易錯PCR提高粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1活性

王玉滿，薛正蓮，王　洲，蘇燕南，朱　昊（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖　241000）

易錯PCR提高粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1活性

王玉滿，薛正蓮?，王洲，蘇燕南，朱昊
（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

利用易錯PCR技術(shù)對來自粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06的磷脂酶A1基因plaB進行定向改造，通過引入不同濃度Mg2+、Mn2+得到的易錯PCR產(chǎn)物與表達型質(zhì)粒p ET-28a（+）重組，構(gòu)建磷脂酶A1突變文庫，篩選出高酶活突變株EPB8.該突變酶相對野生酶酶活提高了22.5%，并對突變株EPB8產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后酶活較野生酶酶活提高41%.序列分析表明：plaB基因有11個堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致7個氨基酸發(fā)生突變，其中磷脂酶A1蛋白有3個氨基酸突變，分別是Y97C、P98S、X228L，輔助蛋白有4個氨基酸突變，分別是P46L、Q58L、N136D、H233R.該實驗結(jié)果為進一步在分子水平定向提高磷脂酶A1的活性奠定了基礎(chǔ)，也為該酶在其他高表達系統(tǒng)中的表達提供了素材.

粘質(zhì)沙雷氏菌；磷脂酶A1；易錯PCR；產(chǎn)酶條件優(yōu)化

磷脂酶A1是一類專一水解磷脂sn-1位酰基產(chǎn)生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶類［1］，可以用于植物脫膠和磷脂改性方面［2］，其水解產(chǎn)物溶血磷脂是優(yōu)良的乳化劑、食品添加劑和抗菌劑，廣泛運用在食品、化妝品、醫(yī)藥等各個方面［3］.隨著磷脂酶的工業(yè)應(yīng)用廣泛，對其研究也日益增多.由于自然界篩選的菌株酶活不高、產(chǎn)量低，需進一步提高.隨著分子技術(shù)水平的提高，與磷脂酶克隆表達相關(guān)的報道也隨之增多.Michael Givskov［4］等提取液化沙雷氏菌磷脂酶A1基因在大腸桿菌克隆表達，但酶活不到1 U/m L.Jae Kwang Song［5］等構(gòu)建基因文庫成功克隆Serratia sp.MK中磷脂酶A1基因，并在大腸桿菌中表達，但表達量最高為2.21 ug/m L培養(yǎng)基.付建紅［6］等將Serratia sp.xiF1內(nèi)的磷脂酶A1基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進行表達，在畢赤酵母中表達的重組酶在3.7 L發(fā)酵罐中磷脂酶A1活力達41.8 U/m L.但這些還不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求，因此，通過蛋白質(zhì)工程手段對磷脂酶進行體外分子改造提高酶活性、穩(wěn)定性及其產(chǎn)量具有重要意義.由于還未知磷脂酶的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，故研究采用易錯PCR技術(shù)改造磷脂酶的分子結(jié)構(gòu).易錯PCR可以體外篩選突變蛋白達到迅速提高酶活力的目的，同時改善酶的一系列性質(zhì)［7］.王穎秋［8］等運用易錯PCR方法提高了頭孢菌素C酰化酶活力.劉韓［9］等運用易錯PCR方法提高土芽孢桿菌ZH1羧酸酯酶的熱穩(wěn)定性.Stephens［10］等運用易錯PCR方法改善了真菌木聚糖酶的耐堿性和耐熱性.研究以粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06基因組為模板，擴增得到含輔助蛋白的磷脂酶A1基因plaB為研究對象，以期通過易錯PCR法提高酶活.

1　材料與方法

1.1材料

（1）菌株和質(zhì)粒.粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06由安徽工程大學(xué)微生物實驗室篩選保存；宿主菌大腸桿菌BL21（DE3）、JM109、質(zhì)粒pET-28a由安徽工程大學(xué)微生物實驗室保存；工程菌BP28/BL21（plaB-p ET-28a/ BL21（DE3））由安徽工程大學(xué)微生物實驗室構(gòu)建保存.

（2）酶和試劑.PCR系列試劑、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、酶等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、T4 Ligase、限制性內(nèi)切酶購自Thermo，其他試劑均為國產(chǎn)分析純；引物合成由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成.

（3）培養(yǎng)基.LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g（0.5%）、胰蛋白胨10 g（1%）、NaCl 10 g（1%）加水至1 L，p H調(diào)至7.0，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉；PLB培養(yǎng)基：卵磷脂20 g（2%）、胰蛋白胨10 g（1%）、NaCl 10 g（1%）、酵母粉5 g（0.5%）、0.02%溴甲酚紫（3%）、25 mmol/L CaCl2、1 000 m L蒸餾水，p H調(diào)至7.0；卵磷脂用高速勻漿機乳化后單獨滅菌，固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉；卡那霉素（Kna）儲存質(zhì)量濃度為50 mg/m L，其工作質(zhì)量濃度為50 ug/m L.

