一種SUMO-Heparinase I融合酶的可溶性表達(dá)與純化

趙善成，王振，程詠梅，陳敬華*，2（.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫2422；2.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫2422）

一種SUMO-Heparinase I融合酶的可溶性表達(dá)與純化

趙善成1，王振1，程詠梅1，陳敬華*1，2
（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

克隆自肝素黃桿菌（Flavobacteriumheparinum）的肝素酶I（Heparinase I，EC4.2.2.7）廣泛應(yīng)用于低相對分子質(zhì)量肝素（LMWH，low molecular weight heparin）制備研究。然而，該酶在大腸桿菌表達(dá)體系中易形成包涵體，限制了其大量應(yīng)用。將可溶性配體SUMO（small ubiquitin-like modifier，小泛素類似修飾蛋白質(zhì)）與C端帶有6×His標(biāo)簽的肝素酶基因片段N-端融合表達(dá)，菌體總蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳表明，N端融合SUMO的肝素酶I可溶性表達(dá)比率顯著提高；通過鎳-親和柱層析得到均一純化的融合肝素酶I，融合酶酶學(xué)性質(zhì)表明該融合酶可直接應(yīng)用于肝素降解而無需切除SUMO標(biāo)簽，為肝素酶I的廣泛應(yīng)用提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：肝素酶I；小泛素類似修飾蛋白質(zhì)；融合表達(dá)；可溶性表達(dá)

肝素酶是一類特異性降解肝素和類肝素多糖的裂解酶，可用于病人體外治療血液中殘存肝素的有效去除、血液肝素濃度水平的測定、肝素類多糖的序列分析，以及真核細(xì)胞表面肝素類多糖的結(jié)構(gòu)-功能研究［1-3］。其中，肝素酶I降解肝素制備低相對分子質(zhì)量肝素以質(zhì)量高、條件溫和、易控制和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［4］，受到了研究人員越來越多的關(guān)注。

相較于肝素黃桿菌發(fā)酵法制備肝素酶I，采用pET表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中重組表達(dá)肝素酶I，可顯著提高肝素酶I的產(chǎn)量和產(chǎn)品純度［5］。然而，大腸桿菌表達(dá)體系中肝素酶I的非可溶性表達(dá)和易失活極大地限制了其大規(guī)模應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的融合表達(dá)策略采用基因工程手段將編碼靶蛋白質(zhì)的基因片段與編碼可溶性配體的基因片段融合共表達(dá)，可以降低重組蛋白質(zhì)的降解，改善蛋白質(zhì)折疊，是一種有效提高蛋白質(zhì)可溶性從而促進(jìn)其蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法［6］。之前的研究發(fā)現(xiàn)，選用MBP （maltose-bindingprotein）、GST（glutathioneS-transferas）這類相對分子質(zhì)量較大的標(biāo)簽融合表達(dá)肝素酶I可顯著改善其可溶性［7-8］，但是需要在較低的誘導(dǎo)溫度如15℃以下表達(dá)靶蛋白質(zhì)，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而CBD（cellulose-binding domain）融合的肝素酶I表達(dá)后依然主要以包涵體形式存在［9］。除了這些較大的標(biāo)簽蛋白質(zhì)之外，組氨酸等較小相對分子質(zhì)量標(biāo)簽的融合酶易于純化卻無助于改善可溶性。SUMO（small ubiquitin-like modifier）是一種相對分子質(zhì)量只有11.5 kDa的較小的標(biāo)簽蛋白質(zhì)［10］，已成功應(yīng)用于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒3CL蛋白酶、核衣殼蛋白質(zhì)、膜蛋白質(zhì)以及基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrixmetalloprotease-13，MMP13）、生長分化因子8（growth differentiating factor-8，GDF8）的可溶性表達(dá)［11-12］。除此之外，去除SUMO標(biāo)簽所用的SUMO蛋白酶具有高保真性，可精確識別SUMO標(biāo)簽的三級結(jié)構(gòu)，因此剪切時會保留靶蛋白質(zhì)的末端序列尤其是N-端與生物活性密切相關(guān)的序列［13］。

