血管內(nèi)皮生長因子及其受體在伴惡性胸腔積液非小細胞肺癌組織中的表達

王　園，田　野，劉思洋，趙希彤，姜文軍，田大力

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸心外科，沈陽110032）

血管內(nèi)皮生長因子及其受體在伴惡性胸腔積液非小細胞肺癌組織中的表達

王園，田野，劉思洋，趙希彤，姜文軍，田大力

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸心外科，沈陽110032）

目的測定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管內(nèi)皮細胞生長因子受體（VEGFR）在非小細胞肺癌伴惡性胸腔積液中表達情況，分析VEGF和VEGFR與惡性胸腔積液的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測12例伴有惡性胸腔積液的胸膜轉(zhuǎn)移癌組織和18例不伴有胸腔積液的癌組織中VEGF和VEGFR的表達情況，分析和探討VEGF和VEGFR與惡性胸腔積液的關(guān)系。結(jié)果惡性胸腔積液組中VEGF和VEGFR的表達明顯高于不伴惡性胸腔積液組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論非小細胞肺癌惡性胸腔積液與VEGF和VEGFR的高表達密切相關(guān)。

血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮細胞生長因子受體；非小細胞肺癌；惡性胸腔積液

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惡性胸腔積液是晚期肺癌最主要的并發(fā)癥之一，尤其是轉(zhuǎn)移性腺癌，據(jù)報道［1］約15%的肺癌患者在確診時已有胸腔積液，50%的肺癌患者在病程中會出現(xiàn)胸腔積液，而惡性胸腔積液（malignant pleural effusion，MPE）往往預(yù)示著較差的預(yù)后和較短的生存期。

關(guān)于MPE的形成原因至今仍在研究中，最新的研究［2］顯示血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是在MPE發(fā)病機制中起重要作用的細胞因子。VEGF與血管內(nèi)皮上的血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）結(jié)合后，通過一系列信號傳導(dǎo)機制導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞分裂增殖，同時增加血管通透性，有效激活血管生成和提高毛細血管通透性，使血漿蛋白外滲，為胸腔積液的形成提供合適的微環(huán)境，誘發(fā)MPE形成［3］。另一方面，VEGF在肺癌的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，VEGF的表達與肺癌的淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，VEGF表達陽性者，淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移明顯增多［4］。結(jié)合前期查閱文獻，發(fā)現(xiàn)MPE的發(fā)生與VEGF通路的表達可能存在著相關(guān)性。為了探討VEGF和VEGFR與MPE生物學(xué)行為之間的關(guān)系，本研究檢測Ⅳ期非小細胞肺癌合并MPE患者的胸膜組織內(nèi)VEGF和VEGFR的表達情況，旨在找出VEGF和VEGFR與MPE的聯(lián)系，從而進一步分析MPE的形成機制，為治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1研究對象

本研究共收集2013年1月至2014年7月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院住院的Ⅳ期非小細胞肺癌患者30例。其中伴胸腔積液患者12例（MPE組），不伴胸腔積液患者18例（對照組，即非MPE組）；男14例，女16例，中位年齡63（42～84）歲，有吸煙史11例，無吸煙史19例，全部病例均經(jīng)病理證實為非小細胞肺癌，簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集：MPE組12例均經(jīng)胸腔鏡取胸膜轉(zhuǎn)移癌組織，病理證實均為腺癌，非MPE組均經(jīng)皮肺穿刺取癌組織，其中16例為腺癌，2例為非小細胞肺癌，所取標(biāo)本均按照免疫組化染色要求進行固定，包埋，脫水，切片作免疫組化備用。

1.2.2免疫組織化學(xué)SP法：所得標(biāo)本進行石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；0.3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10～30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；采用微波（30 min內(nèi)4次，中火）、高壓、酶修復(fù)方法進行抗原修復(fù)；自然冷卻；血清封閉，室溫15～30 min，與二抗來源一致。傾去，勿洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2～3 h。PBS沖洗，3 min×5次；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30 min～1 h；PBS沖洗，3 min×5次；滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫或37℃孵育30 min～1 h。PBS沖洗，3 min×5次；顯色劑顯色（DAB等）；充分沖洗；中性樹脂封固。

