APE/Ref-1和Trx1在宮頸癌中的表達及相關性研究

楊明霞， 楊整哉， 曲　群， 段　釗

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 西安　710004)

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APE/Ref-1和Trx1在宮頸癌中的表達及相關性研究

楊明霞， 楊整哉， 曲群， 段釗

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 西安710004)

目的： 探討宮頸癌中氧化還原因子1(APE/Ref-1)和硫氧還蛋白1(Trx1)的表達及其與宮頸癌相關臨床參數(shù)的關系。方法采用免疫組化S-P法檢測9例正常宮頸組織、20例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)、38例宮頸癌中APE/Ref-1 和Trx1的表達水平，分析各自表達水平與宮頸癌相關臨床參數(shù)的關系。結果在正常宮頸組織中APE/Ref-1和Trx1均呈低表達，分別為22.2%、12.5%;在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)中均呈中等量表達，分別為65.0%、55.0%;在宮頸癌組織中均呈高表達，分別為84.2%、89.4%；APE/Ref-1的表達與宮頸癌的臨床分期、病理分級有關，Trx1的表達與宮頸癌的病理分級、淋巴結轉移有關；在宮頸癌組織，APE/Ref-1和Trx1蛋白的表達呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(r=0.557，P=0.000)。結論APE/Ref-1和Trx1可能共同參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

宮頸癌； 氧化還原因子1； 硫氧還蛋白1； 免疫組織化學

宮頸癌是目前嚴重危害婦女健康的第二大惡性腫瘤，在世界范圍之內(nèi)，宮頸癌占女性惡性腫瘤發(fā)病的9%，居于第2位[1]。APE/ Ref-1基因定位于人第14號染色體長臂上(14q11. 2～12)，其N端還包括一個核內(nèi)定位序列或一個核內(nèi)定位信號(NLS)。APE /Ref- 1 的NH2末端區(qū)有Ref-1的氧化還原活性，而COOH2末端區(qū)有修復DNA的功能[2]。大量研究表明：APE/Ref-1的亞細胞分布模式和腫瘤細胞的侵襲性及預后密切相關，并發(fā)現(xiàn)核內(nèi)型總是和較好的預后相聯(lián)系，而APE/Ref-1蛋白的表達水平改變常常與腫瘤放化療敏感性有關[3]。本研究旨在探討APE/Ref-1和Trx1在宮頸癌中的表達及其與相關臨床參數(shù)的關系。

1　材料與方法

1.1研究對象從西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科選取2013年6月-2015年6月經(jīng)手術切除及病理證實為子宮肌瘤/子宮腺肌癥、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變、宮頸癌的宮頸石蠟切塊共67例(術前均未行放化療)。對照組：選取正常宮頸組織9例，均取自于因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除且術前宮頸刮片未見異常的患者，平均年齡48.4歲；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)20例，取自術前因宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變行全子宮切除切術且術后病檢報告確診為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的患者，平均年齡50.2歲。宮頸癌組：選取宮頸癌38例(鱗狀細胞癌33例，腺癌5例)，取自術前因宮頸活檢證實為宮頸癌且術后確診為宮頸癌的患者，平均年齡為49.5歲。

1.2免疫組化組織切成4 μm切片，常規(guī)脫蠟處理后，水化后梯度酒精脫水，PBS(pH=7.4)沖洗3次，抗原修復后50 μL 過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，抗原封閉50 μL的非免疫性動物血清，將組織周圍殘存的血清擦干(勿沖洗)，加入適度稀釋的(1∶50)APE/Ref-1兔抗人單克隆抗體，然后4℃冰箱過夜；每張切片分別加入50 μL生物素標記的第二抗體山羊抗兔IgG液，室溫孵育30 min；DAB顯色。參照相關文獻[4-5]方法：APE/Ref-1 蛋白和Trx1蛋白均以細胞核或細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比兩者的乘積，進行半定量分析。

1.3判定標準采用單盲法閱片，每張切片隨機選取3～5個高倍視野進行計數(shù)(×400)，每個視野中取200個細胞計數(shù)。對染色強度打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再對陽性細胞數(shù)占百分比打分：0分為陰性，1分為陽性細胞數(shù)≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%。計算染色強度與陽性細胞數(shù)百分比乘積，≤3為陰性，>3分為陽性。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和資料特點，本實驗資料屬于計數(shù)資料，服從正態(tài)分布，當每一格子期望頻數(shù)E≥5，且總數(shù)≥40例時，采用行*列表資料的χ2檢驗。但當總數(shù)≥40例，而任何一個格子期望值1≤E<5時，采用連續(xù)性校正χ2檢驗。當總數(shù)<40例或有期望值<1時，采用Fisher確切概率檢驗。相關性分析采用Spearman相關系數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1APE/Ref-1在不同宮頸組織中的表達APE/Ref-1蛋白在正常宮頸組織中呈胞核表達，呈淡黃色顆粒(圖1a)；而在CIN組織中陽性顆粒呈棕黃色，主要表達于細胞核，偶有細胞質的表達(圖1b、c)，陰性表達(圖1d)；在宮頸癌組織中陽性顆粒有胞核、胞質、核質共表達3種(見圖1e、f、g)。

