魚腥草組分對(duì)生物膜的抑制作用及其應(yīng)用

李成，婁在祥，王洪新（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫214122）

魚腥草組分對(duì)生物膜的抑制作用及其應(yīng)用

李成1，2，婁在祥1，2，王洪新1，2
（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫214122）

研究了體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫的魚腥草柱層析組分對(duì)細(xì)菌生物膜的抑制活性，發(fā)現(xiàn)魚腥草組分質(zhì)量濃度在4.0 mg/mL的時(shí)候，對(duì)E.coli生物膜及Salmonella typhimurium生物膜形成的抑制率均為100%，同時(shí)魚腥草組分在3.0 mg/mL和4.0 mg/mL時(shí)分別完全能夠抑制E.coli和Salmonella typhimurium的生長(zhǎng)。對(duì)魚腥草組分進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)其主要成分為3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷以及槲皮素。同時(shí)研究了魚腥草柱層析組分對(duì)冷藏豬肉的保鮮效果，對(duì)微生物含量、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、pH以及汁液流失率均有積極效果，在柱層析組分質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的時(shí)候，每克肉品在15 d時(shí)微生物數(shù)量對(duì)數(shù)值達(dá)到5.95，而此時(shí)對(duì)照組微生物數(shù)量對(duì)數(shù)值為8.01。結(jié)果表明，魚腥草柱層析組分在冷藏豬肉貯存中具有一定的應(yīng)用潛力。

魚腥草；生物膜；活性；冷藏肉；貯存

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而在固體表面上生長(zhǎng)的一種與游走態(tài)細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的存在形式。生物膜細(xì)菌與游離或浮游的細(xì)菌在形態(tài)和生理特征上均有著顯著的區(qū)別。由于膜的包裹，化學(xué)品很難有效地滲入生物膜，因而很難將膜內(nèi)的細(xì)菌鈍化，其對(duì)抗生素的抵抗力要比自由存在的單個(gè)細(xì)菌高1 000倍以上［1-2］。冷藏豬肉是生鮮豬肉的一種新型消費(fèi)形態(tài)，代表著生鮮豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)的發(fā)展方向。但是在貯存過程中因?yàn)槲廴疚⑸锏纳L(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)品的腐敗，這一直是困擾生產(chǎn)者的一個(gè)重要問題，同時(shí)也是消費(fèi)者最為關(guān)注的肉品安全的核心問題。由于細(xì)菌生物膜是抑制細(xì)菌的關(guān)鍵，因此在生鮮豬肉貯存期間，保鮮過程中抑制其生物膜的形成有著至關(guān)重要的作用［3］。

魚腥草（Houttuynia cordata）屬三白草科蕺菜屬野生草本植物，分布在長(zhǎng)江以南及西藏等省區(qū)。魚腥草中VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)202.5 mg/kg，是小白菜VC含量的2.3倍；有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.264%，與商品腌菜含量相當(dāng)；氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.158%，是一種比較理想的野生蔬菜［4-5］。以往對(duì)魚腥草的藥用及藥理的研究較多，但對(duì)魚腥草抑菌防腐作用的研究甚少。本文在上述基礎(chǔ)上探究了魚腥草柱層析組分對(duì)E.coli及Salmonella typhimurium生物膜的抑制作用，同時(shí)研討了在冷藏豬肉貯存過程中的應(yīng)用，為下一步魚腥草在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

魚腥草，市購(gòu)。新鮮的原料豬肉（屠宰后12 h以內(nèi)）去骨前腿肉，購(gòu)于無錫華潤(rùn)萬家超市。

1.2供試菌株及其培養(yǎng)基

大腸桿菌（E.coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，水1 000 mL，pH 7.0。

1.3試劑與設(shè)備

試劑為分析純或色譜純；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，紫外分光光度計(jì)，DELTA320型針探式自動(dòng)酸度測(cè)試儀。

