青蒿琥酯干預(yù)大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎中Foxp3的表達*

洪學(xué)志，劉　佳，莊辰晨，林　東，朱夢雅，莫漢有

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣西桂林 541001)

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·論著·

青蒿琥酯干預(yù)大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎中Foxp3的表達*

洪學(xué)志，劉佳，莊辰晨，林東，朱夢雅，莫漢有△

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣西桂林 541001)

目的研究青蒿琥酯干預(yù)下表達Foxp3的調(diào)節(jié)性T細胞在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)脾淋巴細胞及滑膜中表達及意義。方法建立大鼠CIA模型，分為對照組、CIA模型組、CIA模型+不同濃度青蒿琥酯組、CIA模型+甲氨蝶呤(MTX)組、CIA模型+硫酸羥氯喹組、CIA模型+甲基潑尼松龍組。流式檢測脾淋巴細胞中Foxp3表達，免疫組化檢測Foxp3在大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞中表達。結(jié)果CIA模型+20 mg·kg-1·d-1青蒿琥酯組中Foxp3在脾淋巴細胞及滑膜組織中的表達明顯高于其他濃度青蒿琥酯組、CIA模型+硫酸羥氯喹組(P<0.05)，與CIA模型+甲基潑尼松龍組在脾淋巴細胞表達中有差異(P<0.05)，與CIA模型+甲氨蝶呤組無差異(P>0.05)。結(jié)論青蒿琥酯可上調(diào)T淋巴細胞及滑膜中Foxp3的表達，且與劑量呈正相關(guān)，當(dāng)劑量在20 mg·kg-1·d-1時效果最明顯。

關(guān)節(jié)炎，實驗性；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；Foxp3;青蒿琥酯

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、對稱性、持續(xù)性致殘率極高的一種全身反應(yīng)性自身免疫性疾病,其病變特點是血管翳形成、自身抗體產(chǎn)生以及骨與軟骨的損傷，常伴有心血管、肺、心理等系統(tǒng)性癥狀[1]。在骨侵蝕破壞過程中新生血管形成與細胞外基質(zhì)降解是其兩個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。目前臨床中以中和炎性因子及減少炎性因子的釋放取得了很好的療效。CD4+調(diào)節(jié)性T細胞在抑制自身抗原應(yīng)答以及維持免疫平衡和免疫耐受方面起到關(guān)鍵的作用[2]。在動物模型與人類中，調(diào)節(jié)性T細胞的突變與缺失都會引起自身免疫性疾病的發(fā)生，證實調(diào)節(jié)性T細胞在維持外周免疫耐受以及保持免疫平衡中起到重要作用。Foxp3是CD4+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的特異性標(biāo)志[3]，在調(diào)控CD4+調(diào)節(jié)T細胞的發(fā)育、表達及功能中發(fā)揮了決定性作用[4-5]。目前大量試驗證實青蒿琥酯為一種低毒、高效的潛在免疫抑制劑[6]，先前研究表明，青蒿琥酯不僅能通過對NF-κB通路的調(diào)節(jié)抑制脂多糖(LPS)對滑膜細胞的刺激，減少腫瘤壞死因子(TNF)-α的釋放[7-8]，還可抑制白細胞介素(IL)-17、TNF-α的分泌，最終兩者的協(xié)同作用使滑膜細胞分泌炎癥因子減少，從而減少血管翳的形成及骨與軟骨的侵蝕[9-10]。本課題擬從T淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子角度探討青蒿琥酯是否通過上調(diào)翼狀螺旋/叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)而起免疫調(diào)節(jié)作用；明確青蒿琥酯確切治療靶位，為以后臨床實際中應(yīng)用青蒿琥酯治療RA提供堅實的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠，雄性，70只，體質(zhì)量100 g左右，鼠齡4周。桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2主要試劑天然牛Ⅱ型膠原：Chondrex公司(美國)，每瓶5 mL；弗氏完全佐劑(complete Freund`s adjuvant，IFA)：Sigma公司(美國)，每瓶10 mL；淋巴細胞激活劑，含高爾基體阻斷劑(BD):BD Pharmingen公司(美國)；抗大鼠Foxp3抗體(PE),抗大鼠CD4抗體(APC),大鼠IgG2a 同型對照(PE),Foxp3轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液:eBioscience(美國);青蒿琥酯 桂林南藥股份有限公司；甲氨蝶呤 (methotrexate，MTX) ，每片2.5 mg，上海信誼制藥廠；甲基潑尼松龍 (Prednisone，Pred) ，每支20 mg，湖北遠成藥業(yè)有限公司；硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)，每片0.1 g，上海中西制藥有限公司。Anti-Foxp3 抗體(Abcom公司，美國)。

