調肝蠲濁顆粒對脂肪肝大鼠模型的調脂保肝功效及機制

劉　晶， 盧　軍， 黎耀東

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部， 烏魯木齊　830000)

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調肝蠲濁顆粒對脂肪肝大鼠模型的調脂保肝功效及機制

劉晶， 盧軍， 黎耀東

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部， 烏魯木齊830000)

目的研究調肝蠲濁顆粒對非酒精性脂肪肝大鼠模型的調脂保肝功效及機制。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠10只(正常對照組)給予正常飼料喂養(yǎng)，50只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)6 w，造模成功后，隨機分成5組：模型對照組、陽性對照組及調肝蠲濁顆粒低、中、高劑量組。除正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水外，陽性對照組灌胃血脂康膠囊(0.12 g·kg-1·d-1)，調肝蠲濁顆粒低、中、高劑量組分別灌胃調肝蠲濁顆粒的水醇提取物，藥物干預劑量依次為2.66、5.3、10.6 g·kg-1·d-1。分別檢測給藥后大鼠血清中膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)的水平，通過酶聯免疫法(ELISA)檢測大鼠血清中過氧化脂質(LPO)、C反應蛋白(CRP)的水平。結果血清血脂指標檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組TC、TG及LDL水平均顯著升高，HDL水平有所下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組比較，調肝蠲濁顆粒3個劑量組TG水平無明顯變化，TC、HDL以及LDL水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，調肝蠲濁顆粒高劑量組TC、HDL及LDL水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中調肝蠲濁顆粒高劑量組TC水平降低更明顯。血清肝功指標檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組ALT和AST水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組比較，調肝蠲濁顆粒低、中、高3個劑量組ALT和AST水平的影響，依次呈現降低趨勢，其中以高劑量組最為明顯(P<0.05)；高劑量組與低劑量組、中劑量組ALT和AST水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血清學指標檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組LPO與CRP水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組比較，陽性對照組以及3個劑量調肝蠲濁顆粒藥物組LPO與CRP水平均大幅度下降，并以調肝蠲濁顆粒高劑量組最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，調肝蠲濁顆粒高劑量組的CRP水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余劑量組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組與低劑量組、中劑量組血清中LPO和CRP水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論調肝蠲濁顆粒對高脂血癥的治療及肝臟的保護均具有一定療效，以降低血清膽固醇水平最為顯著，并且能夠降低血清中LPO及CRP水平。

調肝蠲濁顆粒； 脂肪肝； 過氧化脂質(LPO)； C反應蛋白(CRP)

脂肪性肝病(fatty liver disease, FLD)作為病理性肝臟損傷的總稱，是由于疾病或藥物等因素導致肝細胞內脂質積聚超過肝濕重的5%，其通常包括脂肪性肝炎、單純脂肪性肝病、 肝纖維化以及肝硬化[1]。據最新統(tǒng)計數據顯示在我國35～74歲的人群中肥胖者的人數高達1.19億人，其中有1.26億人為向心性肥胖者，肥胖人數較1991年增長了1倍[2]，這是一組值得關注的數據。脂肪性肝病不單是對肝臟的損害，其發(fā)病過程與“共同土壤——胰島素抵抗”相聯系，使得隨之而來的心腦血管疾病的患病風險也逐漸增加[3]。由此可見，脂肪性肝病不可忽視。針對影響FLD發(fā)生、發(fā)展的主要危險因素，采取與之相對應的有效干預措施，不僅能夠減輕終末期肝病的發(fā)生、發(fā)展和縮短病程，還可以預防心腦血管疾病的發(fā)生。

根據脂肪肝的癥狀、體征，中醫(yī)學將其歸屬于“脅痛”、“癥瘕”、“濕阻”“痞滿”、“肝著”、“肝癖”等范疇。調肝蠲濁顆粒就是在中醫(yī)理論的指導下，以“虛、痰、瘀、滯”為用藥特點，處方中以生黃芪、補骨脂健脾益胃、調補元氣，健脾溫腎治其虛[4]；生黃芪行氣滯，生山楂化食滯，以通其滯；三七粉行血分之瘀，以化其瘀；使邪有出路以祛其痰；全方具有疏肝補腎扶脾、消積活血和消導化痰的作用，臨床觀察有顯著療效[5]。

