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    固載脂肪酶納米TiO2/PD復(fù)合材料合成條件優(yōu)化及表征

    2016-09-07 02:10:28鄭述祥陶玉貴朱龍寶堵國成安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院安徽蕪湖241000
    關(guān)鍵詞:載率脂肪酶多巴胺

    鄭述祥,陶玉貴,朱龍寶,堵國成(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

    固載脂肪酶納米TiO2/PD復(fù)合材料合成條件優(yōu)化及表征

    鄭述祥,陶玉貴?,朱龍寶,堵國成
    (安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖241000)

    利用多巴胺(PD)對納米二氧化鈦進(jìn)行修飾,制備固載脂肪酶TiO2/PD復(fù)合材料,并通過響應(yīng)面法對p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間等合成條件進(jìn)行了優(yōu)化,以提高脂肪酶固載率;利用FT-IR、熱分析對TiO2/PD復(fù)合材料進(jìn)行表征.結(jié)果表明:在p H值為8.79、多巴胺質(zhì)量濃度為1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間為7.42 h條件下合成的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率最高,達(dá)到了274.26 mg/g;FT-IR表征中在1 277 cm-1和1 483 cm-1出現(xiàn)的多巴胺特征峰以及熱分析表征中多巴胺在300℃左右出現(xiàn)熱分解,表明了多巴胺對納米二氧化鈦的修飾.利用多巴胺對納米TiO2的表面修飾,有效提高了納米TiO2的脂肪酶固載率.

    納米TiO2;多巴胺;脂肪酶;響應(yīng)面;表征

    脂肪酶又稱三酰甘油酯水解酶(EC3.1.1.3),被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品和化妝品等行業(yè),但游離脂肪酶在使用過程中易隨環(huán)境的變化而變性失活,且不易從反應(yīng)體系中分離,在一定程度上限制了脂肪酶的應(yīng)用[1].固定化酶技術(shù)因具有重復(fù)利用酶催化活性、實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動(dòng)化生產(chǎn)及降低成本等優(yōu)點(diǎn),因而獲得廣泛研究[2].作為固定化技術(shù)的重要組成部分,載體的性能直接影響著酶的性能.納米TiO2具有化學(xué)惰性、無毒無害、生物親和性好等特點(diǎn),成為酶固定化的優(yōu)良載體[3].

    目前,納米TiO2對脂肪酶的固定化主要是通過物理吸附將脂肪酶直接吸附在其表面,其固載率較低[4],因此,需要對TiO2進(jìn)行修飾以提高固載率.修飾可以分為物理修飾和化學(xué)修飾,其中化學(xué)修飾由于載體和修飾劑之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng),修飾效果良好,被廣泛采用[5].目前用于TiO2化學(xué)修飾的修飾劑主要包括聚乙烯亞胺、聚苯胺等,存在著生物毒性大、包裹能力差等缺點(diǎn)[6].多巴胺是一種具有仿生粘附特性的物質(zhì),具有優(yōu)良的生物相容性[7].研究發(fā)現(xiàn),利用多巴胺自氧化聚合可在無機(jī)納米材料表面形成聚多巴胺包覆層[8].Lee[9]等成功地在納米二氧化硅表面修飾一層薄的、具有強(qiáng)黏附性的聚多巴胺層,賦予材料良好的穩(wěn)定性與相容性.Shi J[10]等制備了CaCO3@PDA微球用于固定化過氧化氫酶,結(jié)果表明微球具有較高的固載效率,且過氧化氫酶的穩(wěn)定性增強(qiáng).然而,通過多巴胺自聚合于納米二氧化鈦表面固載脂肪酶的相關(guān)研究報(bào)道較少.

    利用多巴胺(PD)對納米二氧化鈦進(jìn)行修飾,合成TiO2/PD復(fù)合材料,并以脂肪酶固載率為指標(biāo),利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對5個(gè)因素進(jìn)行篩選,再用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化,確定最優(yōu)合成條件,并以此條件合成TiO2/PD復(fù)合材料,利用FT-IR、熱分析對其進(jìn)行表征.

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    鈦酸四正丁酯(CP,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇、氨水、乙腈、磷酸鈉、脂肪酶(AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);鹽酸多巴胺(AR,Sigma公司);BCA試劑盒(AR,生工生物工程股份有限公司).