基于上述考慮，擬選用SUMO這一相對分子質(zhì)量更小的助溶性配體標(biāo)簽，將SUMO標(biāo)簽蛋白基因片段與肝素酶I基因片段通過重疊PCR方法構(gòu)建重組pET-30a-SUMO-Hep I表達(dá)載體，將SUMO蛋白質(zhì)與肝素酶I N-端融合表達(dá)，探索其對于肝素酶I可溶性表達(dá)的促進(jìn)作用。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1菌種、質(zhì)粒和引物E.coli DH5α，E.coli BL21 （DE3），E.ColiRosseta（DE3），pMD-19T-SUMO，pMD-19T-Hep I和pET-30a（+），pET-30a（+）-Hep I質(zhì)粒，作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；Ulp1蛋白酶，作者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存；pMD-19T（simple），購自大連寶生物工程有限公司；PCR引物F1：5′-CATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA-3′（Nde I），R1：5′-CCGGATTTTTTTTGCTGACCTCCAATCTG TTCG-3′，F(xiàn)2：5′-GATTGGAGGTCAGCAAAAAAAAT CCG-3′，R2：5′-GGATCCGATCTGGCAGTTCGCTG-3′（BamH I），均由上海生物工程有限公司合成。

1.1.2工具酶、試劑盒和儀器Ex Taq酶，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I，購自大連寶生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自上海生物工程有限公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)（GE AKTA prime plus），HisTrap HP，購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1SUMO-Hep I基因擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）-SUMO-Hep I的構(gòu)建采用重疊PCR方法擴(kuò)增SUMO-HepI，擴(kuò)增過程見圖1。PCR反應(yīng)條件為：98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后與pMD-19T（simple）克隆載體16℃連接過夜。連接產(chǎn)物pMD-SUMO-Hep I轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，通過Amp抗性和藍(lán)白斑篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。對經(jīng)測序驗(yàn)證的重組克隆載體pMD-SUMOHep I和表達(dá)載體pET-30a（+）進(jìn)行雙酶切并回收目的片段，并在T4 DNA連接酶作用下16℃連接過夜，連接產(chǎn)物命名為pET-30a（+）-SUMO-Hep I。pET-30a（+）-SUMO-Hep I轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Rosseta （DE3），從LB平板挑選單克隆，接種于10 mL LB培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL）中，37℃220 r/min過夜培養(yǎng)，甘油終質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%保種并送上海生工測序驗(yàn)證。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）-SUMO-Hep I構(gòu)建流程見圖2。

圖2　重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）-SUMO-Hep I的構(gòu)建示意Fig.2　Diagram of construction of recombinant expression plasmid pET-30a（+）-SUMO-Hep I

1.2.2Hep I-6×His和SUMO-HepI-6×His重組蛋白質(zhì)的表達(dá)將經(jīng)測序驗(yàn)證的保種pET-30a（+）-SUMO-HepI大腸桿菌E.coli Rosseta（DE3），以體積分?jǐn)?shù)1%接種于兩瓶10 mL的LB培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL），37℃220 r/min過夜培養(yǎng)，作為種子液。再以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到50 mL LB培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL），37℃220 r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)0.6～0.8時，加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，25℃220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)10 h。pET-30a （+）-Hep I表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3）在活化后亦按照上述條件誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.3Hep I-6×His和SUMO-Hep I-6×His重組蛋白質(zhì)的純化4℃、9 000 r/min離心10 min收集菌體，Binding Buffer（20 mmol/L Tris，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 7.4）重懸，超聲破碎（200 W，超聲5 s，間歇8 s，工作99個循環(huán)，共3次）后12 000 r/ min離心30 min，上清液用0.45 μm水系膜過濾，過濾液用蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)GE AKTA prime plus進(jìn)行純化。HisTrap HP（5 mL）親和層析純化條件：采用階段梯度洗脫模式，先用5個柱體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的ElutionBuffer（20mmol/LTris，0.5mol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.4）沖洗結(jié)合力的雜蛋白質(zhì)，再采用體積分?jǐn)?shù)50%的Elution Buffer洗脫目的蛋白質(zhì)，體積流量5 mL/min收集洗脫液。純化完畢，BCA法分別測定Hep I-6×His、SUMO-Hep I-6×His的產(chǎn)量。將純化的SUMO-Hep I-6×His與Ulp 1蛋白酶按照質(zhì)量比1 000∶1混合均勻后置于4℃酶切1 h，并按照上述條件進(jìn)行鎳柱親和純化。

