應用蛋白質組學方法分析新疆地方性砷中毒血漿中蛋白質的表達差異

謝惠芳， 吳順華， 張　杰， 馬　艷， 鄭玉建

(新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室， 烏魯木齊　830011)

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應用蛋白質組學方法分析新疆地方性砷中毒血漿中蛋白質的表達差異

謝惠芳， 吳順華， 張杰， 馬艷， 鄭玉建

(新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室， 烏魯木齊830011)

目的應用蛋白質組學方法分析比較新疆地方性砷中毒患者與正常對照血漿蛋白質的表達差異。方法將25例地方性砷中毒患者1∶1配比正常對照，采集分離血漿，經二維凝膠電泳分離和凝膠考馬斯亮蘭染色，質譜(MALD I-TOF-MS)分析，再經數據庫(NCBInr)檢索鑒定差異蛋白質斑點。結果正常對照組表達圖譜可檢測到113個蛋白點,地方性砷中毒病例組表達圖譜可檢測到165個蛋白點，與正常對照組相比，匹配率>65%。并且地方性砷中毒病例組鑒定出12個差異表達蛋白質,其中有5個表達上調，7個表達下調。這12個蛋白質均和免疫應答有關。與正常對照組相比，地方性砷中毒病例組的蛋白質表達存在著較大差異。結論地方性砷中毒的發(fā)生與免疫反應異常有關，12個蛋白質的表達可以作為地方性砷中毒診斷的潛在生物標志物。本研究為闡明地方性砷中毒的機制以及地方性砷中毒生物標志研究提供了一條新途徑。

砷中毒； 蛋白質組學； 質譜

由于新疆奎屯地區(qū)長期飲用含高砷的水，故出現飲水型地方性慢性砷中毒，該病不僅可以引起皮膚損傷，而且對機體多個重要臟器均有影響，并最終導致癌癥的發(fā)生[1]。國內外眾多學者對砷中毒的發(fā)病原因及其致病機制進行了大量研究，并且期望從中發(fā)現砷中毒的特異生物標志。Komissarova等[2]研究發(fā)現抗砷細胞中的γ-谷氨酰1(GGT1)高表達。由于砷環(huán)境暴露因素的復雜性、種族(屬)的代謝差異等，砷中毒的發(fā)病機制及其生物標志的研究仍在不斷的探索中。作為發(fā)揮基因功能的載體——蛋白質，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中有更直接而重要的意義。由于蛋白質組學可大規(guī)模、高通量地研究正常和病理情況下組織或細胞中蛋白質表達及翻譯后修飾的變化，篩選用于疾病診斷、治療及預后的蛋白質生物標志，從而成為醫(yī)學研究中的熱點。某一種細胞、組織或生物體的基因組所表達的全部蛋白質及其存在方式就是蛋白質組(proteome)[3-4]。通常同一基因組在不同的組織及不同的細胞中的表達情況各不相同；即使是同一種細胞在不同的發(fā)育階段、不同的生理條件下，該細胞的蛋白質表達水平與修飾狀態(tài)也不盡相同。Hegedus等[5]研究發(fā)現砷暴露時，β-防御素-1(HBD-1)蛋白多肽的分泌水平會降低，而通常認為HBD-1蛋白多肽降低與泌尿系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生有關，因而HBD-1多肽可以作為砷暴露的生物標志。Chowdhury等[6]發(fā)現，砷暴露后，倉鼠肝臟以及膀胱組織的3個蛋白質中有1個高表達，2個低表達。因而雙向凝膠電泳與質譜技術結合可以用于研究無機砷導致的腫瘤發(fā)病機制。