1.2.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性染色超過10%時判斷為VEGF和VEGFR陽性［6］。陽性范圍在10%～＜50%者為VEGF和VEGFR低表達，50%～100%者為VEGF和VEGFR高表達。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件包對所得數(shù)據(jù)進行Fisher確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1VEGF和VEGFR的表達情況

VEGF主要表達于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中，陽性染色位于細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀，背景清晰；VEGFR則主要表達于腫瘤細胞的細胞膜上，陽性染色位于細胞膜上，呈棕黃色顆粒狀，背景清晰（圖1A），MPE組高表達（圖1B），非MPE組陰性表達（圖1C），非MPE組低度表達（圖1D）。

圖1　免疫組化SP檢測VEGF和VEGFR在胸膜轉(zhuǎn)移癌組織及肺癌組織中的表達情況×200Fig.1 Immunohistochemical SP detection of VEGF and VEGFR expression in pleural and lung tumors tissues×200

在MPE組中，VEGF陽性表達率為83.33%，其中高表達率為58.33%；而非MPE組中VEGF的表達率為33.33%，高表達率僅為11.11%（表1）。另一方面，在MPE組中VEGFR陽性表達率為75.00%，高表達率為58.33%，而非MPE組VEGFR表達率27.78%，高表達率為11.11%（表2）。肺癌伴MPE組VEGF和VEGFR的陽性表達率以及高表達率均明顯高于肺癌不伴MPE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2VEGF和VEGFR的表達與臨床病理因素之間的關(guān)系

表1　VEGF在MPE組及非MPE組的表達情況Tab.1 Expression of VEGF in MPE group and non-MPE group

表2　VEGFR在MPE組及非MPE組的表達情況Tab.2 Expression of VEGFR in MPE group and non-MPE group

比較VEGF和VEGFR的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)30例Ⅳ期患者中，女性VEGF和VEGFR陽性表達率均高于男性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；VEGF和VEGFR陽性表達率與年齡、有無吸煙史等臨床病理參數(shù)均無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3　VEGF和VEGFR的表達與臨床病理因素的關(guān)系Tab.3 The relationship between the expressions of VEGF and VEGFR and clinical pathological characteristics

3　討論

VEGF最早是1989年從培養(yǎng)的牛垂體濾泡星狀細胞中分離出的一種多肽，是血小板源生長因子超家族的一員，目前主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子。VEGF的生物活性是通過與其受體VEGFR結(jié)合后發(fā)揮的，目前發(fā)現(xiàn)的受體VEGFR有5種：VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR）、VEGFR-3（Flt-4）、NP-1和 NP-2，其中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3均是受體酪氨酸蛋白激酶，前兩者主要在血管內(nèi)皮細胞上表達，后者主要存在于淋巴管內(nèi)皮細胞；而NP-1和NP-2為非酪氨酸蛋白激酶跨膜受體，含有長的胞外段和短的胞內(nèi)段，不僅在內(nèi)皮細胞表達，在某些腫瘤細胞內(nèi)也有表達。VEGF家族是一種高度特異的血管內(nèi)皮有絲分裂原，通過與VEGFR結(jié)合，引起一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，釋放多種細胞因子，刺激血管（淋巴管）內(nèi)皮細胞增殖和遷移［7］，促進新生血管及淋巴管生成，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

MPE亦稱腫瘤性胸腔積液，大多數(shù)病例可以在胸腔積液中找到惡性細胞。如果胸腔積液伴縱隔或胸膜表面轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，無論在胸腔積液中能否找到惡性細胞，均可以診斷惡性胸腔積液。在引起胸腔積液的惡性腫瘤中，較常見的為肺癌、乳腺癌、淋巴癌，其中以肺癌居多。正常人體壁層胸膜的間皮細胞間有很多2～12 nm的小孔，該孔隙直接與淋巴網(wǎng)相通。正常情況下，成人胸膜腔24 h能產(chǎn)生100～200 mL胸液，由壁層胸膜濾出，再經(jīng)壁層胸膜的小孔重吸收，而臟層胸膜對胸液的形成和重吸收作用很小。胸腔內(nèi)液體不斷產(chǎn)生，不斷被重吸收，保持動態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡被打破時，就可引起胸腔積液。MPE產(chǎn)生的機制復(fù)雜多樣，包括惡性腫瘤侵襲臟層和壁層胸膜或伴隨的炎癥使毛細血管通透性增加，液體滲入胸膜腔；轉(zhuǎn)移至壁層或臟層的腫瘤細胞阻塞壁層、臟層胸膜血管及淋巴管，使正常的胸液循環(huán)被打破；腫瘤轉(zhuǎn)移至縱膈淋巴結(jié)引起胸腔積液的吸收減少等［8］。