本研究基于調肝蠲濁顆粒前期工藝研究基礎，考察醇水提工藝制備的調肝蠲濁顆粒對大鼠調脂保肝作用的功效，探討調肝蠲濁顆粒防治高脂血癥的作用靶點和機制。為調肝蠲濁顆粒用于防治脂肪肝和高脂血癥提供理論基礎及實驗依據，也為開發(fā)新疆中藥資源和促進中藥現代化提供理論指導。

1　材料與方法

1.1中藥材、試藥、試劑和儀器中藥材：黃芪、澤瀉、大黃等9味藥材均采購于安徽省毫州市雙華中藥飲片廠，經新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部藥檢室按照《中國藥典》2010年版一部該藥材項下的規(guī)定進行鑒定和檢測，均符合要求。試藥：由新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部藥研室提供(批號：20140610)；陽性對照藥：血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司，批號：20130602)，膽固醇(Cholesterol, 美國Amresco公司，批號：2771C350)，豬膽鹽(Bile salt form pig, 上海信譽生物科技有限公司，批號：110318)，丙硫氧嘧啶(德國RIEMSER Aqzneimittel公司，批號：611450)。試劑：水合氯醛(上海萬疆生物技術有限公司，批號：20100221)，LPO和CRP試劑盒(上海裕平生物科技有限公司)。儀器：高速低溫冷凍離心機(美國Sigma公司)，電子天平(上海精宏實驗設備有限公司)，酶標分析儀(ThermoFisher公司)。

1.2實驗動物昆明小鼠20只，清潔級，體質量18～20 g，雌性各半；Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，清潔級，體質量160～180 g，雌雄各半[由新疆實驗動物研究中心提供，動物合格證號：SCXK(新)2003-0002]。

1.3藥物提取制備調肝蠲濁顆粒的水醇提取工藝：第一步將處方的中黃芪、茵陳、苦丁茶以10倍量的水溶液為溶媒進行提取，分別提取2次，提取時間為1 h，合并提取藥液，過濾，將濾液以60℃濃縮干燥成相對密度為1.05 g/mL的稠膏；第二步將處方中的澤瀉、決明子、山楂、補骨脂、生大黃加10倍量80%乙醇醇提2次，提取時間與過濾濃縮方法同第一步；第三步將水提和醇提的稠膏在60℃以下干燥，粉碎成細分后與三七粉混勻。

1.4急性毒性實驗昆明小鼠20只，正常飼養(yǎng)3 d后禁食12 h。采用最大耐受量法[6]，按藥物最大允許濃度(1.3 g/mL)和小鼠最大允許容量給小鼠灌胃給藥調肝蠲濁顆粒的水醇提取物，當日給藥2次，中間間隔2 h，持續(xù)觀察14 d，分別記錄小鼠給藥后0、7、14 d體質量改變情況，以及其外觀、行為、飲食、分泌物、排泄物等的變化。

1.5高脂飼料制備[7]將2%膽固醇、1%豬膽鹽、0.2%丙硫氧嘧啶、10%豬油、5%蛋黃粉、81.8%基礎飼料6種成分混合壓制后烘干。其中豬油由市售豬油加熱，濾過，去渣而成；蛋黃粉是將雞蛋煮熟后，去除蛋白，將蛋黃粉碎過篩后60℃烘干；基礎飼料由新疆實驗動物中心提供。

1.6模型的建立及分組正常對照組給予正常飼料喂養(yǎng)，其余均給予高脂飼料喂養(yǎng)6 w。6 w后，大鼠尾靜脈采血2 mL，靜置20 min后以4 000 r/min離心15 min，取血清。采用酶法檢測血清中膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)水平。根據檢測結果將50只大鼠隨機分成模型對照組、陽性對照組、調肝蠲濁顆粒低劑量組、調肝蠲濁顆粒中劑量組、調肝蠲濁顆粒高劑量組。

1.7藥物干預正常對照組與模型對照組給予生理鹽水。陽性對照組給予藥物血脂康膠囊，血脂康膠囊人體臨床用藥量為1.2 g/d，大鼠血脂康膠囊的等效劑量：1.2×6/60 =0.12 g·kg-1·d-1。以調肝蠲濁顆粒臨床擬用量計算大鼠等效劑量，人體臨床用藥量為57 g/d。調肝蠲濁顆粒水醇提組浸膏得率為19%，臨床等效劑量：(54×0.19+3)×6/60=1.33 g·kg-1·d-1(3 g為處方中三七粉用量)。確定水醇提取物調肝蠲濁顆粒低、中、高給藥劑量分別為2.66、5.3、10.6 g·kg-1·d-1，連續(xù)給藥8 w，每周根據體質量增長依次調整給藥劑量。

