計(jì)算機(jī)輔助高效液相色譜法對食品中7種防腐劑的檢測

王　平，陳寧生（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖　241000；2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽蕪湖　241000）

計(jì)算機(jī)輔助高效液相色譜法對食品中7種防腐劑的檢測

王平1，2，陳寧生1?
（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.蕪湖市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽蕪湖241000）

在計(jì)算機(jī)輔助下，建立食品中7種防腐劑的高效液相色譜檢測方法.食品通過提取，離心，固相萃取凈化，計(jì)算機(jī)輔助高效液相色譜優(yōu)化分離后，通過二極管陣列檢測器進(jìn)行鑒定，并依據(jù)外標(biāo)法定量.檢測器響應(yīng)值與防腐劑的濃度在一定范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均在0.999以上.食品中7種防腐劑的回收率在90.4%～93.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）在1.5～6.4%之間.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)縮短了色譜條件的優(yōu)化時間，顯著提高了檢測效率，同時由于該方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度，因此，可適用于單種或多種防腐劑同時測定.

防腐劑；高效液相色譜；計(jì)算機(jī)輔助

為了保障食品的安全性及其功能化，GB2760-2014（簡稱“標(biāo)準(zhǔn)”）［1］明確限定了食品添加劑種類及添加量.但是在食品中超劑量使用防腐劑，甚至是添加一些非法添加劑仍時有發(fā)生.目前，食品中防腐劑的檢測方法主要有HPLC法［2-5］、GC或GC-MS法［6-9］、毛細(xì)管電泳法［10］、離子色譜法［11］等.檢測方法大多針對標(biāo)準(zhǔn)中允許的苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鉀鹽、脫氫乙酸及其鈉鹽、對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽、丙酸及其鈉（鈣）鹽等［12］，且只是對指定食品中的一種或幾種防腐劑進(jìn)行檢測，不能對食品進(jìn)行全面的檢測，特別對非法添加的防腐劑缺乏有效檢測.因此，這些檢測方法具有一定的局限性.建立一種能對多種食品中一種或多種防腐劑同時檢測的方法就顯得尤為重要.

實(shí)驗(yàn)選擇國家允許使用、易濫用的常見防腐劑（如苯甲酸、2，4-二氯苯氧乙酸（簡稱24D）、桂醛、聯(lián)苯醚），禁止作為食品防腐劑的水楊酸、苯甲醇，以及明令禁止使用且危害較大的富馬酸二甲酯作為檢查對象，利用計(jì)算機(jī)輔助優(yōu)化分離條件，建立高效液相色譜—二極管整列檢測器對多種食品中7種防腐劑同時且快速檢測和方法.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀LC-20 A（日本島津公司）；配有二極管陣列檢測器（SPD-M20A）；甲醇為色譜純（美國TEDIA公司）；標(biāo)準(zhǔn)品分別購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心和中國計(jì)量科學(xué)研究院；水為實(shí)驗(yàn)室用一級水；其余試劑均為分析純；液相色譜柱、Pro Elut PXA混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱及其他固相萃取小柱（簡稱SPE小柱）均購自迪馬公司；實(shí)驗(yàn)所用食品樣品均購自蕪湖市場.

1.2試驗(yàn)方法

（1）標(biāo)樣溶液的配制.用甲醇將精準(zhǔn)稱量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解，并轉(zhuǎn)移至容量瓶中用甲醇定容作為儲備液，于4℃下保存?zhèn)溆茫褂脮r制備成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并稀釋至所需濃度.

（2）樣品處理.準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.000 1 g）左右樣品置于50 m L離心管中，加入20 m L乙醇水溶液（1∶1），40 KHz超聲15 min，以500 0 r/min離心10 min，上清液待凈化.

（3）凈化.依次向ProElut PXA小柱中加入3 m L甲醇、3 m L水，加入5 m L樣品溶液，用5 m L水淋洗，3 m L甲酸甲醇水（2∶80∶20）溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，流動相定容至1 m L.

（4）色譜條件.色譜柱：Platisil ODS 5μm 250×4.6 mm；保護(hù)柱：EasyGuard Kit C18；流動相：甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液梯度洗脫，洗脫程序如表1所示；進(jìn)樣量10μL；流速為1.0 m L/min；柱溫為30℃；采用二極管陣列檢測器檢測.