在67例不同宮頸組織中，APE/Ref-1蛋白的陽性表達率為70.1%，并且隨著病變程度的加重，在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌中的陽性表達率分別為22.2%、65.0%、84.2%，不同宮頸組織間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.714，P=0.001)；宮頸癌組APE/Ref-1陽性表達率顯著高于對照組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.048，P=0.001)；正常宮頸組織組與CIN組APE/Ref-1陽性率相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.050)，CIN組與宮頸癌組相比差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.786，P=0.181)；CIN組組內(nèi)比較，APE/Ref-1的陽性表達率逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.160)。

2.2Trx1在不同宮頸組織中的表達Trx1蛋白陽性顆粒主要表達在細胞核或細胞質中，呈棕黃色顆粒，在正常宮頸組織中陽性表達(圖2a)；CIN中的陽性表達見(2b、c、d)，弱陽性表達(圖2e)，陰性表達(圖2f)；在宮頸癌組織中呈胞核或胞質表達(圖2f)。

在67例不同宮頸組織中，Trx1蛋白的陽性表達率為68.7%，并且隨著病變程度的加重，Trx1蛋白的陽性表達率逐漸升高，在正常宮頸、CIN、宮頸癌中的陽性表達率分別為12.5%、55.0%、89.4%，不同宮頸組織間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=23.235，P=0.000)；宮頸癌組及CIN組Trx1的陽性表達率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.561，P=0.000；P=0.043)；CIN組與宮頸癌組間Trx1的陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.082，P=0.008);CIN組組內(nèi)比較，Trx1陽性表達率逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.653)。

a: APE/Ref-1在正常宮頸中的表達

b: APE/Ref-1在CINII中的陽性表達

c: APE/Ref-1在CINIII中的陽性表達

d: APE/Ref-1在CINIII中的陰性表達

e: APE/Ref-1在高分化宮頸鱗癌中的陽性表達

f： APE/Ref-1在中分化宮頸鱗癌中的陽性表達

g： APE/Ref-1在低分化宮頸鱗癌中的陽性表達(×400)

圖1APE/Ref-1在不同宮頸組織中的表達

a: Trx1在正常宮頸中的陽性表達

b: Trx1在CINII中的陽性表達

c: Trx1在CINII中的陰性表達

d: Trx1在CINIII中的陽性表達)

e: Trx1在CINIII中的弱陽性表達

f: Trx1在宮頸鱗癌中的陽性表達(×400)

圖2Trx1在不同宮頸組織中的表達

2.3APE/Ref-1、TrX1蛋白表達與宮頸癌臨床病理因素的關系在宮頸癌中APE/Ref-1的陽性表達率與宮頸癌的臨床分期、病理分級有關，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.030；P=0.042)；APE/Ref-1的陽性表達率與宮頸癌的病理類型、淋巴結是否轉移及年齡無關，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.169；P=0.094；P=0.234);Trx1的陽性表達率與宮頸癌的病理分級及淋巴結轉移有關，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016；P=0.024)，而與宮頸癌的病理類型、病理分級及年齡無關，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.446；P=0.124；P=0.513),見表1。

表1　APE/Ref-1、TrX1蛋白表達與宮頸癌臨床病理因素的關系

2.4宮頸癌中APE/Ref-1和Trx1表達的相關性在宮頸癌，APE/Ref-1和Trx1蛋白同時有31例呈陽性表達，有3例均呈陰性表達，在APE/Ref-1陰性組Trx1有3例呈陽性表達，在Tx1陰性組APE/Ref-1有1例呈陽性表達，兩者的表達呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(r=0.557，P=0.000)，見表2。