1.8血清學檢測連續(xù)給藥8 w后，禁食不禁水12 h，按照體質量0.003 mL/100 g腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉后，腹主動脈采血，取血清。分別采用酶法檢測血清中TC、TG、HDL和LDL水平以及肝功生化指標ALT 和AST水平。用ELISA方法分別測定血清中過氧化脂質(Lipid Peroxide, LPO)和C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)水平。

2　結果

2.1急性毒性實驗結果調肝蠲濁顆粒給藥組給藥后定時觀察，2、4 h時部分小鼠出現倦怠、不適、聳毛等反應，給藥后8 h這些癥狀均明顯改善，次日早晨觀察恢復正常。14 d后飲食飲水正常，解剖肉眼觀察正常，沒有死亡小鼠，給藥組與正常對照組比較，基線體質量變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　急性毒性實驗14 d小鼠體質量的變化(±s， g)

注： F分組=0.010 3，P分組=0.920 3，F時間=394.804 8，P時間<0.000 1，F分組*時間=2.235 7， P分組*時間=0.121 6。

2.2血清血脂生化指標檢測結果與正常對照組比較，模型對照組TC、TG及LDL水平均顯著升高，HDL水平有所下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組比較，調肝蠲濁顆粒3個劑量組TG水平無明顯變化，TC、HDL以及LDL水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，調肝蠲濁顆粒高劑量組TC、HDL及LDL水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，調肝蠲濁顆粒高中低3個劑量組TC水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余指標組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3肝功生化指標及血清學指標檢測結果血清肝功指標檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組ALT和AST水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組比較，調肝蠲濁顆粒低、中、高3個劑量組ALT和AST水平依次呈現降低趨勢，其中以高劑量組最為明顯(P<0.05)；調肝蠲濁顆粒高、中、低3個劑量組比較，高劑量組與低劑量組、中劑量組ALT和AST水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，有一定的劑量依賴性；與陽性對照組比較，組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

血清學指標檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組LPO與CRP水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組比較，陽性對照組以及3個劑量調肝蠲濁顆粒藥物組LPO與CRP水平均大幅度下降，并以調肝蠲濁顆粒高劑量組最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，調肝蠲濁顆粒高劑量組的CRP水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余劑量組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低、中、高3個劑量組比較，高劑量組與低劑量組、中劑量組血清中LPO和CRP水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2　調肝蠲濁顆粒對脂肪肝大鼠模型血清血脂生化指標的影響(±s， n=10)

注：與模型對照組比較，*P<0.05； 與陽性對照組比較，#P<0.05； 與低劑量組比較，△P<0.05。

表3　調肝蠲濁顆粒對脂肪肝大鼠模型血清肝功生化指標的影響及LPO、CRP水平的檢測結果(±s， n=10)

注：與模型對照組比較，*P<0.05； 與陽性對照組比較，#P<0.05； 與低劑量組比較，△P<0.05； 與中劑量組比較，▼P<0.05。

3　討論

脂肪肝是一種較為常見的良性肝臟疾病，現今社會脂肪肝的患病率呈上升趨勢，并且患病人群已經越來越趨于年輕化、多樣化。有學者認為脂肪肝是代謝綜合征的肝臟表現，同時也是代謝綜合征的重要組成部分[8]。因此，盡可能早的有效預防和控制糖脂代謝紊亂，對有效預防和治療高脂血癥、心腦血管疾病以及其他代謝性相關性疾病均具有至關重要的科學理論價值和現實指導意義。調肝蠲濁顆粒是我院在臨床上使用多年的協定方試劑，并且在長期的臨床治療過程中取得較為良好的治療效果，在中醫(yī)理論的指導下，充分體現了“虛濕瘀滯并治、肝脾腎同調、從虛論治”的治療特點[9]。調肝蠲濁顆粒主要以生黃芪、茵陳為君藥，益脾胃、補元氣，使邪從中焦而化；以澤瀉、決明子、生山楂為臣藥，消食化瘀、活血開郁，使邪從小便而泄；以補骨脂、生大黃、三七粉為佐藥，補相火、壯元陽，化瘀而不傷正；以苦丁茶作為使藥，能夠清泄肝熱[10]?？傮w9種中藥按照一定比例組方能夠調節(jié)脂質的代謝，對肝臟具有一定保護作用。

