AKT1基因rs1130214位點(diǎn)基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌的病例對(duì)照研究

田　莉, 謝惠芳, 孫高峰,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊　830011; 2烏魯木齊市疾病預(yù)防控制中心， 烏魯木齊　830026)

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AKT1基因rs1130214位點(diǎn)基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌的病例對(duì)照研究

田莉1, 謝惠芳1, 孫高峰1,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊830011;2烏魯木齊市疾病預(yù)防控制中心， 烏魯木齊830026)

目的探討AKT1基因rs1130214位點(diǎn)基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌的關(guān)系。方法采用病例對(duì)照法，選擇原發(fā)性肝癌患者127例(病例組)、肝癌高危者81例(內(nèi)對(duì)照組)、健康體檢者103例(外對(duì)照組)，采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法檢測(cè)AKT1基因rs1130214位點(diǎn)的基因多態(tài)性。結(jié)果病例組AKT1基因rs1130214位點(diǎn)等位基因G和T的頻率分別為76.8%(195/254)和23.2%(59/254)，內(nèi)對(duì)照組分別為68.1%(109/160)和31.9%(51/160)，外對(duì)照組分別為62.1%(128/206)和37.9%(78/206)。3組各等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.7,P=0.003)。病例組rs1130214基因型分布純合子TT型、野生型GG型、雜合子GT型分別為3例(2.3%)、71例(55.9%)和53例(41.7%)；內(nèi)對(duì)照組中為4例(5.0%)、33例(41.3%)和43例(53.8%)，外對(duì)照組為9例(8.7%)、34例(33.0%)和60例(58.3%)，3組各基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.7,P=0.005)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)與野生純合子GG基因型相比，發(fā)生肝癌的概率為2.54倍(OR=2.41，95%CI:1.48～4.35)，為原發(fā)性肝癌的易感基因。結(jié)論AKT1基因rs1130214位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān)，突變基因型(GT+TT)可能是原發(fā)性肝癌的易感基因。

原發(fā)性肝癌； AKT1； 基因多態(tài)性

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是發(fā)生于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的癌癥，其惡性程度高，生存期短，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康，5年生存率僅為3%～5%[1]。我國(guó)每年被診斷為原發(fā)性肝癌的病例占世界新發(fā)病例的55%，肝癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命的惡性腫瘤之一[2]。流行病學(xué)和病因?qū)W研究表明AKT1基因與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[3-5],同時(shí)也有研究指出AKT在肝癌中有異常表達(dá)[6-7]。本研究采用病例對(duì)照研究方法，探討PHC發(fā)病與AKT1(rs1130214)的關(guān)系，以期為PHC的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇新疆醫(yī)科大學(xué)腫瘤附屬醫(yī)院2014年6月-2015年6月首次住院治療原發(fā)性肝癌患者127例(病例組)，其中男性101例(79.5%)，女性26例(19.4%)，平均年齡(54.95±9.66)歲。肝癌患者的診斷依據(jù)為中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)最新公布的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。選取經(jīng)國(guó)家癌癥早診早治項(xiàng)目篩查確定為肝癌高危者81例(內(nèi)對(duì)照組)，其中男性52例(64.2%)，女性29例(35.8%)，平均年齡(53.83±7.70)歲。選取同時(shí)期新疆醫(yī)科大學(xué)腫瘤附屬醫(yī)院體檢科參加健康體檢者103例(外對(duì)照組)，其中男性81例(78.6%)，女性22例(21.4%)，平均年齡(5.13±7.90)歲。外對(duì)照組均無(wú)任何肝病史及腫瘤史。所有樣本均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1基因組提取采集患者外周血1 mL，加入5%EDTA抗凝，—80℃冰箱保存?zhèn)溆??；蚪M提取采用天根全血基因組提取試劑盒，提取步驟按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2PCR反應(yīng)體系及條件rs1130214位點(diǎn)上游引物5’-GTGCTCCTCACTGACGGACT T-3’，下游引物5’-AGCCTCCCTAACCTGATGCAC-3’參考自文獻(xiàn)[9]，由華大基因合成。PCR總反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 11 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))條件:預(yù)變性93℃ 3 min，擴(kuò)增包括變性93℃ 30 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30次；再延伸72℃ 5 min。取產(chǎn)物6 μL于2%EB染色瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為465 bp。