VEGF和VEGFR具有增加血管通透性，有效激活血管生成和提高毛細血管通透性的作用，推測VEGF和VEGFR是參與MPE形成的分子機制，在MPE的形成中起著重要作用?；谝陨显?，本研究檢測胸膜轉(zhuǎn)移癌組織中VEGF和VEGFR的表達情況，與未發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移的癌組織進行對比，有效地模仿了腫瘤的惡性行為。本研究中胸膜轉(zhuǎn)移癌組織的VEGF和VEGFR陽性表達率及陽性程度明顯高于未發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移的癌組織，提示VEGF和VEGFR與肺癌MPE密切相關(guān)，在肺癌MPE的形成中起重要作用，這與文獻［9-10］報道相符。

近年來以VEGF和VEGFR為靶點的抗腫瘤新生血管藥物備受關(guān)注，為晚期腫瘤患者和體力狀態(tài)評分低不能耐受化療的患者提供了新的治療途徑。研究［11］表明在體外血管生成模型上，VEGF與其相應(yīng)的受體結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞增殖和新生血管形成，達到阻斷VEGF生物功能的作用。同樣，VEGFR作為VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，主要作用是介導(dǎo)VEGF的血管內(nèi)皮細胞增生，趨化內(nèi)皮細胞和增加血管通透性等。針對以VEGFR為靶點的血管生成抑制劑已有報道，部分藥物（如厄洛替尼）已應(yīng)用于臨床。結(jié)合本研究結(jié)果，VEGF和VEGFR在惡性胸腔積液中高表達，兩者與MPE的形成密切相關(guān)。這提示抗腫瘤新生血管藥物可通過阻斷VEGF和VEGFR的生物功能達到控制MPE生成的效果。目前關(guān)于MPE的治療主要包括穿刺放液和腔內(nèi)置管閉式引流、藥物治療和外科治療。其中藥物治療是MPE最主要的方法，但效果有限。而關(guān)于抗腫瘤新生血管藥物治療MPE的報道也較少，隨著對VEGF和VEGFR與肺癌伴MPE關(guān)系的深入研究，以VEGF和VEGFR為靶點的抗腫瘤新生血管藥物將會為晚期肺癌伴胸腔積液患者提供新的治療途徑、帶來新曙光。

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（編輯于溪）

VEGF and VEGFR Expressions in Non-small Cell Lung Cancer with Malignant pleural Effusion

WANG Yuan，TIAN Ye，LIU Siyang，ZHAO Xitong，JIANG Wenjun，TIAN Dali
（Department of Thoracic Surgery，the Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

Objective To investigate the expression of VEGF and VEGFR in non-small cell lung cancer patients with malignant pleural effusion，and analyze the relationship between VEGF and VEGFR and malignant pleural effusion.Methods The VEGF and VEGFR expression were detected using immunohistochemistry in pleural and lung tumors tissues of 30 Ⅳ stage non-small cell lung cancer patients，and the relationship between VEGF and VEGFR expression and malignant pleural effusion was analyzed.Results The expression of VEGF and VEGFR in pleural tissue of patients with malignant pleural effusion was significantly higher than those without malignant pleural effusion（P＜0.05）.Conclusion There is a very close correlation between high expression of VEGF and VEGFR and formation of malignant pleural effusion.

vascular endothelial growth factor；vascular endothelial growth factor receptor；non-small cell lung cancer；malignant pleural effusion

R743.2

A

0258-4646（2016）05-0441-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.015

沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃（F13-316-1-07）

王園（1989-），男，碩士研究生.

姜文軍，E-mail：Cmu4hjwj@126.com

2015-07-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：