1.2方法

（1）易錯PCR法擴增磷脂酶A1（plaB）基因.以粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06基因組為模板，利用易錯PCR對目的基因引入突變，目的基因的上游引物：（劃線部位為Bam HⅠ的酶切位點），下游引物為（劃線部分為HindⅢ的酶切位點）.50 u L的易錯PCR反應(yīng)體系：5 u L 10×PCR Buffer（無Mg2+）、7 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L MnCl2、5 U Taq DNA Polymerase、上下游引物各10 pmol、模板DNA 20 ng，補dd H2O至50 u L.反應(yīng)程序為95℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，72℃8 min，35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物檢測后并回收，進行下一步實驗.

（2）突變文庫的構(gòu)建.將純化后易錯PCR產(chǎn)物和載體pET-28a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、HindⅢ進行消化，經(jīng)過T4連接酶連接后，隨即轉(zhuǎn)入宿主菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于帶有卡那霉素（50 ug/m L）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h.將平板上長出的菌落接種至含有卡那霉素（50 ug/m L）培養(yǎng)液的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素（50 ug/m L）的PLB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，構(gòu)建突變文庫.

（3）磷脂酶A1酶活突變株的初篩.PLB平板含有卵磷脂、溴甲酚紫和CaCl2，可作為篩選平板，產(chǎn)磷脂酶克隆會出現(xiàn)水解暈圈，將含有磷脂酶A1基因plaB重組質(zhì)粒的工程菌BL21（DE3）點種在篩選平板上作為對照，根據(jù)圈徑比的大小，初步篩選出正向突變株.

（4）目的菌株的復(fù)篩及鑒定.將初篩得到的單菌落接種至5 m L含有卡那霉素（50 ug/m L）培養(yǎng)液的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)物按2%的接種量接至100 m L含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌濃為OD600=0.6（對數(shù)生長期）時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h，取發(fā)酵液，采用酸堿滴定法［11］.酶活力定義為：在45℃和p H 6.0條件下，1 g固體酶粉（或1 m L液體酶）1 min水解磷脂產(chǎn)生1μmol的可滴定脂肪酸，即為1個酶活力單位（U/g或U/m L）［12］，測定發(fā)酵液酶活.選取酶活提高的菌株，提取其質(zhì)粒經(jīng)限制性酶酶切驗證后進行測序分析.

（5）突變菌株EPB8誘導(dǎo)生長曲線的測定.從平板上挑取P28（p ET-28a（+）/BL21（DE3））、BP28（BP28/BL21（DE3））、EPB8單菌落，接種于5 m L含卡那霉素（50 ug/m L）的LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min過夜培養(yǎng).1%的接種量，轉(zhuǎn)接至100 m L含卡那霉素（50 ug/m L）的LB培養(yǎng)液的250 m L三角瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 h，OD600為0.6時加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG開始計時，每隔1 h取樣測OD600值，記錄數(shù)據(jù)繪制生長曲線.

（6）EPB8誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.接種1 m L過夜活化的EPB8菌液至100 m L LB培養(yǎng)基中，分別從誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、加入IPTG時的OD600值、IPTG濃度4個方面對EPB8進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化［12］.誘導(dǎo)時間分別為2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h；誘導(dǎo)溫度分別為22℃、27℃、32℃、37℃、42℃；加入IPTG時的OD600值分別為0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2；IPTG加量分別為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、1.0 mmol/L；誘導(dǎo)后進行酶活定量測定.初始時IPTG加量0.2 mmol/L、溫度37℃、OD600值0.6條件下進行優(yōu)化即可.

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因的獲得

將粘質(zhì)沙雷氏菌PL-06接種至5 m L的LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12～16 h，所得菌液按照基因組提取試劑盒說明步驟進行操作，得到的基因組用1%瓊脂糖凝膠驗證進行.

2.2易錯PCR條件的確定

由于Mg2+可以穩(wěn)定非互補堿基對，因此增加Mg2+濃度使之超過正常用量，從而穩(wěn)定非互補的堿基對.而Mn2+能夠降低聚合酶對模板的特異性，提高錯配率［13］.研究通過改變Mg2+濃度和添加Mn2+促進堿基的錯配，獲得多樣性突變文庫.采用Mg2+濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L，Mn2+濃度為0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、1 mmol/L作為梯度進行易錯PCR.