    1.2納米TiO2及TiO2/PD復(fù)合材料合成方法

    將0.38 g氨水(28%),X(X=0.53,1.06,1.59,2.12,2.64,3.17)g水加入到乙醇和乙腈的混合液(體積比為3∶2)中,快速攪拌;向上述溶液中迅速加入5m L鈦酸四正丁酯,室溫?cái)嚢? h,離心,乙醇、水分別洗兩次,60℃干燥6 h,制得納米TiO2.

    將納米TiO2加入到50 m L Tris-HCl緩沖液(p H 8.5,10 m M)中,超聲分散15 min,加入125 mg鹽酸多巴胺,20℃下攪拌6 h,攪拌速度為500 r/min,離心收集,水洗3次,制得TiO2/PD復(fù)合納米粒子,最后將TiO2/PD復(fù)合粒子分散在超純水中(1 mg/m L).

    1.3TiO2/PD復(fù)合材料固定化脂肪酶

    取0.06 g酶加入到30 m L磷酸鈉緩沖液(10 m M,p H 7.0)中;0.1 g TiO2/PD復(fù)合粒子加入到50 m L超純水中.將兩種溶液混合,4℃攪拌3 h,離心收集,水洗3次,冷凍干燥(-80℃,12 h).

    在MATLAB/Simulink中搭建光儲電站的模型,設(shè)直流母線電壓為400 V,儲能電池的容量為3×103 Ah,電動(dòng)汽車的容量為15 kWh,仿真時(shí)間為24 h。為了突出電動(dòng)汽車對改善光儲電站直流母線電壓質(zhì)量的作用,設(shè)置以下4種算例進(jìn)行驗(yàn)證,分別為無電動(dòng)汽車接入、10輛電動(dòng)汽車接入、10輛電動(dòng)汽車接入(光伏功率發(fā)生波動(dòng))和20輛電動(dòng)汽車接入。

    1.4優(yōu)化方法

    (1)單因素實(shí)驗(yàn).TiO2/PD復(fù)合材料的制備過程一般受p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、攪拌速度、反應(yīng)溫度等因素的影響.其單因素水平為:①反應(yīng)時(shí)間6 h,多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L,攪拌速度500 r/min,反應(yīng)溫度20℃,p H值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5.②p H值8.5,反應(yīng)時(shí)間6 h,攪拌速度500 r/min,反應(yīng)溫度20℃,多巴胺質(zhì)量濃度為0.5 mg/m L、1.0 mg/m L、1.5 mg/m L、2.0 mg/m L、2.5 mg/m L、3.0 mg/m L.③p H值8.5,多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L,攪拌速度500 r/min,反應(yīng)溫度20℃,反應(yīng)時(shí)間為2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、9 h.④p H值8.5,多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L,反應(yīng)時(shí)間6 h,反應(yīng)溫度20℃,攪拌速度為300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min、700 r/min.⑤p H值8.5,多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L,反應(yīng)時(shí)間6 h,500 r/min,反應(yīng)溫度為0、10℃、20℃、30℃、40℃.

    (2)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn).根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取5個(gè)影響因素,進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn),并對其重要性進(jìn)行篩選(自變量、編碼和水平因素見表1).

    表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素與水平表

    (3)Box-Behnken實(shí)驗(yàn).以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得到的顯著影響TiO2/PD復(fù)合材料合成的因素作為設(shè)計(jì)因素,根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表(見表2)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析.

    表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

    1.5固載率的測定方法

    脂肪酶固載率的計(jì)算.脂肪酶固載率=CV/M,其中,C為樣品蛋白濃度(μg/m L);V為體積(m L);M為TiO2/PD復(fù)合材料加入的質(zhì)量(g).

    2 結(jié)果與討論

    2.1TiO2/PD復(fù)合材料合成條件優(yōu)化

    (1)p H值對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.p H值對TiO2/PD復(fù)合材料的合成起著重要作用,在堿性的環(huán)境下多巴胺易發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚多巴胺,從而實(shí)現(xiàn)對納米TiO2的修飾.p H值對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響如圖1所示.由圖1可以看出,隨著p H值的增大,TiO2/PD復(fù)合材料對脂肪酶的固載率增大.在酸性條件下,聚多巴胺形成量較少,導(dǎo)致脂肪酶固載率較低;堿性條件下,聚多巴胺大量形成,脂肪酶固載率得到明顯提高;p H達(dá)到8.5,繼續(xù)增大p H值,脂肪酶的固載率變化不大.因此,選取p H值8.5為最優(yōu)的合成條件.