1.2.4SUMO-Hep I-6×His酶活表征參照文獻(xiàn)［14］方法對SUMO-Hep I-6×His的相對酶活進(jìn)行測定：在200 μL pH 7.0的緩沖液（0.05 mol/L醋酸鈉、5 mmol/ L醋酸鈣）中加入1 mg肝素，再加入20 μL保存于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%BSA中的HepI。30℃水浴反應(yīng)10min，立即加入0.06 mol/L鹽酸2 mL終止反應(yīng)。3 000 r/ min離心10 min，取上清液測定232 nm處吸光值。一個酶活力單位是指30℃pH 7.0的條件下，在1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol具有Δ4，5不飽和糖醛所需要的酶量，酶活（IU/mL）計(jì)算

上式中，A232為在波長232 nm下測定的紫外吸收值；V1為反應(yīng)液總體積（mL）；V2為加入酶的體積（mL）；T為反應(yīng)時間（min）；反應(yīng)系數(shù)為5.5（μmol/mL）。

測定重組融合蛋白質(zhì)Hep I-6×His和SUMOHep I-6×His的各純化步驟中蛋白質(zhì)含量和酶活性。

2　結(jié)果與討論

2.1SUMO-Hep I編碼序列的擴(kuò)增

見圖3，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，在約300、1 100、1 400 bp處可清楚地觀察到DNA條帶，大小和SUMO編碼片段、Hep I編碼片段，以及SUMO-Hep I編碼片段理論值291、1 155、1 446 bp一致。

圖3　基因電泳圖Fig.3　Gene electrophoresis

2.2pET-30a（+）-SUMO-Hep I重組質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果

表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）-SUMO-Hep I送至上海華大基因公司測序，測序結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒與設(shè)計(jì)基因序列一致，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3Hep I-6×His和SUMO-Hep I-6×His重組蛋白質(zhì)的表達(dá)

如圖4所示，在誘導(dǎo)溫度25℃條件下，融合SUMO標(biāo)簽的肝素酶I呈高水平表達(dá)，且融合后可溶性組分占總蛋白質(zhì)組分由融合SUMO標(biāo)簽前的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（24.28±1.63）%顯著提高至（94.52±3.99）%（圖5），證明采用SUMO融合表達(dá)肝素酶I是一種可提高靶蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的有效策略。

2.4Hep I-6×His和SUMO-Hep I-6×His重組蛋白質(zhì)的純化

如圖6所示，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在43.8 kDa、63.8 kDa分別出現(xiàn)Hep I-6×His、SUMO-Hep I-6×His預(yù)期的單一蛋白質(zhì)條帶。BCA法測定純化酶的產(chǎn)量為Hep I-6×His和SUMO-Hep I-6×His分別為2.2 mg/（0.3 g干質(zhì)量菌體）和3.4 mg/（0.3 g干質(zhì)量菌體），進(jìn)一步表明SUMO標(biāo)簽的融合確有助于提高融合酶的可溶性從而提高其表達(dá)水平。

圖4　SUMO-Hep I-6×His融合表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of fusion expression of SUMOHep I-6×His

圖5　SUMO-Hep I-6×His表達(dá)的可溶性組分與Hep I-6× His表達(dá)的可溶性組分的比較Fig.5　Comparison of the portion of soluble expression of SUMO-Hep I-6×His with Hep I-6×His

圖6　重組SUMO-Hep I-6×His融合蛋白質(zhì)純化效果的SDS-PAGE鑒定Fig.6　SDS-PAGE identification of purification efficiency of recombinant SUMO-Hep I-6×His

2.5SUMO-Hep I-6×His酶活表征

重組融合蛋白質(zhì)SUMO-Hep I-6×His的各純化步驟中蛋白質(zhì)含量和酶活測定結(jié)果如表1所示。

表10　.3 g干質(zhì)量菌體內(nèi)蛋白質(zhì)純化和酶活測定結(jié)果Table 1　Protein purification and enzymatic activity in 0.3 g dry cell mass