不同離子濃度下的易錯PCR如圖1所示.由圖1可知，隨著Mn2+濃度的增加，目的基因擴增量減少，條帶彌散性也較嚴(yán)重，所以最適Mn2+濃度為0.1 mmol/L.在最適Mn2+濃度下，Mg2+濃度過低，擴增效率低，甚至沒有條帶，若Mg2+濃度較低，突變率會較低［14］，因而選擇較高的Mg2+濃度7 mmol/L.不僅如此，條件6組合濃度基因平均突變率為0.58%，條件8組合濃度為0.63%，所以最終選擇Mg2+濃度為7 mmol/L、Mn2+濃度為0.1 mmol/L，從而實現(xiàn)對目的基因突變率的有效地控制.

圖1　不同離子濃度下的易錯PCR

2.3基因文庫的構(gòu)建

按照上述易錯PCR的條件，以基因組為模板擴增目的基因，大小約1 700 bp，易錯PCR擴增目的基因如圖2所示.經(jīng)膠回收后，同時和載體pET-28a進行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中得到的轉(zhuǎn)化子構(gòu)成突變文庫.

2.4突變株的篩選

（1）初篩.將文庫中的轉(zhuǎn)化子接種至LB培養(yǎng)液中混合過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌大腸桿菌BL21（DE）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含卡那霉素的PLB平板上，37℃培養(yǎng)12～14 h后，利用磷脂酶A1可以分解卵磷脂在PLB平板產(chǎn)生水解暈圈，根據(jù)水解暈圈的大小及其產(chǎn)生的快慢，可以直觀地篩選酶活突變株.將篩選出酶活發(fā)生變化的突變株點種在含卡那霉素的PLB平板上，與BP28/BL21（簡稱BP28）比較暈圈大小，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，挑取圈徑比較大的突變子6#、8#、16#、18#、19#、21#，在此基礎(chǔ)上進一步復(fù)篩.

圖2　易錯PCR擴增目的基因

圖3　PLB平板篩選結(jié)果

（2）復(fù)篩.將初篩得到的酶活改變的突變株接種至含有50 ug/m L卡那霉素的LB培養(yǎng)中，37℃、200 r/min進行培養(yǎng)至OD600為0.6時，加IPTG誘導(dǎo)4 h，測發(fā)酵液粗酶液酶活進行復(fù)篩，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，酶活都有所提高，但8#突變子提高幅度最大，酶活為19.6 U/m L.為進一步驗證突變子的正確性，對其提取質(zhì)粒進行單酶切驗證，結(jié)果如圖5所示.從圖5中可以看出，突變株單酶切的大小約為7 000 bp和質(zhì)粒（約5 300 bp）與目的基因（約1 700 bp）共同片段的大小相一致.條帶大小正確說明突變子構(gòu)建成功，并命名為EPB8以備下一步實驗.

2.5突變基因的序列分析

提取突變株的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切驗證正確后，送上海生工生物有限公司進行測序.對比測序結(jié)果并分析突變率，找出堿基突變和相應(yīng)氨基酸突變位點.

突變基因的序列分析表明，突變菌株EPB8有11個堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致有7個氨基酸發(fā)生突變.其中，磷脂酶A1蛋白有3個氨基酸突變，分別是Y97C、P98S、X228L；輔助蛋白有4個氨基酸突變，分別是P46L、Q58L、N136D、H233R.

2.6突變株EPB8誘導(dǎo)生長曲線的測定

按1.2（5）所述方法進行誘導(dǎo)生長曲線的測定，結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，BP28和突變株EPB8在未誘導(dǎo)的情況下，生長情況基本相一致.但加入IPTG誘導(dǎo)后，兩菌株生長均表現(xiàn)出受到抑制.一方面IPTG對菌體有一定毒害作用；另一方面，目的產(chǎn)物磷脂酶A1對細(xì)胞也有一定的毒性［12］.

圖4　突變株搖瓶酶活測定

圖5　突變菌株的酶切圖譜

圖6　EPB8突變株的誘導(dǎo)生長曲線

2.7突變菌株EPB8產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

（1）誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響.按1.2（6）所述方法進行測定，結(jié)果如圖7所示.由圖7可知，誘導(dǎo)時間2 h時酶活性最高，隨著時間的延長，酶活性有所降低，可能IPTG和磷脂酶A1對菌體都有一定毒害作用.誘導(dǎo)時間不宜過長，過長則菌體可能發(fā)生自溶，從而影響目的產(chǎn)物表達.故EPB8菌株最佳誘導(dǎo)時間為2 h.