脂肪肝的模型目前較多的采用高血脂動物模型，可以通過高脂飼料的喂養(yǎng)和腹腔注射的方法來進行模型的建立，前者與臨床最為接近。本研究綜合文獻方法，調整一定配比后確定高脂飼料配方，從造模結果來看，與正常對照組比較模型對照組，TC、TG及LDL各指標水平均明顯升高，HDL水平降低，ALT和AST的水平明顯升高，說明高脂飼料對模型對照組大鼠的肝臟已經造成損傷，達到脂肪肝的病變標準，成功建立了脂肪肝大鼠模型。高、中、低3個劑量組TC和LDL水平降低，但是TG沒有明顯的改善，提示調肝蠲濁顆?？赡苤皇菍渭冃愿吣懝檀佳Y有顯著療效，對于單純性高甘油三酯血癥的療效有待進一步的確定。與陽性對照組比較，給藥組差異無統(tǒng)計學意義，說明該藥物對ALT和AST水平的作用與陽性對照藥基本一致。除此之外，調肝蠲濁顆粒高、中、低3個劑量組ALT和AST水平的降低，且效果顯著，說明該藥物對于肝臟有一定的保護作用，臨床應用價值較高。本研究后期將著重針對調肝蠲濁顆粒的肝臟保護機制進行進一步的研究。

有研究表明在臨床上還沒有確診的冠心病、糖尿病、高血壓等慢性代謝性疾病的患者，已經具備了氧化應激增強的條件，氧化應激的改變從肥胖時就已經開始進行，這正是導致慢性代謝性疾病的共同基礎所在[11]。國內對肥胖病患者血漿胰島素水平及其與體質指數和脂肪分布類型的關系已有報道，但尚少見體內氧化應激狀態(tài)與高血脂、脂肪肝的相關性研究。CRP是一種非特異性的炎癥標志物，由內皮細胞、巨噬細胞和脂肪細胞衍生的促炎癥細胞因子誘導肝臟產生，非特異性炎癥刺激可使其顯著升高[12]。CRP具有反應快、敏感、客觀的特點，在臨床上能夠綜合評判炎癥性疾病的各種炎癥反應過程，包括組織壞死的損傷，因此CRP可作為炎癥反應恢復期監(jiān)測、病情評估與療效判斷的重要指標，具有很好的臨床價值[13]。脂肪肝形成的機制比較復雜，高脂血癥是其發(fā)生的重要原因，慢性炎癥貫穿其發(fā)展的全過程。本實驗結果顯示，調肝蠲濁顆粒高、中、低3個劑量組脂肪肝大鼠模型血清中LPO和CRP水平均降低，在不同劑量之間存在劑量的差異性，表明該藥物對于高脂血癥大鼠模型血清中LPO和CRP的干預具有一定的劑量依賴性，劑量越大效果越明顯。其中調肝蠲濁顆粒高劑量對于CRP的作用和陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明兩者在降低血清中CRP水平的能力基本一致。與陽性對照組比較，高劑量組LPO水平有所降低，差異有統(tǒng)計學意義，但是調肝蠲濁顆粒高劑量的藥效是否優(yōu)于血脂康膠囊，尚未能定論，需要在后期的研究工作中進一步開展研究才能確定結果。

綜上所述，調肝蠲濁顆粒對高脂血癥的治療及肝臟的保護均具有一定療效，以降低血清膽固醇水平最為顯著，并且能夠降低血清中LPO及CRP水平，這些均為調肝蠲濁顆粒的新藥研發(fā)奠定了基礎，具有深入研究的現實意義。

[1]Grant M, Lisker M. Nonalcoholic fatty liver disease[J]. Ann Hepatol, 2004, 3(3):93-99.

[2]Hu D, Xie J, Fu P, et al. Central rather than overall obesity is related to diabetes in the Chinese population:the Inter ASIA study[J]. Obesity, 2007, 15(11):2809-2816.

[3]Targher G, Arcaro G. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of cardiovascular disease[J]. Atherosclerosis, 2007, 191(2):235-240.

[4]陳俊玲, 陳敬博, 楊愛萍,等. 芪茵顆粒急性毒性實驗研究[J]. 中醫(yī)學報, 2013, 3(8), 193-194.