    (2)多巴胺質(zhì)量濃度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.多巴胺質(zhì)量濃度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響如圖2所示.由圖2可以看出,在多巴胺質(zhì)量濃度為2.0 mg/m L時(shí),TiO2/PD復(fù)合材料的脂肪酶固載率最大,繼續(xù)增加多巴胺質(zhì)量濃度,脂肪酶固載率變化不大,甚至出現(xiàn)固載率降低的現(xiàn)象,這可能是由于過量的多巴胺引起復(fù)合材料的團(tuán)聚,不利于對脂肪酶的固載.選取多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L為最優(yōu)的合成條件.

    圖1 p H值對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

    圖2 多巴胺質(zhì)量濃度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

    (3)反應(yīng)時(shí)間對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.反應(yīng)時(shí)間對TiO2/PD復(fù)合材料合成的影響如圖3所示.由圖3可以看出,在反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí),脂肪酶固載率最大,繼續(xù)延長攪拌時(shí)間,脂肪酶固載率變化不大,這是因?yàn)閿嚢? h,多巴胺已全部發(fā)生反應(yīng).因此,選取反應(yīng)時(shí)間6 h為最優(yōu)合成條件.

    (4)攪拌速度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.攪拌速度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響程度如圖4所示.由圖4可以看出,改變攪拌速度,TiO2/PD復(fù)合材料對脂肪酶固載率發(fā)生了略微變化,變化幅度不大,在500 r/min時(shí)出現(xiàn)峰值,且隨著攪拌速度的增大,也增大了實(shí)驗(yàn)操作的難度.因此,選取攪拌速度500 r/min為最優(yōu)的合成條件.

    圖3 反應(yīng)時(shí)間對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

    圖4 攪拌速度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

    圖5 反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

    (5)反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響情況如圖5所示.由圖5可以看出,隨著反應(yīng)溫度的逐漸升高,TiO2/PD復(fù)合材料對脂肪酶固載率呈現(xiàn)略微增大的趨勢,并且在溫度為20℃時(shí)出現(xiàn)峰值.因此,選取反應(yīng)溫度20℃為最優(yōu)的合成條件.

    (6)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn).Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示.對表3中TiO2/PD復(fù)合材料的合成進(jìn)行回歸分析,得到各影響因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性(見表4).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,攪拌速度和反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料的合成并無太大影響.綜合考慮,選擇反應(yīng)p H、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化.

    表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

    表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

    (7)確定最佳合成條件.以p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)重要因素為自變量,Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示.

    利用Design Experts 8.0軟件對表5的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,得到二階回歸方程:

    式中,R1為固載率;X1為反應(yīng)p H值;X2為多巴胺質(zhì)量濃度;X3為反應(yīng)時(shí)間.

    表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    對該模型進(jìn)行回歸方差分析與顯著性檢驗(yàn),結(jié)果如表6所示.分析結(jié)果顯示,P值<0.000 1,該模型顯著,失擬項(xiàng)P值為0.209 0,說明該實(shí)驗(yàn)的失擬項(xiàng)不顯著.相關(guān)系數(shù)R2=0.962 7,說明可用該方程代替實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,響應(yīng)面立體分析圖如圖6所示.由圖6可以看出,在p H值為8.79、多巴胺質(zhì)量濃度為1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間為7.42 h時(shí)合成的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率最高,最高值達(dá)到280.85 mg/g.

    表6 回歸方程的方差分析

    圖6 各因素交互影響固載率的曲面圖

    (8)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果.按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在p H值為8.79、多巴胺質(zhì)量濃度為1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間為7.42 h的條件下合成TiO2/PD復(fù)合材料,以此驗(yàn)證模型的可靠性,3次平行實(shí)驗(yàn)測得的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率平均值為274.26 mg/g.

    2.2TiO2/PD復(fù)合材料表征

    (1)FT-IR表征.試驗(yàn)利用FT-IR對TiO2及TiO2/PD復(fù)合材料進(jìn)行了表征,結(jié)果如圖7所示.圖7a曲線為納米TiO2的紅外光譜圖,由圖7a可以看出,在669 cm-1和3 429 cm-1左右處出現(xiàn)了紅外吸收峰,分別為TiO2中鈦氧鍵和羥基的特征峰[11],表明二氧化鈦表面存在著羥基;圖7b曲線為TiO2/PD復(fù)合材料的紅外光譜圖,由圖7b可以看出,曲線中羥基峰的消失,這可能是羥基參與了與多巴胺的反應(yīng),從而佐證了多巴胺的修飾,同時(shí)在1 277 cm-1和1 483 cm-1處出現(xiàn)了紅外吸收峰,分別為苯環(huán)上C-O鍵、C-C鍵的特征峰[12],而3 410 cm-1處的紅外吸收峰為芳香族O-H鍵特征峰[13],這些吸收峰的出現(xiàn)表明了多巴胺的修飾.

