熒光碳點的制備及其對三聚氰胺的檢測

陳　剛，陳寧生，程世騎（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖　241000）

熒光碳點的制備及其對三聚氰胺的檢測

陳剛，陳寧生?，程世騎
（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

以廢棄花生殼為碳源，經(jīng)過灼燒處理，通過超聲法一步合成熒光性能優(yōu)良的碳點，以碳點為探針實現(xiàn)了對三聚氰胺的檢測.在緩沖體系下，三聚氰胺能夠引起碳點溶液熒光猝滅，根據(jù)三聚氰胺質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與碳點溶液熒光強度的變化量呈線性關(guān)系，建立熒光分光光度法檢測三聚氰胺.結(jié)果顯示，當(dāng)體系在p H=8.5、40℃下水浴保溫35 min后，三聚氰胺質(zhì)量濃度在2.6×10-5～7.6×10-4g/L內(nèi)，與熒光變化量具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R=0.994 6.檢出限達3.6×10-7g/L，回收率為98.4%～99.9%，RSD小于4.0%.

碳點；花生殼；熒光分光光度法；三聚氰胺

三聚氰胺（C3H3N6）是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，廣泛運用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)［1］.美國食品和藥品管理局禁止將三聚氰胺加入到食品和飼料中，我國食品安全法也明確禁止將其添加到食品中.隨著對奶制品監(jiān)管力度加大，三聚氰胺添加對象出現(xiàn)轉(zhuǎn)移趨勢.近年來，飼料中非法添加三聚氰胺并造成動物死亡的案例時有發(fā)生［2］.由于三聚氰胺白色、無味且食用后不會立即出現(xiàn)中毒癥狀而難以發(fā)現(xiàn)，長期攝入會引起腎結(jié)石、蛋白質(zhì)虛高、代謝紊亂，嚴(yán)重影響人體健康［3］和肉食蛋白質(zhì)量［4］.因此，嚴(yán)格監(jiān)控三聚氰胺在食品、飼料領(lǐng)域的添加尤為重要.

目前，三聚氰胺的檢測方法包括高效液相色譜法［5］、高效液相色譜質(zhì)譜法［6］、氣相色譜質(zhì)譜法［7］、酶聯(lián)免疫法［8］、熒光分光光度法［9］等，這些方法多以色譜法為主，或色質(zhì)聯(lián)用，具有分析樣品種類多、分離效率高及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但也具有操作復(fù)雜、分離時間長、費用昂貴等缺點.酶聯(lián)免疫法雖然操作簡便，但是抗干擾能力差、重現(xiàn)性低.與其他方法相比，熒光分光光度法具有操作簡便、成本低等優(yōu)點.程定璽［9］等以熒光素為探針對三聚氰胺實現(xiàn)了檢測，反應(yīng)靈敏度高達1.9×10-6g/L.碳點是一種綠色無毒的熒光納米材料，和其他金屬量子點相比，不僅擁有優(yōu)良、穩(wěn)定的光學(xué)性能，還具有低細(xì)胞毒性以及良好的生物相容性等特點，在分析及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用已引起越來越多的關(guān)注［10-11］.目前，碳點制備以合成有機物質(zhì)、氨基酸為碳源較多，而以廢棄物質(zhì)作為碳源，探討綠色合成方法開始興起［12］.

作為花生種植大國，2012年我國花生種植面積已占世界花生種植總面積的19%，生產(chǎn)花生（帶殼）1 680萬噸，產(chǎn)生的670萬噸花生殼廢料急需處理，國內(nèi)目前處理方法有限，主要是作燃料或肥料［13-14］.實驗以廢棄花生殼為碳源，用綠色合成方法制備出了一種熒光強度高、光穩(wěn)定性好、綠色無毒的水溶性碳點.以碳點為熒光探針，研究其在三聚氰胺檢測中的作用.研究不僅為碳點制備提供了一種綠色新碳源，同時也為花生殼變廢為寶提供依據(jù)，更為三聚氰胺的檢測提供了一種新的途徑.

1　實驗部分

1.1實驗儀器

F-4500熒光分光光度計（日本日立公司）；Nexus-870傅里葉紅外光譜儀（美國Necolet）；JEM-100SX透射電子顯微鏡（日本JEOL）；UV-5500紫外-可見分光光度計（上海譜元儀器有限公司）；H1650-W湘儀高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）.