結(jié)果表明，使用SUMO標(biāo)簽融合不僅可提高肝素酶I可溶性表達(dá)水平、總酶活和比酶活，每0.3 g干質(zhì)量菌體總的可溶性含粗酶的蛋白質(zhì)由178.7 mg提高到227.1 mg，而且可提高其鎳柱親和純化的回收率和純化倍數(shù)，回收率由64.2%提高到79.2%，證明SUMO標(biāo)簽在改善肝素酶I鎳柱親和純化效果方面具有一定促進(jìn)作用。

此外，SUMO-Hep I-6×His的最適pH和最適溫度表征結(jié)果（圖7）表明，SUMO標(biāo)簽在提高肝素酶I表達(dá)的可溶性的同時，融合肝素酶I的最適pH和最適溫度未發(fā)生改變，與天然肝素酶I基本一致，仍為pH 7.0和30℃［15］。因此SUMO-Hep I-6×His可無需切除SUMO標(biāo)簽直接使用，方便快捷。切除SUMO標(biāo)簽后，單位物質(zhì)的量比酶活恢復(fù)到融合之前，表明SUMO標(biāo)簽有利于肝素酶I酶活的提升，其機(jī)制或影響到肝素酶I三級結(jié)構(gòu)而改變其底物親和力或與其催化效率有關(guān)，這有待進(jìn)一步深入研究。

圖7　SUMO-Hep I-6×His的最適溫度和最適pHFig.7　Optimum temperature and pH of SUMO-Hep I-6× His

3　結(jié)語

難以經(jīng)濟(jì)高效地表達(dá)肝素酶I，一直是限制其大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用尤其是在酶法制備低相對分子質(zhì)量肝素領(lǐng)域應(yīng)用的瓶頸之一。使用SUMO這種較小相對分子質(zhì)量的標(biāo)簽配體蛋白質(zhì)，融合表達(dá)蛋白質(zhì)，可在有效提高靶蛋白質(zhì)可溶性的同時，避免空間位阻效應(yīng)對靶蛋白質(zhì)活性的影響。本研究中利用該性質(zhì)成功構(gòu)建了一種SUMO-Hep I-6×His融合酶，提高了肝素酶I的可溶性表達(dá)，肝素酶I的產(chǎn)量由2.2 mg/（0.3 g干質(zhì)量菌體）提高到3.4 mg/（0.3 g干質(zhì)量菌體），可溶性表達(dá)比率由（24.28±1.63）%顯著提高至（94.52±3.99）%，且無需切除標(biāo)簽可直接應(yīng)用于肝素降解，為肝素酶I的廣泛應(yīng)用提供了一條成功的工藝路線。

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Soluble Expression and Purification of the SUMO-Heparanase I Fusion Enzyme

ZHAO Shancheng1，WANG Zhen1，CHENG Yongmei1，CHEN Jinghua*1，2
（1.School of Pharmaceutical Science，JiangnanUniversity，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Heparinase I cloned from Flavobacterium heparinum was widely used in the preparation of LMWH（low molecular weight heparin）.However，the formation of inclusion bodies when expressed in Escherichia coli limits its application in a large scale.In this study，the soluble partner，small ubiquitin-like modifier（SUMO），was fused to the N-terminus of Hep I gene with a C-terminal 6×histidine tag.SDS-PAGE analysis of total protein in bacteria and soluble fractions indicated that the portion of the soluble Heparinase I fused with SUMO to the N-terminus was significantly enhanced.After purified by the nickel-chelate chromatography，the resulting fusion enzyme could be used directly without removing the fusion SUMO tag，which made the wide application of Heparinase I feasible.

Heparinase I，small ubiquitin-like modifier，fusion expression，soluble expression

O 629.12

A

1673—1689（2016）03—0318—06

2014-12-15

教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20110093110008）。

趙善成（1986—），男，安徽六安人，工學(xué)博士，主要從事肝素類多糖和相關(guān)酶的研究。E-mail：zhaoshancheng2008@163.com

陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com