1.4樣品處理

魚腥草干品與體積分?jǐn)?shù)30%乙醇以1∶15的料液比混合攪拌12 h，經(jīng)過離心抽濾、原液濃縮，用HPD/100大孔樹脂柱層析，分別用3倍柱體積的純水、體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液和體積分?jǐn)?shù)65%乙醇溶液進(jìn)行柱層析，取體積分?jǐn)?shù)30%層析液進(jìn)行濃縮干燥，得到樣品柱層析組分，保存待用。

1.5成分分析

將得到的體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫的魚腥草柱層析組分配成1 mg/mL的樣品甲醇溶液，過0.45 μm濾膜，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析測(cè)量。用Sunfire C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm），甲醇與水（含2 mmol/L乙酸銨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式、外標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)譜定量分析，分析時(shí)間為12 min［6］。

1.6對(duì)生物膜的抑制作用

用24孔平底組織培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)菌生物膜，每孔加入100 μL菌液和2 mL培養(yǎng)基，空白對(duì)照孔只加培養(yǎng)液，每株菌作6個(gè)復(fù)孔，37℃靜止培養(yǎng)，取24 h生物膜培養(yǎng)物進(jìn)行定量分析。每個(gè)菌株取3個(gè)復(fù)孔，吸掉培養(yǎng)物，用無菌磷酸緩沖液沖洗，干燥2 h固定，室溫干燥，加入150 μL 0.25 g/L的結(jié)晶紫染液，室溫染色15 min，用生理鹽水沖洗后晾干，每孔加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇150 μL，室溫脫色90 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm下測(cè)量吸光度［7-8］。

1.7對(duì)E.coli及Salmonella typhimurium生存能力的影響

在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取適當(dāng)?shù)聂~腥草柱層析組分濃度，加入試管培養(yǎng)24 h后取出靜置一段時(shí)間，觀察試管中液體的澄清度，澄清透明組濃度即為最小抑菌濃度［9-10］。

1.8對(duì)冷藏豬肉保鮮效果的影響

事先用體積分?jǐn)?shù)75%酒精棉球擦拭刀具和案板，將購(gòu)回的肉去掉筋膜，切成約100 g左右的肉塊，隨機(jī)分為對(duì)照組和魚腥草柱層析組分組，每組24塊。將3組的肉塊分別浸入無菌蒸餾水和配好的2.0、4.0 mg/mL的體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫的魚腥草柱層析組分的溶液中1 min，取出自然瀝干5 min，然后用保鮮膜包裝，放在（3±1）℃溫度冰箱貯存。將處理后的樣品分別在0、3、6、9、12、15、18、21 d測(cè)定下列各項(xiàng)指標(biāo)［11-16］。

1.8.1感官品質(zhì)測(cè)定通過感覺器官，主要觀察肉樣表面和切面的狀態(tài)，如色澤、黏度、彈性、氣味等狀況，并做出判定。參照GB2706-94中豬肉感官指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)色澤、組織狀態(tài)、黏度、氣味、煮沸后肉湯5項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)定。并采納Williams介紹的9點(diǎn)評(píng)分法作評(píng)分。本實(shí)驗(yàn)取6分及6分以上為消費(fèi)者可接收的肉樣，即是否達(dá)到6分為肉樣貨架壽命終點(diǎn)。

1.8.2微生物指標(biāo)測(cè)定在超凈臺(tái)內(nèi)取25 g肉樣置于滅菌研缽內(nèi)，充分研磨后加滅菌生理鹽水轉(zhuǎn)移至三角瓶中，充分振蕩制成體積比1∶10的稀釋液，用滅菌移液管吸取稀釋液再次配制成體積比1∶100以及體積比1∶1 000的稀釋液并如此每次遞增稀釋。根據(jù)肉樣腐敗程度，選擇2個(gè)適宜的稀釋度，吸取200 μL置于固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.8.3揮發(fā)性鹽基總氮（TVB-N）的測(cè)定稱取肉樣5 g置于250 mL的具塞錐形瓶中，加100 mL蒸餾水振蕩搖勻30 min，上清液即為樣液。按照GB/ T5000.44-96進(jìn)行，取10 mL樣液注入蒸餾裝置反應(yīng)室，再加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%氧化鎂溶液，蒸餾10 min，尾端流入硼酸溶液中（按體積比1∶1添加0.1 g/dL甲基紅乙醇溶液及0.5 g/dL溴甲酚綠乙醇溶液），吸收液用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定。