1.2實驗試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 g/L，蕪湖市質(zhì)量站提供）、BR緩沖溶液（自制）、盒裝牛奶（購自市場）；絲氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、氯化鈣（AR）、氯化鋁（AR）、氯化鐵（AR）、硫酸鋅（AR）、磷酸氫二鈉（AR）、葡萄糖（AR）、乳糖（AR）等試劑均購自國藥試劑；實驗用水均為二次蒸餾水.

1.3碳點的制備

將花生殼粉碎并放入馬弗爐中，在350℃下灼燒4 h，待冷卻后研磨成粉.取1.0 g粉末放入錐形瓶中，加入50 m L的二次蒸餾水，在超聲波清洗器中超聲1 h，將得到的溶液抽濾、高速離心得到清液，將清液用透析袋（MWCO=3 500）裝袋放入二次蒸餾水中透析2 d，平均6 h換一次水，得到淡黃色溶液即碳點溶液，溶液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、干燥后得到褐色碳點粉末備用.

1.4碳點的表征

采用熒光分光光度計掃描熒光光譜，在激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm、掃描電壓為400 V、掃描速度為2 400 nm/min的條件下，以激發(fā)波長340 nm掃描碳點溶液，得到熒光發(fā)射光譜.吸收光譜的測定均使用10 mm的比色皿.

以KBr為襯底與碳點粉末壓片，采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀掃描碳點的紅外光譜，從而推斷碳點表面帶有的基團，以透射電子顯微鏡觀察碳點粒徑及形貌.

1.5三聚氰胺檢測

在比色管中，分別加入質(zhì)量濃度為9.0×10-2g/L碳點溶液3.0 m L，BR緩沖溶液（p H=8.5）1.0 m L，用移液器準(zhǔn)確移取一定體積的三聚氰胺溶液并加入到比色管中，用水定容至5.0 mL，在40℃下水浴35 min，取出比色管后立即放入冷水冷至室溫.在λex=340 nm、λem=445 nm下測其熒光強度.根據(jù)熒光強度變化量與質(zhì)量濃度線性關(guān)系求得關(guān)系式：△F=33.82+1.98C.△F為變化量；C為質(zhì)量濃度（單位10-5g/L）.

2　結(jié)果與討論

2.1碳點的表征

不同激發(fā)波長下碳點溶液的熒光發(fā)射光譜及紫外吸收光譜如圖1所示.由圖1可以看出，激發(fā)波長在330～355 nm范圍小幅度改變時，碳點溶液的最大發(fā)射波長基本沒有位移.在日光下，碳點溶液呈現(xiàn)淡黃色透明狀；在360 nm紫外光照射下，碳點溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，碳點均勻分散于溶液中，體系穩(wěn)定不團聚（見圖1b）.除此之外，碳點溶液在200～350 nm區(qū)間有較為明顯地吸收，在最大激發(fā)波長340 nm處，碳點溶液的熒光強度最大，最大發(fā)射波長為445 nm.

圖1　碳點溶液不同激發(fā)下熒光發(fā)射光譜及紫外吸收光譜

碳點的紅外光譜圖如圖2所示.由圖2可以看出，碳點表面可能帶有大量的-OH，在3 432 cm-1處有強烈的吸收峰，可歸屬為-OH的伸縮振動峰；在1 617 cm-1處的吸收峰可歸屬為C=C的伸縮振動峰；而在1 386 cm-1處的吸收峰可歸屬于C-H面內(nèi)彎曲振動；在1 128 cm-1處的吸收峰可歸屬于C-O的伸縮振動吸收峰.由于所合成的碳點表面帶有大量-OH等親水基團，所以，碳點具有良好的水溶性，能夠作為探針對樣品實現(xiàn)檢測.

碳點溶液的TEM照片如圖3所示.由圖3可以看出，碳點在水中分散比較均勻，碳點粒徑集中分布在2～6 nm內(nèi)，碳點的粒徑分布如圖4所示.