1.3方法

1.3.1CIA動物模型的制備實驗前在冰上將牛Ⅱ型膠原緩慢滴加至等體積的弗氏完全佐劑(CFA)中并用注射器充分乳化，使得膠原終濃度為1 mg/mL。將制備好的膠原和佐劑混合物置于冰上保存?zhèn)溆?。初次免疫：戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)麻醉大鼠，并將尾根部鼠毛用手術(shù)刀刮除，CIA模型組大鼠給予0.2 mL的膠原乳化液尾根部皮內(nèi)注射，對照組健康大鼠尾根部給予等量的生理鹽水皮內(nèi)注射；加強免疫：于第7天給予模型組對側(cè)尾根部加強免疫0.1 mL的乳化液，對照組給予對側(cè)尾根部等量的生理鹽水。最終采用AI評分[11]6分以上的動物模型來進行實驗，有56只造模成功。

1.3.2實驗分組將關(guān)節(jié)炎評分達到6分以上的CIA模型大鼠隨機分為7組(每組8只)并與健康對照大鼠(9只)共分為8組，分別給予不同的藥物觀察。具體如下：健康大鼠對照組(A組)；CIA模型對照組(B組)；CIA模型+青蒿琥酯(5 mg·kg-1·d-1)為C組；CIA模型+青蒿琥酯(10 mg·kg-1·d-1) 為D組； CIA模型+青蒿琥酯(20 mg·kg-1·d-1) 為E組；CIA模型+硫酸羥氯喹(40 mg·kg-1·d-1)為F組；CIA模型+甲氨蝶呤(每周2.7 mg/kg) 為G組；CIA模型+甲基潑尼松龍 (5 mg·kg-1·d-1) 為H組。

根據(jù)先前的研究[12]，設(shè)初次免疫為第0天,灌胃給藥開始于初次免疫后第14天,灌胃過程持續(xù)18周，到大鼠全部處死歷時20周，3周為1個療程。青蒿琥酯、甲氨蝶呤、硫酸羥氯喹、甲基潑尼松龍采用灌胃給藥法，A、B組分別予等量蒸餾水灌胃及等量生理鹽水注射。

1.3.3流式細胞術(shù)具體步驟取2管細胞，分別加入0.5 μL淋巴細胞激活劑?；靹蚝螅?7 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。加入1 mL流式緩沖液(FACS buffer),離心1 500 r/min，5 min，棄上清液。細胞表面染色： 將細胞用200 μL FACS buffer進行重懸，重懸后于各染色管中加入CD4-APC表面染色試劑5 μL，混勻后于室溫暗處孵育30 min。固定與破膜：分別加入1 mL Foxp3/Transcription Factor，在4 ℃暗處條件下孵育40 min。細胞內(nèi)染色：每管加入100 μL破膜劑buffer，而后在胞內(nèi)染色管中分別加入5 μL大鼠IgG2a 同型對照(PE)和5 μL Foxp3-PE熒光抗體，充分混勻后于4 ℃暗處孵育30 min。取出后加入1 mL破膜劑buffer，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；將細胞重懸于200 μL FACS buffer中，上機分析。流式細胞術(shù)結(jié)果分析：用CD4設(shè)門，選定CD4+T淋巴細胞；繪制散點圖，在此基礎(chǔ)上確定CD4+foxp3+調(diào)節(jié)T細胞百分比。然后利用上訴的統(tǒng)計方法進行分析。

1.3.4免疫組化檢測步驟踝關(guān)節(jié)取材：腹腔注射適量的水合氯醛，然后采用脫頸椎脫臼法處死大鼠，截取右下肢，切除脂肪等軟組織后，切取后肢脛骨下端、腓骨下端并分離踝關(guān)節(jié)，用PBS沖洗后浸泡于PBS中。留取踝關(guān)節(jié)常規(guī)脫鈣、石蠟包埋。按照試劑說明書步驟檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Foxp3水平。

2　結(jié)　果

2.1CIA大鼠的臨床表現(xiàn)本研究采用尾根部皮內(nèi)注射的方法免疫大鼠，初次免疫后9～21 d，有56只造模成功(56/61)。初次免疫9 d后開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥，表現(xiàn)為足小趾或踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫(圖1)，部分大鼠后腿不能爬行或出現(xiàn)肘關(guān)節(jié)紅腫。在免疫后第42天左右CIA模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)達到高峰以后逐漸轉(zhuǎn)為慢性期。初次免疫后第10周，C組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在9.0分左右，D組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在7.0分左右，E組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在5.0分左右，H關(guān)節(jié)炎指數(shù)在3.0分左右，G組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在5.0分左右,F組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在7.5分左右,B組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在10.5分左右。初次免疫后第21周，C組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在7.0分左右，D組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在5.0分左右，E組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在3.0分左右，H組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在3.0分左右，G組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在5.0分左右,F組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在7.5分左右,B組關(guān)節(jié)炎指數(shù)在11.0～14.0分左右，由此可見E組在改善關(guān)節(jié)癥狀方面療效顯著。