    圖7 TiO2和TiO2/PD復(fù)合材料的FT-IR圖

    (2)熱分析.試驗(yàn)對納米TiO2和TiO2/PD復(fù)合材料分別進(jìn)行了熱分析:DTA/TGA分析和TGA/ DTG分析.為了更直觀地看出樣品的失重階段和失重速率,試驗(yàn)對DTG曲線做一階微分即得TGA/DTG圖,樣品的熱分析圖如圖8所示.由圖8a和圖8b可以看出,隨著溫度升高至800℃,樣品存在一個(gè)失重過程:在0~100℃時(shí),樣品出現(xiàn)了失重過程,這主要是樣品中物理吸附水脫附所造成的,且在65℃失重速率達(dá)到最大.由圖8c和圖8d可以看出,隨著溫度升高至800℃,樣品存在兩個(gè)失重過程:在0~100℃時(shí),由于物理吸附水的脫附,出現(xiàn)了失重過程;在300~500℃時(shí),樣品出現(xiàn)了失重過程,且在460℃時(shí)失重速率達(dá)到最大,主要是多巴胺熱分解造成的.對應(yīng)的樣品DTA曲線可以看出,在410℃出現(xiàn)了一個(gè)吸熱峰,佐證了多巴胺的熱分解.

    圖8 樣品的熱分析圖

    3 結(jié)論

    通過多巴胺(PD)對納米二氧化鈦的修飾,合成了TiO2/PD復(fù)合材料,并以材料的脂肪酶固載率為檢測指標(biāo),研究了p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、攪拌速度、反應(yīng)溫度對復(fù)合材料合成過程的影響.首先通過Plackett-Burman法對5個(gè)單因素進(jìn)行篩選,確定了p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)主要影響因素,然后利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化.結(jié)果表明,在p H值8.79、多巴胺質(zhì)量濃度1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間7.42 h時(shí),合成的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率最高,達(dá)到274.26 mg/g.利用FT-IR、熱分析對其進(jìn)行表征.FT-IR中在1 277 cm-1和1 483 cm-1處出現(xiàn)的特征峰分別為苯環(huán)上C-O鍵、C-C鍵的特征峰,表明了多巴胺的成功修飾;熱分析中300~500℃的失重區(qū)間也佐證了多巴胺的成功修飾.試驗(yàn)結(jié)果表明多巴胺對納米TiO2的表面進(jìn)行了修飾,有效地提高了納米TiO2的脂肪酶固載率.

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    Characterization and Optimization of Synthesis Conditions of Nano TiO2/PD Composite Materials for Immobilizing Lipase

    ZHENG Shu-xiang,TAO Yu-gui?,ZHU Long-bao,DU Guo-cheng
    (College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

    The TiO2/PD composite materials for immobilizing lipase were synthesized by using nano TiO2modified by dopamine.The response surface method was used to obtain the optimal synthesis conditions,including p H,dopamine concentration,reaction time and the characteristics of TiO2/PD.The composite materials were determined by FT-IR and thermal analysis.The results showed that the optimal conditions were as follows:p H 8.79;dopamine concentration 1.98 mg/m L;reaction time 7.42 h.On this conditions,the lipaseis immobilization rate of TiO2/PD composite reaches 274.26 mg/g.The surface layer of nano-TiO2was modified by dopamine using FT-IR and Thermal analysis.The results showed the peaks of dopamine were at 1 277 cm-1and 1 483 cm-1and was decomposed about 300℃.The nano TiO2modified by dopamine can improve the lipase immobilization rate effectively.

    nano TiO2microspheres;dopamine;lipase;response surface method;characterization

    R318.08

    A

    1672-2477(2016)04-0030-07

    2015-12-31

    安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1308085 MC51)

    鄭述祥(1989-),男,安徽滁州人,碩士研究生.

    陶玉貴(1965-),男,安徽無為人,教授,碩導(dǎo).

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