2.2三聚氰胺檢測

（1）光譜分析.在9.0×10-2g/L的碳點溶液中加入不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺后，體系的熒光發(fā)射光譜圖如圖5所示.由圖5可以看出，隨著三聚氰胺溶液的不斷加入，碳點溶液在發(fā)射波長445 nm處的熒光發(fā)射強度逐漸減弱.

圖2　碳點的紅外譜

圖3　碳點溶液TEM照片

圖4　碳點的粒徑分布

圖5　碳點溶液與三聚氰胺的相互作用

（2）反應(yīng)條件的選擇.用單因素變量法研究了p H、溫度和反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響，實驗中，碳點質(zhì)量濃度為9.0×10-2g/L，三聚氰胺質(zhì)量濃度為5.0×10-4g/L.在40℃下，比色管中分別加入1.0 m L不同p H的BR緩沖溶液（酸度計控制），反應(yīng)時間35 min，反應(yīng)完成后立即取出比色管放入冷水中冷卻至室溫，考察在同量三聚氰胺下酸度對體系熒光強度變化的影響如圖6a所示.由圖6可以看出，在p H為8.5的條件下，熒光強度變化量最大，因此，選擇緩沖體系的p H為8.5.

將檢測體系分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃中反應(yīng)35 min，待反應(yīng)完成后，將比色管立即放入冷水中冷卻至室溫，考察溫度對反應(yīng)體系熒光強度變化的影響如圖6b所示.由圖6b可以看出，隨著反應(yīng)溫度升高到40℃時，體系熒光強度變化量最大，因此，選擇反應(yīng)溫度40℃.

將反應(yīng)體系在40℃下水浴保溫，保溫時間設(shè)定為0、10 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、60 min，待反應(yīng)完成后將比色管放入冷水中冷卻至室溫，考察不同反應(yīng)時間對體系熒光強度變化的影響如圖6c所示.由圖6c可以看出，體系在30 min內(nèi)反應(yīng)速度加快，熒光強度變化加大；體系在反應(yīng)35 min后，其熒光強度變化不大，反應(yīng)體系趨于穩(wěn)定，體系穩(wěn)定時間長，因此，選擇反應(yīng)時間35 min.

（3）線性范圍與檢出限.在優(yōu)化條件下，不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺與碳點溶液作用的熒光變化量關(guān)系如圖7所示.由圖7可知，體系在發(fā)射波長445 nm處的熒光猝滅強度與三聚氰胺質(zhì)量濃度在2.6×10-5～7.6×10-4g/L內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為△F=33.82+1.98C（C的單位為10-5g/L），其線性相關(guān)系數(shù)為R=0.994 6.其中，△F為碳點溶液在加入三聚氰胺溶液前后碳點溶液的熒光強度差值（△F= F0-F，F(xiàn)0為未加入三聚氰胺時碳點溶液的熒光強度，F(xiàn)為加入后碳點的熒光強度）.對18組空白溶液進行測定并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差S，用3S/k（k標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）方法，推導(dǎo)出該方法的檢出限為3.6×10-7g/L.

（4）共存物質(zhì)的影響.在優(yōu)化條件下，考察了氨基酸、糖類以及無機鹽類等共存物質(zhì)對體系的影響，結(jié)果如表1所示.由表1可以看出，常見糖類、氨基酸及無機鹽類對體系影響較小，Al3+、Fe3+對體系干擾較大，但對于檢測無影響.一般食品中鐵、鋁含量很低，常見牛奶中Fe3+含量僅1.0×10-3～5.0×10-3g/L，規(guī)定食品中Al3+含量不得超過0.1 g/kg.

圖6　體系反應(yīng)條件選擇

圖7　三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　干擾離子影響

（5）牛奶中三聚氰胺的檢測.取100 m L購自市場的牛奶，通過高速離心后取上層溶液備用.取3份備用液，加入不同量的三聚氰胺，制備不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺模擬牛奶樣.在優(yōu)化條件下，檢測模擬牛奶樣中三聚氰胺的含量，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，測定了回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個樣品平行測定5次，結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，檢測樣品回收率在98.4%～99.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.0%.