[5]王曉忠, 曾斌芳. 芪茵茶治療210例脂肪肝的療效觀察[J]. 中國臨床醫(yī)藥研究雜志, 2004, 12(9):13706-13707.

[6]趙效國. 新編醫(yī)學動物實驗設計與方法[M]. 北京, 科學出版社, 2009:215-216.

[7]孫付軍, 黃偉克, 李曉晶, 等. 半夏白術天麻湯化裁方治療高脂血癥的實驗研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(7):158-160.

[8]Nannipieri M, Gonzales C, Baldi S, et al. Liver enzymes, the metabolic syndrome, and incident diabetes:the Mexico City diabetes study[J]. Diabetes Care, 2005, 28(7):1757-1762.

[9]張金穎, 曾斌芳. 芪茵顆粒治療酒精性脂肪肝的臨床療效分析[J]. 新疆中醫(yī)藥, 2008, 26(2):19-20.

[10]鄧國雄. 芪茵顆粒聯合三氧治療非酒精性脂肪肝炎的臨床療效觀察[J]. 當代醫(yī)學, 2014, 20(7):154-161.

[11]劉春燕, 王連成, 高玉琪,等. 肥胖婦女的血脂、血漿LPO及紅細胞LPO、SOD水平的研究[J]. 天津醫(yī)藥, 2007, 35(12):900-902.

[12]陳曉紅, 孫仁山, 程天民,等. C-反應蛋白對合并60Coγ射線放射損傷家兔創(chuàng)面的影響[J].基礎醫(yī)學與臨床, 2006, 26(6):575-578

[13]劉蓓, 王衛(wèi)疆, 張力. C-反應蛋白在生殖醫(yī)學中的研究進展[J]. 中國醫(yī)師進修雜志:綜合版, 2007, 30(4):71-73.

(本文編輯楊晨晨)

Studies on particles of Tiao Gan Juan Zhuo for the model of nonalcoholic fatty liver in rats

LIU Jing, LU Jun, LI Yaodong

(DepartmentofMedicine,AffiliatedTraditionalChineseMedicalHospital，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830000,China)

ObjectiveTo observe the influences of the regulation for liver on particles of Tiao Gan Juan Zhuo for the model of Hyperlipoidemia in rats. MethodsRats were given high fat diet for 6 weeks to construct model of hyperlipidemia, then the particles of Tiao Gan Juan Zhuo was given. During the drug administration, the level of ALT, AST, TC, TG, HDL, LDL, LPO, CRP were measured. ResultsCompared with normal control group, TC, TG, and LDL levels of model control group increased significantly, HDL levels reduced significantly, the difference was statistically significant (P<0.05); Compared with model control group, the dosage of drug intervention on TG levels had changed, the TC, HDL and LDL levels all had different degrees of improvement, with statistically significant (P<0.05); Compared with positive control group, TC, HDL and LDL levels were statistically significant in high dose group (P<0.05); TC level was only statistically significant compared between dosage group (P<0.05). ALT and AST levels were significantly elevated in model control group compared with normal control group, with statistically significant (P<0.05); Compared with model control group, medicine group was with lower levels of ALT and AST, with statistically significant (P<0.05). Comparison between dosage group, give the dose and liver meritorious service is negatively related to the level of biochemical indicators of ALT and AST level, with statistically significant (P<0.05); Compared with positive control group, the differences between groups were no statistical significance (P<0.05). Compared with the positive control group, CRP level between cloud particles Tiaogan Juan high-dose group was not statistically significant (P>0.05), the remaining dose group differences were statistically significant (P<0.05); LPO and CRP serum levels in high dose group and low dose group was statistically significant (P<0.05). ConclusionTheparticles of Tiao Gan Juan Zhuo shows clear improvement for hyperlipidemia and the protection of liver. Reducing the serum is the most significant effect. The levels of serum LPO and CRP can reduced by Particles of Tiao Gan Juan Zhuo.

Particles of Tiao Gan Juan Zhuo; fatty liver; LPO; CRP

新疆醫(yī)科大學科研創(chuàng)新基金(ZYY201433)

劉晶(1985-)，女，碩士，主管藥師，研究方向：中藥藥理研究。

黎耀東，男，碩士，主任藥師，研究方向：中藥復方制劑的新藥研發(fā)，E-mail：liyaodongno1@163.com。

R961.1

A

1009-5551(2016)06-0712-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.011

2015-03-29]