（2）誘導(dǎo)溫度對產(chǎn)酶的影響.誘導(dǎo)溫度對目的產(chǎn)物的表達及酶活有著至關(guān)重要的作用，若誘導(dǎo)溫度過高，重組蛋白會形成大量的無活性包涵體，以致胞外酶活降低；溫度過低，影響菌體生長，從而影響重組蛋白的表達.按照1.2（6）所述方法進行測定，誘導(dǎo)2 h測定發(fā)酵液酶活，結(jié)果如圖8所示.由圖8可知，誘導(dǎo)溫度為37℃時，酶活性最高，誘導(dǎo)溫度過高或過低，酶活性都會降低，所以，最佳誘導(dǎo)溫度為37℃.

（3）誘導(dǎo)起始OD600對產(chǎn)酶的影響.誘導(dǎo)起始OD600對菌體產(chǎn)酶有著較大影響，按照1.2（6）所述方法測定，誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間2 h后測定發(fā)酵液酶活，結(jié)果如圖9所示.由圖9可知，誘導(dǎo)時間過早，菌體生長緩慢且菌體量少，外源蛋白的表達量可能會降低，酶活性也不高；若誘導(dǎo)時間過遲，細(xì)菌自身代謝能力降低，不利于外源基因表達，酶活性也是相對較低.當(dāng)OD600為0.8時誘導(dǎo)，磷脂酶A1活性最高，誘導(dǎo)起始OD600過高過低都會影響酶活，所以最佳誘導(dǎo)起始OD600為0.8.

（4）IPTG誘導(dǎo)濃度對產(chǎn)酶的影響.按照1.2（6）所述方法確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)起始OD600為0.8、誘導(dǎo)2 h后測定發(fā)酵液粗酶活，結(jié)果如圖10所示.由圖10可知，IPTG濃度為0.3 mmol/L時，酶活性最高，IPTG作為誘導(dǎo)劑能啟動lac啟動子的轉(zhuǎn)錄，使目的基因得以表達［12］；IPTG濃度＞0.3 mmol/L時，酶活性降低，可能是IPTG本身對細(xì)胞具有一定的毒性，對菌體生長有一定抑制作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低；IPTG濃度＜0.3 mmol/L時，酶活性也降低.因此，確定最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.3 mmol/L.

圖7　誘導(dǎo)時間對酶活的影響

圖8　溫度對酶活的影響

圖9　誘導(dǎo)OD600對酶活的影響

圖10　IPTG濃度對酶活的影響

3　結(jié)論與討論

研究確定了易錯PCR條件：Mg2+濃度為7 mmol/L、Mn2+濃度為0.1 mmol/L，成功構(gòu)建了突變文庫.通過篩選最后得到酶活提高的突變株EPB8，該突變株最初酶活性測定為19.6 U/m L，相對于未突變前菌株BP28的酶活16 U/m L提高了22.5%，通過進行單因素實驗優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活達22.5 U/m L，比優(yōu)化前提高了14.8%.

粘質(zhì)沙雷氏菌磷脂酶A1基因plaB經(jīng)易錯PCR方法的定向改造后，磷脂酶A1活性有了較大提高，為后期磷脂酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究提供了一定的素材.突變株EPB8經(jīng)測序分析表明：有7個氨基酸發(fā)生突變，其中288位由X突變?yōu)長，與之前推斷的第195位Ser為此磷脂酶A1的催化中心相距較近，這也可能是酶活提高的原因之一；而亮氨酸又為疏水性氨基酸，疏水性氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)部，具有保持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的作用，288位氨基酸的突變可能會使磷脂酶A1的三級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這也為磷脂酶A1的研究奠定了一定的基礎(chǔ).

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Improving the Activity of Phospholipase A1 from Serratia Marcescs PL-06 by Error-prone PCR

WANG Yu-man，XUE Zheng-lian?，WANG Zhou，SU Yan-nan，ZHU Hao
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

In order to obtain phospholipase A1 with higher activity，error-prone PCR was used to evolve the phospholipase A1 from Serratia marcescens PL-06 by adding different concentration of Mg2+and Mn2+.The gene was cloned into p ET28a（+）expression vector，and a mutant library was constructed.After the first and secondary screening，one mutant showed significant elevated activity，named EPB8.The enzyme activity of the mutants was 22.5%higher than that of the wild-type control.And increased by 41%after optimal Fermentation conditions.The sequence of the plaB gene of the mutants showed 7 mutated amino acids.It was found that phospholipase A1 protein revealed three amino acid substitutions：Y97C，P98S，X228L，and auxiliary protein revealed four amino acid substitutions：P46L，Q58L，N136D，H233R.These results provide a basis for further research of phospholipase A1.

Serratia marcescens；phospholipase A1；error-prone PCR；optimization of fermentation conditions

Q786

A

1672-2477（2016）04-0006-06

2016-01-10

國家自然科學(xué)基金資助項目（31471615）

王玉滿（1989-），女，山東成武人，碩士研究生.

薛正蓮（1967-），女，安徽和縣人，教授，碩導(dǎo).