本研究通過利用2-DE分辨，并用電泳后的酶切及基質輔助的激光解吸附質譜以定位和分析地方性砷中毒患者與正常人血漿中蛋白質質譜變化，尋找地方性砷中毒患者血漿中的特異差異蛋白質，采用生物信息學方法建立可作為地方性砷中毒診斷標志的蛋白質質譜模型或生物標記，從分子水平研究地方性砷中毒蛋白質的組成及動態(tài)變化規(guī)律，從而深入認識個體的各種生理、病理過程，為地方性砷中毒的診斷、治療和預防尋求高效的生物標志物和新的方法。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器固相pH梯度干膠條(IPG gel strip)、PH3-10兩性電解質購自Bio-Rad公司，CHAPS、DTT、Iodoacetamide購自Sigma公司，尿素購自BBI公司，硫脲購自天津市化學試劑一廠，Proteo Extract Albumin Removal購自Calbiochem公司，乙腈(CAN)購自Fisher公司，三氟乙酸(TFA)購自DIMA公司，Trypsin Gold購自Promega公司，基質CHCA、碳酸氫銨購自Fluka公司，其他試劑為國產分析純。

1.2樣品收集及處理調查新疆奎屯慢性地方性砷中毒病區(qū)，當地水砷濃度為(177.78±215.20) μg/L，按照《地方性砷中毒診斷標準》(WS/T 211-2001)進行診斷。隨機抽取25例患者為地方性砷中毒病例組(Arsenism Patients,AP)。男性16例，女性9例，平均年齡(64.84±8.735)歲。在非慢性地方性砷中毒病區(qū)，當地水砷濃度為(29.61±52.48) μg/L，1∶1配比25例正常人為正常對照組(Control,C)。正常對照組選擇生活背景與上述慢性地方性砷中毒患者相同，正常對照組男性13例，女性12例，平均年齡(63.92±7.041)歲。兩組性別、年齡均衡，均為漢族。采集研究對象外周靜脈血5 mL，肝素抗凝，離心收集血漿(不能溶血)。將血漿按100 μL/管分裝置于-20℃冰箱保存。AP組(D)和正常對照組(C)各分為3個混合樣本。樣品用去高豐度蛋白柱去除高豐度蛋白，經過晾干沉淀，裂解回溶，bradford法測量濃度，-80℃ 保存。

1.3雙向凝膠電泳將pH3～10的17 cm IPG預制膠條，使用溶脹緩沖液泡脹膠條12 h。溶脹緩沖液成分為8M尿素，2M硫脲，0.5%CHAPS,0.52%兩性電解質，0.02%溴酚藍，1%DTT。充分泡脹后，將膠條取出放入聚焦槽內，加入礦物油至沒過上樣杯，上樣量為1 mg，并用溶脹buffer稀釋至170 μL。等電聚焦設置程序見表1。聚焦結束的膠條放入平衡緩沖液Ⅰ中，在搖床上水平振蕩15 min，再將膠條轉入平衡緩沖液Ⅱ中水平振蕩15 min(平衡緩沖液I：50 mM Tris-HCl 6.8，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2%DTT，0.02%溴酚藍；平衡緩沖液Ⅱ： 50 mM Tris-HCl 6.8，2% SDS，2.5%IAA，6M尿素，30%甘油，0.02% 溴酚藍)。平衡結束后，將IPG膠條從樣品水化盤中移出，放到已配好的12%SDS-PAGE凝膠上端，在凝膠的一端放置marker，0.5%的瓊脂糖封嚴膠條和marker，膠板固定于電泳槽內。往電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，于溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。輕撬兩層玻璃，取出凝膠，進行染色。該過程按Bio-Rad公司雙向電泳實驗流程進行操作,見表1。

表1　等電聚焦的參數和步驟

1.4考馬斯亮藍染色法凝膠放入裝有染色液的水平盤內，將水平盤置水平搖床上水平振蕩過夜。染色液含10%硫酸銨、10% 磷酸、0.12% G250、20% 甲醇。然后將凝膠浸于脫色液中，水平搖床振蕩。最后換成MQ再洗滌30 min。 脫色液為3%冰醋酸溶液。