1.8.4汁液流失率每次測(cè)量時(shí)打開包裝袋取出樣品稱質(zhì)量，所測(cè)質(zhì)量和原來的質(zhì)量之差即為汁液流失量。

1.8.5pH的測(cè)定采用DELTA320型針探式自動(dòng)酸度測(cè)試儀測(cè)試。每次測(cè)試肉樣3個(gè)點(diǎn)，計(jì)算平均值，即為肉樣在該貯存時(shí)間下的pH。

2　結(jié)果與分析

2.1成分分析

體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫的魚腥草柱層析組分色譜圖如圖1所示。

圖1　體積分?jǐn)?shù)30%魚腥草柱層析組分色譜圖Fig.1　Chromatogram of Houttuynia cordata eluted by 30%ethanol

峰1，保留時(shí)間1.22 min，ESI-MS（m/z）：153［MH］-，其相對(duì)分子質(zhì)量為154，UV λmax=261 nm，并將這些信息與3，4-二羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜進(jìn)行比較，比較分析兩者的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)化合物1的信息與3，4-二羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的特征相同，因此化合物1鑒定為3，4-二羥基苯甲酸。

峰2，保留時(shí)間1.99 min，ESI-MS（m/z）：353［MH］-，其相對(duì)分子質(zhì)量為354，UV λmax=326 nm，保留時(shí)間、質(zhì)譜、紫外光譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸的特征相同，并且有特征碎片離子m/z 191，因此化合物2可鑒定為綠原酸。

峰3，保留時(shí)間3.97 min，ESI-MS（m/z）：609［MH］-，其相對(duì)分子質(zhì)量為610，UV λmax=353 nm，保留時(shí)間、質(zhì)譜、紫外光譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的特征相同，結(jié)合碎片離子m/z 463，可鑒定化合物3為蘆丁。

峰4，保留時(shí)間4.06 min，ESI-MS（m/z）：463［MH］-，其相對(duì)分子質(zhì)量為464，UV λmax=360 nm，保留時(shí)間、質(zhì)譜、紫外光譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品金絲桃苷的特征相同，因此化合物4鑒定為金絲桃苷。

峰5，保留時(shí)間4.82 min，ESI-MS（m/z）：447［MH］-，其相對(duì)分子質(zhì)量為448，UV λmax=326 nm，保留時(shí)間、質(zhì)譜、紫外光譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮苷的特征相同，因此化合物5鑒定為槲皮苷。

峰6，保留時(shí)間4.82 min，ESI-MS（m/z）：301［MH］-，其相對(duì)分子質(zhì)量為302，UV λmax=256、371 nm，保留時(shí)間、質(zhì)譜、紫外光譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的特征相同，結(jié)合特征碎片離子m/z 267、229，可鑒定化合物6為槲皮素。

2.2對(duì)生物膜形成的抑制作用

將魚腥草柱層析組分溶解于蒸餾水中，測(cè)定其對(duì)E.coli及Salmonella typhimurium生物膜形成的影響，最終質(zhì)量濃度分別定為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL，以蒸餾水為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同質(zhì)量濃度魚腥草組分對(duì)細(xì)菌生物膜的抑制率Fig.2　Inhibition rate of bacterial biofilm by different concentrations of H.cordata fractions

