yōu)點 根據(jù)表6繪制S隨X、Y、Z變化關(guān)系的響應(yīng)面立體圖，如圖2所示。由圖2可知，S值（栗蘑多糖含量）在試驗區(qū)有最大值。通過建立的回歸的模型可以估測，S的最大值為2.49g/L，此時X（-0.55）、Y（0.47）、Z（-0.06）即玉米粉17.25g/L、磷酸二氫鉀2.237g/L，蛋白胨5.88g/L。

從響應(yīng)面的最高點和等值線可以直觀的看出，在所選范圍內(nèi)存在極值，也就是響應(yīng)面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。當?shù)鞍纂宋挥谥行狞c時，磷酸二氫鉀添加量對響應(yīng)值峰值的影響較玉米粉添加量影響大，當磷酸二氫鉀處于中心點時，玉米粉的添加量對響應(yīng)值峰值的影響較蛋白胨添加量影響大；當玉米粉處于中心點時，磷酸二氫鉀的添加量對響應(yīng)值峰值的影響較蛋白胨添加量影響大。響應(yīng)面圖分析與方差分析相符，表明通過本試驗建立的栗蘑多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基模型是合適的模型。

2.6 擬合優(yōu)化的驗證 為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果是否可靠，在上述條件下經(jīng)3次重復(fù)試驗驗證，預(yù)測值與驗證值接近，實際測得的栗蘑多糖含量為2.48g/L，與估測值相比，其相對誤差很小。因此，通過響應(yīng)面法所得的栗蘑多糖發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)準確可靠，所建立的模型可信度良好。

3 結(jié)論

通過試驗證明，響應(yīng)面分析方法對該栗蘑菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化具有良好的效果。本次研究經(jīng)響應(yīng)面方法優(yōu)化得出栗蘑多糖的最佳發(fā)酵工藝條件為：黃豆粉15g/L、玉米粉17.25g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀2.237g/L、硫酸鎂2g/L、蛋白胨5.88g/L，并在pH自然、25℃、140r/min條件下培養(yǎng)，發(fā)酵栗蘑多糖含量為2.48g/L，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了76.03%。

參考文獻

[1]鄧媛，李皎，楊國武，毛勇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化多黏芽孢桿菌產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國食品添加劑，2015（1）：64-70.

[2]郭云霞，吳國江，魏萌，等.響應(yīng)面法優(yōu)選N-14菌株發(fā)酵黃芪總多糖的工藝條件[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（5）：38-41.

[3]劉麗莎，陶國琴，郭宏，等.響應(yīng)面法優(yōu)化豆乳鏈球菌增殖培養(yǎng)基[J].食品科學(xué)，2014，35（11）：124-128.

[4]張澤生，祖玉姣，余悅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化春雷霉素發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[J].中國抗生素雜志，2014，39（8）：584-589.

[5]李磊，王衛(wèi)國，郭彥亮，等.灰樹花多糖的制備及其生物活性研究進展[J].食品工業(yè)科技，2009（11）：327-331.

[6]葉晶晶，曹寧寧，劉剛，等.蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2014，31（3）：465-472.

[7]呂冬霞，杜偉，范曉艷，等.灰樹花多糖聯(lián)合順鉑對H22肝癌移植瘤小鼠的抑瘤作用研究[J].中國老年學(xué)雜志，2014，（8）：2165-2166.

[8]賀瑩，高麗芳，焦紅英.黑曲霉產(chǎn)糖化酶固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].中國釀造，2013（9）：88-90.

[9]易明花，鄔曉燕，郭薰璟，等.培養(yǎng)基優(yōu)化提高灰樹花胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的研究.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2014，53（6）：1378-1381.

（責編：張宏民）