1.5蛋白質膠內酶切將選取的差異蛋白質點在圖像上做好標記。將考馬斯亮藍染色的蛋白點膠條切成小塊，約1 mm3，在離心管中，水洗3次。用50%(v/v)ACN/25 mM碳酸氫銨(100 μL，pH 8.0)15 min脫色重復3次，至顏色脫盡。蒸餾水洗滌1次。將膠塊浸入30 μL 100%ACN中脫水5 min，膠塊變白后室溫抽干。用8 μL Trypsin酶液覆蓋膠塊， 30 min吸脹后，補充酶液適量，37℃過夜16～20 h?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行分析，獲得肽質量指紋圖譜。

1.6基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析用美國ABI公司4700型MALDI-TOF-TOF串聯二級質譜儀分析。0.3 μL的基質加0.3 μL 酶解后的樣品，點到樣品板上，室溫晾干。應用4000 Series software，將樣品板放入質譜儀。新建一個spotset，打開校正儀器的采集方法和處理模式，校正儀器。打開測試未知樣品的采集方法和處理模式，開始樣品分析。一級激光強度2100，二級激光強度2300，檢測分子量范圍700～4 000 u，線性反射模式進行質譜分析。

1.7肽質量指紋圖譜的分析和數據庫檢索利用MASCOT網站提供的檢索工具查詢，選擇MS或MS/MS，選擇NCBI nr(非冗余)數據庫。設定參數：肽片段分子質量容許誤差(Precursor tol.)為±0.1，二級質譜肽片段分子質量容許誤差(MS/MS Fragment tol.)為±0.3，酶解片段不完全位點1，固定修飾為脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl，C)，可變修飾為氧化(Oxidation，M)。MASCOT給出的>95%置信水平的蛋白質有統(tǒng)計學意義。

1.8凝膠掃描應用PDQuest軟件，選擇相對含量差異2倍以上的點作為差異點。

2　結果

2.1Bradford法檢測樣本蛋白定量結果濃度地方性砷中毒病例組和正常對照組樣本蛋白質濃度見表2。

2.2地方性砷中毒病例組與正常對照組蛋白質組的2-DE差異分析對血漿樣品進行雙向電泳分析，正常對照組和地方性砷中毒病例組的血漿樣品分別混合，消除個體差異性后，血漿樣品進行雙向電泳，雙向電泳重復3次。在各組中選取蛋白圖譜較好的幾張圖譜用GPS Explorer v3.5軟件分析。正常對照組血漿樣本檢出113個蛋白點，地方性砷中毒病例組血漿樣本檢出165個蛋白點。與正常對照組比較，地方性砷中毒病例組表達量上調，差異有統(tǒng)計學意義的蛋白點有5個，表達量下調的有7個。正常對照組與地方性砷中毒病例組的典型2-DE圖譜見圖1。

表2地方性砷中毒病例組和正常對照組樣本蛋白質濃度(μg/μL)

組別123地方性砷中毒病例組(D)7.107.687.07正常對照組(C)6.887.317.63

750 μg血漿樣本蛋白質提取物，在17 cm pH 3～10的IPG膠條上進行等電聚焦，反應條件為71 000 Vh，然后用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。考馬斯亮藍染色顯影。圖上數字和箭頭顯示了差異蛋白點。蛋白質的表達水平通過分析每個點的強度進行定量，基于凝膠有效點的總量進行標準化。

2.3差異蛋白質的MALDI-TOF-MSMS鑒定結果使用Pdquest7.3軟件對地方性砷中毒病例組與正常對照組血漿蛋白質雙向凝膠電泳圖譜進行分析并匹配，選定兩組血漿差異2倍以上的蛋白點，差異表達蛋白點通過膠內胰蛋白酶消化后，提取的胰蛋白酶多肽再用MALDI-TOF-MSMS質譜分析鑒定，得到蛋白質的肽質量指紋圖譜(PMF)后，與Mascot Peptide Mass Fingerprint數據庫匹配，成功鑒定出12個差異蛋白質(表3)。典型的地方性砷中毒病例的肽質量指紋質譜圖、Mascot得分及其在NCBI蛋白質數據庫中各個蛋白質的序列見圖2。