表2　牛奶中三聚氰胺的檢測（n=5）

3　結(jié)論

利用花生殼廢料制備了熒光性能優(yōu)良的碳點，制備方法簡便、綠色，原料易得、價格低廉，同時變廢為寶，實現(xiàn)了環(huán)保節(jié)能.以碳點為探針，建立了簡便、靈敏地檢測三聚氰胺的熒光光度法，在p H=8.5、40℃下水浴保溫35 min后，可以檢測的三聚氰胺的質(zhì)量濃度范圍達到2.6×10-5～7.6×10-4g/L，檢出限達到3.6×10-7g/L，對樣品進行檢測的回收率在98.4%～99.9%之間，RSD小于4.0%.

［1］李永慶，王軍.三聚氰胺的生產(chǎn)與應(yīng)用［J］.發(fā)展論壇，2004（5）：8-11.

［2］W C Andersen，S B Turnipseed.Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MSMS with Hilic Chromatography［J］.Laboratory Information Bulletin，2007（23）：4 396.

［3］H Ogasawara，K Imaida，H Ishiwata，et al.Urinary Bladder Carcinogenesis Induced by Melamine in F344 Malerats：Correlation Between Carcinogenicity and Urolith Formation［J］.Carcinogenesis，1995，16（11）：2 773-2 777.

［4］陳洋，宋磊，李普慶.飼料中三聚氰胺檢測方法的研究進展［J］.飼料與畜牧，2015（10）：51-54.

［5］井偉，陳旻文，李小晶，等.HPLC同時檢測食品接觸材料中三聚氰胺與三聚氰酸單體遷移率［J］.分析實驗室，2011，30（4）：34-38.

［6］周楊，馮群科，朱永林.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺［J］.中國飼料，2010（12）：33-36.

［7］金春愛，王玉芳，羅婧，等.牛奶中三聚氰胺的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速測定［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2014（7）：49-50.

［8］Y Zhou，C Y Li，Y S Li，et al.Monoclonal Antibody Based Inhibition ELISA as A New Tool for the Analysis of Melamine in Milk and Pet Food Samples［J］.Food Chem.，2012，135（4）：2 681-2 686.

［9］程定璽，黃世江，梁宇，等.熒光探針法快速測定牛奶中三聚氰胺［J］.分析實驗室，2013，32（1）：48-50.

［10］S N Baker，G A Baker.Luminescent Carbon Nandots：Emergent Nanolights［J］.Angew Chem.Int Edit，2010，49：6 726-6 744.

［11］JShen，Y Zhu，X Yang.Graphene Quantum Dots：Emergent Nanolights for Bioimaging，Sensors，Catalysis and Photovotaic Devices［J］.Chemical Communication，2012，48：3 686-3 699.

［12］張文龍，侯世澄，梁羽，等.利用豆渣一步合成水溶性碳點［J］.安徽工程大學(xué)學(xué)報，2015，30（1）：36-39.

［13］張怡.中國花生生產(chǎn)布局變動解析［J］.中國農(nóng)村經(jīng)濟，2014（11）：73-82.

［14］孫豐文，張茜，李自峰.花生殼綜合利用的研究進展［J］.山東林業(yè)科技，2008（6）：84-88.

The Preparetion of Fluorescent Carbon Dots for the Detection of Melamine

CHEN Gang，CHEN Ning-sheng?，CHENG Shi-qi
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Using the peanut shell for carbon source which was calcinated carbon dots with superior fluorescent properties were synthesized by ultrasonic method.The detection of melamine was achieved using the carbon dots as the probe.In the buffer system，the fluorescence of carbon dots was quenched by melamine.According to the relationship between the fluorescence intensity change and the concentration of melamine，the method for detecting melamine by fluorescence spectrophotometry was established.The results showed a linear relationship between the fluorescence intensity change and the melamine concentration in the range from 2.6×10-5g/L to 7.6×10-4g/L with the correlation coefficient of 0.994 6 under p H=8.5 and 40℃preservation 35min.The detection limit was 3.6×10-7g/L.In linear range，the rates of recovery were from 98.4%to 99.9%，RSD were less than 4.0%.

carbon dots；peanut shell；fluorescence spectrophotometry；melamine

O6537.3

A

1672-2477（2016）04-0017-05

2016-02-29

陳剛（1989-），男，安徽宿松人，碩士研究生.

陳寧生（1958-），女，安徽蕪湖人，教授，碩導(dǎo).