可以看出，隨著魚腥草柱層析組分質(zhì)量濃度的增加，對(duì)兩種細(xì)菌生物膜形成的抑制率也逐漸升高。并且當(dāng)柱層析組分最終質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，對(duì)E.coli生物膜形成的抑制率為100%。最終質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，對(duì)Salmonella typhimurium生物膜形成的抑制率也為100%。

2.3對(duì)E.coli和Salmonella typhimurium生存能力的影響

通過測(cè)定體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫的魚腥草柱層析組分對(duì)兩種細(xì)菌的MIC（最低抑菌質(zhì)量濃度），發(fā)現(xiàn)對(duì)Salmonella typhimurium的MIC為4.0 mg/mL，對(duì)E.coli的MIC為3.0 mg/mL。

2.4對(duì)冷藏豬肉保鮮效果的影響

2.4.1肉樣整體感官品質(zhì)的變化經(jīng)過魚腥草柱層析組分處理的肉樣和未經(jīng)處理的肉樣在貯存期間整體感官品質(zhì)變化如表1所示。

表1　魚腥草柱層析組分對(duì)肉樣整體感官品質(zhì)評(píng)分的影響Table 1　Sense effects of three samples by different concentrations of H.cordata fractions

從表1可以看出，3組肉樣整體感官評(píng)分均隨貯存期的增長(zhǎng)而下降。其中各組在0 d感官評(píng)分區(qū)別不大，4.0 mg/mL組由于其添加柱層析組分濃度較大，導(dǎo)致色澤變暗。另外可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組貨架期為9 d，而魚腥草作用后2.0 mg/mL組仍為9 d，4.0 mg/mL組為12 d，總體感官品質(zhì)評(píng)分（包括色澤、組織狀態(tài)、黏度和氣味）稍高于對(duì)照組，但添加魚腥草組分對(duì)肉樣色澤以及氣味均有不利影響。2.4.2肉樣微生物含量的變化經(jīng)過魚腥草柱層析組分處理后的肉樣以及未經(jīng)處理肉樣在貯存過程中微生物含量的變化如圖3所示。可以看到，肉樣在貯存過程中微生物的含量整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，同時(shí)魚腥草柱層析組分對(duì)微生物有明顯的抑制作用，而且柱層析組分質(zhì)量濃度升高對(duì)抑制效果有積極作用。在21 d的時(shí)候，對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)對(duì)數(shù)值為9.74，2.0 mg/mL組為9.28，4.0 mg/mL組為7.59。此時(shí)在4.0 mg/mL魚腥草柱層析組分中浸泡的肉樣剛超過7（冷藏肉腐敗的極限值）。

2.4.3揮發(fā)性鹽基總氮（TVB-N）的變化經(jīng)過魚腥草柱層析組分處理后的肉樣及未經(jīng)處理肉樣在貯存過程中TVB-N值的變化如圖4所示?？梢钥闯?，在6 d以后3組肉樣中TVB-N值都開始快速增加，到21 d對(duì)照組中TVB-N值達(dá)到103.21 mg/hg，而添加魚腥草柱層析組分的兩組明顯小于對(duì)照組，這說明魚腥草柱層析組分的保鮮效果明顯。

圖3　冷藏豬肉在冷藏過程中微生物含量的變化Fig.3　Changes of the bacteria counts of chilled pork during the storage

圖4　冷藏豬肉在冷藏過程中TVB-N值的變化Fig.4　Change of the TVB-Nvalue of chilled pork during the storage

2.4.4汁液流失率的變化經(jīng)過魚腥草柱層析組分處理后的肉樣以及未經(jīng)處理肉樣在貯存過程中汁液流失率的變化如圖5所示。

圖5　冷藏豬肉在冷藏過程中汁液流失率的變化Fig.5　Changes of the drop loss of chilled pork during the storage

可以看出，肉樣隨著貯存時(shí)間的增加汁液流失率亦在不斷上升，即加入魚腥草柱層析組分并沒有對(duì)其產(chǎn)生減緩作用，可能是由于魚腥草柱層析組分導(dǎo)致肌肉組織外部滲透壓高，使部分水分流出組織，因而比對(duì)照組汁液流失率更高些。