1.2.3 酶切體系及條件取PCR產(chǎn)物10 μL，分別加入1×NE Buffer 5 μL，限制性內(nèi)切酶Xcm I 10 units(2 μL)，ddH2O 33 μL，總體系50 μL,恒溫水浴60 min。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，AKT1各基因型及基因頻率的分布采用χ2檢驗(yàn)，各基因型與肝癌相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析，采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AKT1基因rs1130214位點(diǎn)酶切結(jié)果AKT1基因rs1130214位點(diǎn)酶切后野生純合子GG基因型出現(xiàn)2個(gè)條帶(289 bp+167 bp),突變純合子出現(xiàn)1個(gè)條帶TT(456 bp),突變雜合子GT基因型出現(xiàn)3個(gè)條帶(456 bp+289 bp+167 bp)，取酶切產(chǎn)物6 μL于3%EB染色瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖1。

2.2AKT1基因rs1130214位點(diǎn)基因型及等位基因分析3組rs1130214位點(diǎn)基因型頻率分布符合hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，病例組中AKT 1基因野生型GG 71例(55.9%)，純合子TT 3例(2.3%)，雜合子GT 53例(41.7%)；內(nèi)對(duì)照組中，野生型GG 33例(41.3%)，純合子TT 4例(5.0%)，雜合子GT 43例(53.8%)，外對(duì)照組野生型GG 34例(33.0%)，純合子TT 9例(8.7%)，雜合子GT 60例(58.3%)，3組各基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.7，P=0.005)，見(jiàn)表1。病例組等位基因G和T的頻率分別為76.8%(195/254)和23.2%(59/254)，內(nèi)對(duì)照組分別為68.1%(109/160)和31.9%(51/160)，外對(duì)照組分別為62.1%(128/206)和37.9%(78/206)。3組等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.7,P=0.003)，見(jiàn)表2。

表1AKT1基因rs1130214位點(diǎn)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)及基因型分布/例(%)

分組例數(shù)AKT1基因rs1130214基因分型GGTTGTχ2P值病例組12771(55.9)3(2.3)53(41.7)內(nèi)對(duì)照組8133(41.3)4(5.0)43(53.8)14.70.005外對(duì)照組10234(33.0)9(8.7)60(58.3)

表2　AKT1基因rs1130214位點(diǎn)等位基因分布/例(%)

2.3AKT1基因rs1130214位點(diǎn)Logostic回歸分析以內(nèi)對(duì)照組和外對(duì)照組為因變量，與野生純合子GG基因型相比，突變基因型(GT+TT)發(fā)生肝癌的概率為1.38倍(OR=1.38，95%CI:0.75～2.52)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以病例組和外對(duì)照組為因變量，二元Logiestic 回歸分析顯示，與野生純合子GG基因型相比，突變基因型(GT+TT)發(fā)生肝癌的概率為2.54倍(OR=2.41，95%CI:1.48～4.35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3　AKT1基因rs1130214位點(diǎn)Logostic回歸分析

3　討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，有明顯的家族聚集現(xiàn)象， 其本質(zhì)是因?yàn)檫z傳因素和肝癌之間存在著相關(guān)性。由于遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變而引起原癌基因活化和抑癌基因滅活是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的關(guān)鍵過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存有導(dǎo)致肝癌的易感基因[10]。因此研究肝癌相關(guān)易感基因成為了人類(lèi)了解肝癌的又一方向。