表1　流動相梯度洗脫程序

（5）定性和定量.根據(jù)保留時間及紫外光譜進(jìn)行定性，用外標(biāo)峰面積法進(jìn)行定量.

2　結(jié)果與討論

2.1樣品防腐劑提取條件

選擇合適的提取溶劑可以提高防腐劑的提取效率和方法的準(zhǔn)確度.考慮到研究對象的結(jié)構(gòu)特性，分別采用甲醇、1+1乙醇、正己烷、乙醚作提取溶劑試驗(yàn).然而試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙醚、正己烷等可能將食品樣品中脂肪等干擾物質(zhì)帶入，同時甲醇極性較大，因此兼顧SPE小柱的性質(zhì)，選擇1+1乙醇水溶液提取.

2.2固相萃取柱的選擇

使用混合標(biāo)樣過柱，對比PWA和PXA兩種混合型小柱，結(jié)果如表2所示.由表2可知，PWA對酸性較強(qiáng)的苯甲酸、水楊酸、24D保留效果欠佳，回收率不足50%；PXA對各組分的保留性和洗脫性都比較理想.因此，選擇ProElutPXA混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱作為實(shí)驗(yàn)凈化小柱.

表2　固相萃取效率

2.3檢測器及檢測波長的選擇

基于被測的7種物質(zhì)單標(biāo)進(jìn)樣都具有較強(qiáng)的紫外吸收，選擇二極管陣列作為檢測器，掃描得到各物質(zhì)最大吸收波長如表3所示.考慮檢測波長低于210 nm時，檢測體系本底響應(yīng)較大.同時兼顧紫外吸收強(qiáng)度、本底響應(yīng)和方便檢測，因此選定苯甲酸、水楊酸、24D、桂醛、聯(lián)苯醚檢測波長為230 nm，苯甲醇、富馬酸二甲酯檢測波長為210 nm.

表3　最大吸收波長和檢測波長

2.4流動相及溫度的選擇

比較甲醇-水、甲醇-磷酸鹽、甲醇-乙酸銨流動相，發(fā)現(xiàn)甲醇水體系中水楊酸、24D無保留；甲醇乙酸銨比甲醇磷酸鹽能獲得更好的分離效果，所以選擇0.02 mol/L乙酸銨+甲醇作為流動相.引入柱溫和流動相比例兩個因素，分別在30℃、45℃下30 min和60 min內(nèi)，甲醇相從5%勻速增至95%.分別用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣得到各組分保留時間和峰面積，借助計(jì)算機(jī)色譜模擬軟件Dry Lab，通過調(diào)節(jié)梯度曲線和溫度模擬分離可得到最佳分離溫度30℃和梯度洗脫程序如圖1所示.

混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖如圖2所示.計(jì)算機(jī)模擬色譜分離效果，既可以縮短色譜條件探討時間，也可以減少試劑消耗，最終降低檢測成本.

圖1　色譜條件優(yōu)化結(jié)果圖

圖2　混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

2.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)樣，在柱溫30℃條件下，按照表1中梯度洗脫程序進(jìn)樣，以保留時間定性，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，線性擬合得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表4所示.

表4　防腐劑保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（n=6）及檢出限

2.6準(zhǔn)確度

以綠豆糕為樣品做標(biāo)準(zhǔn)添加回收實(shí)驗(yàn)，每種物質(zhì)進(jìn)行6次平行測定，計(jì)算回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表5所示，加標(biāo)色譜圖如圖3所示.

表5　防腐劑的添加回收率及其RSD（n=6）

2.7樣品分析

對糕點(diǎn)、醬腌菜、蜜餞、豆制品、調(diào)味料、肉制品6大類食品，每類10組樣品，共計(jì)60組樣品的7種防腐劑同時進(jìn)行檢測，每個樣品平行試驗(yàn)2次，其中6組蜜餞（分別為0.11 g/kg、0.24 g/kg、0.42 g/kg、0.36 g/kg、0.25 g/kg、0.40 g/kg）、5組醬腌菜（分別為0.33 g/kg、0.43 g/kg、0.54 g/kg、0.13 g/kg、0.35 g/kg）、5組調(diào)味品（分別為0.22 g/kg、0.37 g/kg、0.41 g/kg、0.28 g/kg、0.31 g/kg）中有苯甲酸檢出，水楊酸、苯甲醇、富馬酸二甲酯、24D、桂醛、聯(lián)苯醚均未檢出.同時使用現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比檢測，所有結(jié)果相對誤差均小于一般色譜平行樣10%的要求，說明檢測結(jié)果及方法是可靠的.