進行完數據庫檢索分析和鑒定：和正常對照組比較，地方性砷中毒病例組λ-本周蛋白(Bence-Jones)、IgA、α2-巨球蛋白亞型7高表達，鋅-a2-糖蛋白(Zinc-alpha-2-glyeoprotein)、鹽溶蛋白(sulfated glycoprotein-2)等低表達。

表3　地方性砷中毒病例組與正常對照組血漿差異表達的蛋白質鑒定結果

注: 上調：表達增加； 下調：表達降低。

(差異表達蛋白點通過膠內胰蛋白酶消化，其后提取的胰蛋白酶多肽由基質輔助激光解吸電離時間飛行質譜分析，產生肽質量指紋圖譜。如上圖中所示為地方性砷中毒病例的肽質量指紋圖譜蛋白點。)

圖2NIG51 λ-本周蛋白的MALDI-TOF 肽質量指紋圖譜(PMF)

3　討論

目前對地方性砷中毒發(fā)病機制的研究已經開展了很多，但其發(fā)生的確切機制仍然未知。已經完成的研究提示，砷中毒的發(fā)生機制似乎與多種作用途徑以及多種因素有關，如抑制DNA修復[7]、影響DNA結合和表達、氧化應激[8]等。由于蛋白質作為發(fā)揮基因功能的載體，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中有更直接而重要的意義。故近年來，蛋白組學技術在疾病的發(fā)生、發(fā)展研究中日益重要，廣泛用于篩選疾病標志物。本研究首次將蛋白質譜技術將用于飲水型地方性砷中毒的研究中，結果顯示正常對照組和地方性砷中毒病例組中篩選、鑒定出12個差異表達蛋白質。這些表達有差異的蛋白是從地方性砷中毒人群和正常對照人群血漿中比較分析而來，故可認為是地方性砷中毒的相關蛋白。

3.1地方性砷中毒與本周蛋白正常單克隆免疫球蛋白是由B細胞和漿細胞合成的，在每一個單克隆免疫球蛋白中，包含2條重鏈(γ,α, μ, δ, ε)以及2條輕鏈(κ or λ)[9-10]。而大量產生的游離輕鏈(FLC)往往被腎臟迅速清除。同時κ和λ蛋白的的結合狀態(tài)會影響其自身的清除，單體κ的過濾是二聚體λ的3倍。由此導致，即使κ的合成產量高于λ的2倍，但在正常血漿中λ仍然多于κ。血漿FLC的濃度往往隨著合成的增加而增加，但是也會因為腎功能衰竭造成的排出減少而增加[11]。傳統(tǒng)上，其被稱為本斯瓊斯蛋白質[12]。Len本周蛋白從屬于κ輕鏈的IV亞群[13]。本周蛋白作為癌癥檢測的第一個生物標志，比其他癌癥檢測的生物標志物提前了100多年[14]。1970年Glenner等[15]研究證實免疫球蛋白的輕鏈成分可以演變?yōu)榈矸蹣拥鞍?。目前的共識是：λ輕鏈蛋白與腎臟AL-淀粉樣變性病有關。特別是由于血漿FLC受腎功能影響較小，與尿液本周蛋白相比，能夠更準確地反映疾病變化。本研究發(fā)現本周蛋白λ輕鏈在砷中毒人群中表達，而在正常對照人群中不表達；Len本周蛋白在正常對照組中表達，地方性砷中毒病例組不表達。在兩組血漿樣品的采樣時間、保存條件、處理方法、實驗方法及條件完全相同情況下，顯示出來的這種結果差異可能和κ輕鏈在體內的清除速率是λ輕鏈清除速率的3倍有關，在采樣時地方性砷中毒人群體內血漿中的κ輕鏈經過腎臟代謝，含量很低，尤其在進行2-DE分析時，經過自然的半衰減，已經無法檢測到κ輕鏈，只能檢測出體內含量高于κ輕鏈的λ輕鏈。另外有研究指出，當體內κ輕鏈檢測不出來時，可能與κ輕鏈發(fā)生聚合反應有關[16]。本研究結果可能符合該現象。另外在本研究中的地方性砷中毒人群體內血漿組織中λ輕鏈表達陽性，提示砷中毒會刺激機體產生相應的免疫應答，對腎臟產生毒性作用，λ本周蛋白是砷中毒的相關蛋白。