表2　宮頸癌中APE/Ref-1和Trx1表達的相關性

3　討論

缺氧發(fā)生在實體腫瘤，這是很多腫瘤包括宮頸癌在內(nèi)的一個影響腫瘤預后的重要特征。腫瘤組織的缺氧程度主要取決于對腫瘤組織中氧分壓的測定，而這個主要是看腫瘤組織的血液供應及其缺氧的程度[7-8]。林爽等[9]通過把宮頸癌Hela細胞暴露在不同氧濃度下測定后發(fā)現(xiàn)細胞適度缺氧可促進HIF-1α的表達，降低腫瘤細胞的黏附力，同時使腫瘤細胞侵襲能力增加。細胞暴露在缺氧環(huán)境下耐輻射，這是由放射生物學效應(氧效應)來決定的。而目前對于缺氧的癌癥患者其預后不良是不能完全用抗輻射效應來解釋的，經(jīng)過手術治療的患者，其預后不良也與缺氧相關。尹健等[10]通過使用動物模型以及對缺氧的癌癥腫瘤患者研究表明：缺氧的腫瘤患者更易發(fā)生轉移，并且抗凋亡能力比含氧量高的腫瘤患者強。因此研究腫瘤患者缺氧的分子機制受到更多的關注。

APE/Ref-1和Trx1作為體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)中的2個重要的抗氧化蛋白，在機體缺氧過程中發(fā)揮了很重要的作用。本研究采用免疫組化(S-P)法聯(lián)合檢測宮頸癌中氧化還原因子(APE/Ref-1)和硫氧還蛋白1(Trx1)的表達情況，分析2個抗氧化蛋白與宮頸癌臨床病理特征的關系，并探討二者之間是否存在相關性。結果發(fā)現(xiàn)：與正常宮頸組織相比，宮頸癌中Trx1和APE/ Ref-1的表達均顯著升高，Trx1的表達與SugamaK等[11]及脫淑敏等[12]報道的結果是一致的。本研究觀察到的Trx1和APE/Ref-1相對于正常的宮頸上皮來說，在宮頸癌癌組織中呈現(xiàn)高表達，并且發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞分化程度越差，浸潤范圍越大，Trx1和APE/Ref-1的表達率就越高。并且APE/Ref-1蛋白在隨著腫瘤細胞分化程度越差，其表達逐漸由胞核轉移至胞質，而Trx1并沒有這種移位現(xiàn)象，這可能與宮頸癌細胞在缺氧等環(huán)境刺激下，機體對缺氧環(huán)境的應答有關。

本實驗聯(lián)合檢測Trx1和APE/Ref-1蛋白在宮頸癌中的表達，結果顯示兩者呈正相關，說明Trx1和APE/Ref-1在宮頸癌組織中表達上調(diào)，其表達水平與腫瘤的惡性程度相關，其表達與宮頸癌的病理分級密切相關，而與疾病的病理類型及年齡無關，說明Trx1和APE/Ref-1在宮頸癌組織中的過度表達可能與其發(fā)生、發(fā)展有關，二者共同作用可能參與了宮頸癌惡化的調(diào)控，聯(lián)合檢測Trx1和APE/Ref-1有助于提高宮頸癌預后的評價。

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(本文編輯張巧蓮)

The expression and correlation research of APE/Ref -1 and Trx1 in cervical carcinoma

YANG Mingxia， YANG Zhengzai， QU Qun， DUAN Zhao

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

ObjectiveTo explore the expression level of oxidation reduction factor-1 (APE/Ref-1) and thioredoxin 1 (Trx1) in cervical cancer, To analysis the relationship between them and clinical pathology. MethodsThis experiment used Immunohistochemistry S-P method to detect the expression of APE/Ref-1 and Trx1 in 9 normal cervical tissue cases, 20 cases of cervical intraepithelial neoplasia and 38 cervical cancer cases. And the results were analysed with relevant statistical methods. ResultsAPE/Ref -1 and Trx1 had weak expression in normal cervical tissue (22.2%， 12.5%), moderate expression in CIN (65.0%， 55.0%) and strong positive expression in cervical cancer ( 84.2%, 89.4%), respectively； The expression of APE/Ref-1 was associated with the clinical stage, pathological classification of cervical cancer， while the expression of Trx1 was associated with the pathological classification and lymph nodes metastasis of cervical cancer. The expression of APE/Ref-1 and Trx1 protein were positively related in cervical cancer, and the difference was statistically significant (γ=0.557, P=0.000). ConclusionThe expression of APE/Ref-1 and Trx1 protein were positively correlated in cervical cancer ,which may suggest that both of proteins may be involved in the occurrence and development of cervical cancer.

cervical cancer; APE/Ref-1； Trx1; Immunohistochemistry

陜西省自然科學基金(2013JM4012)

楊明霞(1988-)，女，在讀研究生，研究方向: 婦科腫瘤臨床。

段釗，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：duanzhao8@163.com。

R34; R737.33

A

1009-5551(2016)06-0731-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.016

2016-01-26]