圖3　加標(biāo)回收色譜圖

3　小結(jié)

實(shí)驗(yàn)方法前處理大為簡化，同時實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7種防腐劑在色譜柱上分離度較好，實(shí)驗(yàn)平行性較佳、回收率較好.檢測結(jié)果準(zhǔn)確、精密度較高，且檢測速度快，可對食品中多種防腐劑同時測定.計(jì)算機(jī)輔助有效地縮短了時間，節(jié)約了化學(xué)試劑用量，為其他樣品的檢測提供了可能.

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2014.

［2］陶然，黃曉東，徐強(qiáng)，等.基質(zhì)固相分散高效液相色譜法測定薯片中鄰苯二甲酸二己酯的含量［J］.安徽工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28（2）：38-41.

［3］竇茂鑫，趙迪，侯永清，等.飼料添加劑肉桂油中肉桂醛含量的測定［J］.飼料研究，2013，376（3）：71-72.

［4］向露，周啟明，王雅，等.程序變波長-高效液相色譜法同時測定果蔬中9種防腐劑［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（20）：70-74.

［5］綦艷，黃秋研，梁德沛，等.高效液相色譜法同時測定果蔬中多種防腐劑［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（6）：1 409-1 412.

［6］靳智，李明，楊濤，等.氣-質(zhì)聯(lián)用測定果蔬中6種防腐殺菌劑檢測方法的研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（8）：1 693-1 696.

［7］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T24800.11-2009化妝品中防腐劑苯甲醇的測定，氣相色譜法［S］.北京：國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，2009.

［8］中華人民共和國國家進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局.SN0152-1992出口水果中2，4-滴殘留量檢驗(yàn)方法［S］.北京：中華人民共和國國家進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局，1992.

［9］S Navickiene，M L Ribeiro.A Simplified Method for the Gas Chromatographic Determination of Pyrimethanil Residues in Fruits［J］.J Sep.Sci.，2001，24（6）：470-472.

［10］S Y Chang，F(xiàn) Y Wang.Determination of Gabapentin in Human Plasma by Capillary Electrophoresis with Laser-induced Fluorescence Detection and Acetonitrile Stacking Technique［J］.Journal of Chromatography B，2004，799（2）：265-270.

［11］高慧.離子色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的添加劑［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［12］李佳峻，楊春林，胡強(qiáng)，等.高效液相色譜法同時測定發(fā)酵調(diào)味料中六種尼泊金酯類防腐劑方法研究［J］.中國調(diào)味品，2013，38（10）：84-87.

Computer-aided Determination of Seven Preservatives in Food by HPLC

WANG Ping1，2，CHEN Ning-sheng1?
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China 2.Wuhu Institute of Product Quality Supervision，Wuhu 241000，China）

A HPLC method to determine seven kinds of preservatives in food was established with computer softwares.Preservatives in food were extracted，centrifuged and SPE purified.The sample solutions were optimally separated by HPLC with computer softwares.Preservatives were analyzed by using the qualitative PDA and quantitative external standard methods.Within a certain range，a good linear correlation was found between the response values and preservative concentration.And their correlation coefficients were above 0.999.The recovery ratios of seven kinds of preservatives in food were between 90.4%～93.8%，and their RSD were between 1.5～6.4%.Results showed that the separation efficiency of preservatives was improved.Therefore，the method can be applied to determine single or multiple preservatives due to its high precision and accuracy.

preservatives；high performance liquid chromatographic（HPLC）；computer aid method

TS207

A

1672-2477（2016）04-0068-05

2016-02-22

王平（1986-），男，安徽蕪湖人，碩士研究生.

通訊簡介：陳寧生（1958-），女，江蘇南京人，教授，碩導(dǎo).