3.2地方性砷中毒與α2-巨球蛋白亞型7(alpha-2-macroglobulin isoform 7)α2-巨球蛋白(α2M)主要分布在血漿中，是一類大分子蛋白酶抑制劑，該四聚體蛋白是由成對的二硫橋將4個相同的180 ku的亞單位連接形成。在每個亞單位中都含有誘捕區(qū)域，可被多種蛋白酶識別和切割。此外，它還包含1個活化的內在的β半胱胺酰-γ-谷氨酰硫酯位點。目前認為多種疾病的發(fā)生、進展與α2M有關，上海地區(qū)漢族人群α2M基因多態(tài)性與阿爾茨海默病明確相關[17]。α2M也可以作為腦中炎性反應的一種急性蛋白。血腦屏障損傷且通透性增高時，α2M隨之大量增加出現在CSF中。故此CSF中α2M的多少可以反映中樞神經系統(tǒng)感染受損的程度[18]。本研究發(fā)現α2M蛋白在砷中毒人群中高表達，而在正常對照人群中α2M蛋白低表達。α2M蛋白表達異常增加，提示砷中毒時存在免疫反應的異常，α2M蛋白可能作為地方性砷中毒時的相關蛋白，但是α2M增加的具體機制及效應有待進一步研究。

3.3地方性砷中毒與ZAGZAG作為一種可溶性糖蛋白，最早從人的質膜中分離，鋅存在的情況下ZAG會發(fā)生沉淀，因而認為該蛋白與人體免疫有關。而糖基化是蛋白質常見的翻譯后修飾方式，在細胞相互作用、細胞黏附、配體與受體的相互識別過程中發(fā)揮作用[19]。糖基化異常往往與疾病發(fā)生有關，以此作為診斷的標志物[20]。研究顯示ZAG蛋白在人體中有多項功能，例如脂質移動以及受精，通過研究確定了該蛋白的結構和功能[21-23]。雖然它的一些功能仍然未被確定，但是已明確糖皮質激素類可以調節(jié)ZAG的表達。ZAG在結構上有一個大凹槽，和I型組織相容性抗原(MHC)肽段結合凹槽相似，在結構上進一步證實ZAG的表達可能關聯免疫應答。本研究顯示ZAG蛋白在地方性砷中毒人群中的表達低于正常對照人群，提示砷會抑制ZAG蛋白表達，從而對ZAG蛋白產生的生物功能產生抑制效應，如抑制免疫應答反應、機體產生炎癥等。還有研究認為ZAG是一種衰老表型的修飾劑，對黑色素生成起到調節(jié)作用，對腫瘤增生起到阻礙作用，參與腎臟產物的轉運[24]。本研究發(fā)現ZAG蛋白在砷中毒人群中低表達，可能與地方性砷中毒的典型皮膚色素異常(色素沉著、色素脫失)表現有關，低表達的ZAG蛋白可能對黑色素生成的調節(jié)功能下降。