AKT作為PI3K/AKT 信號(hào)通路的下游調(diào)控因子，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持和分化中起作用[11]。AKT經(jīng)PI3K活化后生成磷酸化AKT(p-AKT)發(fā)揮促腫瘤細(xì)胞生存、促進(jìn)細(xì)胞周期行進(jìn)以及促生長(zhǎng)作用，是PI3K/AKT 信號(hào)通路的核心效應(yīng)[12]。Kim 等[13]認(rèn)為AKT基因多態(tài)性與早期非小細(xì)胞型肺癌的預(yù)后有關(guān)。Piao等[14]的研究表示AKT基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生有關(guān)。抑制AKT信號(hào)通路的活化，就能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。李一春等[15]研究表明通過(guò)抑制AKT 蛋白磷酸化發(fā)揮作用可抑制肝癌hepG-2細(xì)胞增殖。根據(jù)以上報(bào)道，推測(cè)AKT1基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌的發(fā)生可能有密切的關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)AKT1基因與原發(fā)性肝癌的研究多停留在其蛋白異常表達(dá)的研究，鮮有該基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌關(guān)聯(lián)性的研究，因此進(jìn)一步研究與探討AKT1基因在肝癌中的作用及機(jī)制是非常必要的。本研究選擇AKT1 rs1130214突變位點(diǎn)，分析該位點(diǎn)基因多態(tài)性與新疆地區(qū)人群原發(fā)性肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示：病例組、內(nèi)對(duì)照組和外對(duì)照組間該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明AKT1 rs1130214位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與新疆地區(qū)人群原發(fā)性肝癌發(fā)病有關(guān)聯(lián)?；蛐蚅ogistic回歸分析顯示，突變基因型(GT+TT)可能為原發(fā)性肝癌發(fā)生的易感基因型，這將有助于篩選肝癌高危人群或易感個(gè)體，并為個(gè)性化的癌癥診治提供依據(jù)。本研究結(jié)果仍需完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的大樣本量的、研究對(duì)象的人群代表性較高的研究進(jìn)行進(jìn)一步的深入探索和驗(yàn)證。

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(本文編輯施洋)

Case-control study of primary hepatic carcinoma and rs1130214 of AKT1 gene polymorphism

TIAN Li1, XIE Huifang1, SUN Gaofeng1,2

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;CenterforDiseaseControlandPrevention,Urumqi830026,China)

ObjectiveTo investigate the relationshaps between AKT1 gene polymorphism and primary hepatic carcinoma. MethodsIn the case-control study, 127 cases of primary hepatic carcinoma patients were enrolled as case group, 81 cases with high risk factor of hepatic carcinoma as intra-control and 103 case of health people as extra-control. PCR-RFLP was used to detect the gene polymorphism of AKT1 of rs1130214. ResultsIn the cases group, the frequency of the alleles G and T of AKT1 of rs1130214 were 76.8%(195/254) and 23.2%(59/254), 68.1%(109/160) and 31.9%(51/160) in the intra-control group, 62.1%(128/206) and 37.9%(78/206) in the extra-control group, respectively, and the differences of allele distribution between the three groups was statistically significant (χ2=11.7, P=0.003). In the case group, the genotype distribution of rs1130214 in homozygote TT, wild type GG and heterozygote TG were 3(2.3%), 71(55.9%) and 53(41.7%) respectivily. In the intra-control group were 4(5.0%), 33(41.3%) and 43(53.8%) respectivily. In the extra-control group were 9(8.7%), 34(33.0%) and 60(58.3%) respectivily, and the difference the of genotype distribution among the three groups was statistically significant (χ2=14.7, P=0.005). Logistic regression analysis found that mutation genotype (GT+TT) was the risk factor of primary hepatic carcinoma (OR=2.41, 95%CI:1.48～4.35), compared with wild homozygous GG genotype. ConclusionThe gene polymorphism of AKT1 of rs1130214 may be associated with the occurrence of primary hepatic carcinoma and mutation genotype (GT+TT) may be the risk factor of primary hepatic carcinoma.

primary hepatic carcinoma; AKT1; gene polymorphism

烏魯木齊市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y141310052)

田莉(1991-)，女，在讀碩士，研究方向：疾病預(yù)防與控制。

孫高峰(1974-)，男，在讀博士，副主任醫(yī)師，研究方向：疾病預(yù)防與控制，E-mail：sgfxj2004@126.com。

R735.7

A

1009-5551(2016)06-0757-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.023

2016-1-27]