2.4.5肉樣pH的變化經(jīng)過魚腥草柱層析組分處理后的肉樣以及未經(jīng)處理肉樣在貯存過程中pH的變化如圖6所示?？梢钥闯?，pH在貯存過程中出現(xiàn)整體升高的走勢(shì)。與對(duì)照組對(duì)比，加魚腥草柱層析組分組的樣品pH在升高過程中明顯趨緩，這說明魚腥草柱層析組分保鮮效果明顯。肉樣貯存過程中，由于其自身的成熟過程，肉組織細(xì)胞中產(chǎn)生部分乳酸、磷酸等酸性物質(zhì)，致使剛開始pH變化不大甚至有所降低，但隨著貯存時(shí)間的增加，肉樣中的腐敗菌以葡萄糖、氨基酸、乳酸等為底物，代謝產(chǎn)生了硫化物、分子胺類物質(zhì)以及揮發(fā)性氨，導(dǎo)致肉樣pH升高［13］。魚腥草柱層析組分的添加明顯減緩了肉樣pH的上升速度，因此魚腥草柱層析組分對(duì)冷藏豬肉保鮮過程中的pH有積極作用。

圖6　冷藏豬肉在冷藏過程中pH的變化Fig.6　Changes of the pH of chilled pork during the storage

3　結(jié)語

研究了魚腥草柱層析組分對(duì)E.coli及Salmonella typhimurium生物膜的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制這兩種細(xì)菌生物膜的形成，而且能夠完全抑制兩種菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，通過研究魚腥草組分對(duì)冷藏豬肉貯存期間各項(xiàng)保鮮指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)有較好的保鮮效果，但各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)不同。其中微生物含量變化和TVB-N值變化最能反映冷藏豬肉貯存過程中的腐敗狀況。3，4-二羥基苯甲酸、綠原酸與蘆丁被證明具有良好的抑菌效果，因此可以推斷這3種成分是在冷藏豬肉貯存過程中起保鮮作用的主要成分［17］。魚腥草是一種常見的蔬菜，其組分對(duì)致病菌的生存及其生物膜形成具有良好的抑制效果。因此，作為一種安全無毒副作用的抑菌防腐劑，魚腥草柱層析組分在肉制品等食品保藏中會(huì)有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

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Components of Houttuynia conrdata on the Inhibition of Bacterial Biofilm and Its Application

LI Cheng1，2，LOU Zaixiang1，2，WANG Hongxin1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Functional Food Engineering Technology Research Center，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The inhibition of bacterial biofilm activity by 30%ethanol elution of Houttuynia cordata was studied.The results showed that the inhibition rates of E.coli and Salmonella typhimurium biofilms were up to 100%when the extract concentration of H.cordata was 4.0 mg/mL.At the same time，the growth of E.coli and S.typhimurium were inhibited by H.cordata extract when its concentrations were 3.0 and 4.0 mg/mL，respectively.Further analysis of its extracts showed that 3，4-dihydroxy benzoic acid，chlorogenic acid，rutin，hyperin，quercetin，and quercetin were its main components.Meanwhile，the effect of preservation of chilled pork by the extracts of H.cordata were also studied.The results exhibited that the microbial content，volatile base nitrogen（TVB-N），pH and SAP turnover rate all had positive effects after the addition of the extractions.The total number of bacteria in per gram of the pork treated by 4.0 mg/mL extract was 5.95 at 15th d，while the control group was 8.01.The results suggested that the extraction of H.cordata had potential applications in chilled pork during storage.

Houttuynia cordata，biofilm，activity，chilled pork，preservation

TS 202；TS 205

A

1673—1689（2016）03—0284—06

2014-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201433）。

王洪新（1964—），男，江蘇徐州人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品功能因子和功能食品研究開發(fā)。

E-mail：hxwang@jiangnan.edu.cn