3.4地方性砷中毒與鹽溶蛋白(sulfated glycoprotein-2)鹽溶蛋白又稱叢生蛋白(clusterin)，是一種糖蛋白，是異源性二聚體由二硫鍵連接形成，分子量70 ku。鹽溶蛋白來自哺乳動物組織。鹽溶蛋白在組織重建、生殖、DNA修復、補體調節(jié)、脂質轉運、凋亡以及細胞內的信號轉導等過程中發(fā)揮作用。目前已經確認鹽溶蛋白屬于分泌蛋白質，并證實該蛋白具有多種活性。該蛋白質的功能包括參與炎癥和免疫過程的作用和機制，尤其是自身免疫。神經變性疾病及腦膜疾病患者體內鹽溶蛋白表達不增加，而在脫髓鞘疾病患者體內鹽溶蛋白表達增加，該蛋白的表達上調可能與多發(fā)性硬化存在可能的神經保護機制有關[25]。Jenne等[26]研究提示，對于雄性生殖系統(tǒng)鹽溶蛋白具有保護精子細胞以及上皮組織的作用，使其免受補體攻擊。本研究發(fā)現相比正常對照人群，鹽溶蛋白在砷中毒人群中低表達，提示地方性砷中毒患者發(fā)生了神經系統(tǒng)的病變，可以認為是神經系統(tǒng)發(fā)生病變的直接反應；也提示砷中毒對男性生殖功能會產生不良影響。因此鹽溶蛋白也可以作為地方性砷中毒的一類相關蛋白。本研究中鑒定出的另外一個表達下調差異蛋白Gi52202 Complement cytolysis inhibitor precursor為鹽溶蛋白前體物質，進一步說明了鹽溶蛋白可以作為地方性砷中毒的生物標志物。

3.5地方性砷中毒與其他蛋白(sulfated glycoprotein-2)在本研究中獲得的其他幾種蛋白質Gi22767 Ig A L、73331 Ig A1 Bur、28674 Ig lambda chain、23145 immunoglobulin kappa light chai VLJ region、Gi103308 inter-alpha (globulin) inhibitor H4間-α(球蛋白)抑制劑H4以及Gi2146957 Ig heavy chain V region precursor都屬于免疫球蛋白家族，它們的異常表達，顯示地方性砷中毒存在免疫應答的異常反應，地方性砷中毒患者體內存在炎癥反應。

本實驗運用2-DE電泳結合MALDI-TOF-MS/MS質譜技術成功鑒定出12個有意義的差異蛋白，這些蛋白可能成為診斷鑒別地方性砷中毒的生物標記，為進一步研究地方性砷中毒的發(fā)病機理提供了有意義的線索。然而，地方性砷中毒從生理生化水平、細胞水平、分子水平上來看，涉及諸多因素。弄清這12個有意義的差異蛋白的功能和在地方性砷中毒發(fā)展過程中的作用，則需要進一步分離相關基因和進行功能鑒定，研究確證有關這些蛋白的基因在地方性砷中毒中的作用，以此來揭示地方性砷中毒分子機制。

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(本文編輯張巧蓮)

Proteomics analysis of differentially expressed proteins of plasma in Xinjiang endemic arsenism

XIE Huifang, WU Shunhua, ZHANG Jie, MA Yan, ZHENG Yujian

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveApplied proteomics to analysis the differential expression proteins of plasma in Xinjiang endemic Arsenism and normal control. Methods25 cases Xinjiang endemic arsenism 1∶1 matched with normal control. Collected and separated plasma, Performed two-dimensional gel electrophoresis and Coomassie blue stained, MALDI-TOF-MS proteomic analyses of plasma, using the database (NCBI nr) to identify differential protein spots. ResultsBy the analyses of match differentially displayed map, 113 protein spots were detected in proteome map of Normal control, 165 protein spots were detected in proteome map of endemic arsenism, compared with normal control, the matching rate >65%. 12 prominent (5 up-regulated and 7 down-regulated) proteins were identified in endemic arsenism, These identified proteins were all related with Immunity. Compared with normal control, the protein expression of endemic arsenism was Significant different. ConclusionOccurrence of Endemic Arsenism may be related to abnormalities immune response, those 12 proteins could be biomaker of endemic arsenism and might be applied to diagnosis, treatment and prevention of endemic arsenism in the future.

arsenism； proteomics； mass spectrum

國家自然科學基金(81260410)

謝惠芳(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：環(huán)境與健康研究。

鄭玉建，男，博士，教授，博士生導師,研究方向：環(huán)境與健康，E-mail：zhyujian6@hotmail.com。

R21； Q7

A

1009-5551(2016)06-0672-06

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.003

2016-03-12]