A:A組大鼠;B:B組大鼠。

圖1大鼠踝關(guān)節(jié)的比較

2.2脾淋巴細胞表達Foxp3 流式細胞學(xué)檢測A～H組Foxp3表達百分比(%)分別為1.171±0.191、0.529±0.138、0.729±0.095、2.342±0.217、3.471±0.123、2.371±0.162、3.771±0.109、4.014±0.271。與A組比較，F(xiàn)oxp3在B組中表達降低(P<0.05);在C、D、E各組比較中發(fā)現(xiàn)Foxp3表達呈劑量依賴性增長，E組中Foxp3表達最高，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中D組與F組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但E組與F組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G組與E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；H組中Foxp3表達量最高，與E組、G組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細胞學(xué)檢測CD4 T淋巴細胞中 Foxp3 的表達見圖2。

2.3免疫組織化學(xué)法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-17/Foxp3的表達免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3除了表達于滑膜細胞層及血管周圍外，在軟骨表面也有表達，其主要定位于細胞核及胞漿中，為棕褐色顆粒。A～H組Foxp3值分別為：0.048 7±0.008 6、0.018 4±0.004 3、0.037 9±0.009 6、0.043 4±0.004 2、 0.061 7±0.007 2、0.034 3 ±0.008 4、0.054 3±0.008 2、0.065 9±0.008 2，方差分析顯示B組Foxp3表達明顯低于其他組(P<0.05)，E組Foxp3表達與G組、C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜Foxp3免疫組化染色見圖3。

A:Foxp3同型對照;B:A組;C:B組;D:C組;E:D組;F:E組;G:F組；H:G組；I:H組。

圖2流式細胞學(xué)檢測CD4 T淋巴細胞中 Foxp3 的表達

A:A組； B:B組； C:C組； D:D組； E:E組； F:F組； G:G組； H:H組。

圖3各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜Foxp3免疫組化染色(×200)

3　討　論

RA是以小關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)可以累及全身的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA的病因、發(fā)病機制尚未明確闡明，目前CIA模型是研究RA常用的最經(jīng)典動物模型[13]。青蒿素及其衍生物被臨床認(rèn)為是治療惡性和氯喹抵抗的瘧疾最有效和安全的藥物。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物。最近研究提示,青蒿素及其衍生物可能還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯除調(diào)節(jié)NF-κB 信號途徑抑制LPS 誘導(dǎo)的RA 滑膜細胞分泌TNF-α外，其尚可下調(diào)IL-17的活性而發(fā)揮作用[14]。本文擬從T淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子角度探討其是否通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3的表達進而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

本文采用體外培養(yǎng)不同藥物干預(yù)的CIA大鼠滑膜細胞及體內(nèi)CD4 T淋巴細胞研究發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯能明顯抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的增生，并且呈劑量依賴性。經(jīng)過青蒿琥酯的干預(yù)，無論是5、10、20 mg·kg-1·d-1均可上調(diào)大鼠滑膜細胞蛋白及大鼠體內(nèi)T淋巴細胞對Foxp3的表達。其中以20 mg·kg-1·d-1最為顯著，且優(yōu)于傳統(tǒng)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎用藥羥氯喹，但與甲氨蝶呤作用相當(dāng)，略低于甲潑尼龍組。結(jié)合以往實驗予大鼠體外胃飼青蒿琥酯可明顯減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹及前期發(fā)現(xiàn)其可抑制IL-17、TNF-α、MMP3等。本研究認(rèn)為青蒿琥酯在控制及緩解CIA大鼠的癥狀有明顯作用，其抑制IL-17、TNF-α、MMP3及炎性因子的主要機制可能是通過上調(diào)Foxp3的基因及蛋白表達，從而達到抑制炎性因子、治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的目的[15]。

本研究揭示了青蒿琥酯通過調(diào)控T淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路，誘導(dǎo)CD4+T細胞高表達Foxp3，進而調(diào)控CD4+Foxp3+Tregs細胞的生長、分化與繁殖，調(diào)控身體多個生物學(xué)過程以及對機體的免疫功能進行調(diào)節(jié)。本研究分析了青蒿琥酯可能的治療靶點，為青蒿琥酯在干預(yù)人滑膜細胞提供試驗基礎(chǔ)并為其用于RA臨床治療的深入研究提供理論依據(jù)[16]。

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Expression of Foxp3 in rat collagen-induced arthritis through artesunate intervention*

HongXuezhi,LiuJia,ZhuangChenchen,LinDong,ZhuMengya,MoHanyou△

(DepartmentofRheumatology,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of regulatory T cells expressing Foxp3 in rat synovial cells and T lymphocytes of collagen-induced arthritis(CIA) through artesunate intervention and their significance.MethodsThe CIA model in SD rats was established and divided into the control group,CIA model group,CIA and different concentrations of artesunate groups,CIA and methotrexate(MTX)group,CIA and hydroxychloroquine (HCQ) group,CIA and methylprednisolone(MP) group.The lymphocytes were extracted from spleen.The expression of Foxp3 in different groups of CIA rats were detected by flow cytometry (FCM).The immunohistochemical method was used to detect Foxp3 expression in rats ankle synovial cells.ResultsFoxp3 expression in spleen lymphocyte and synovial tissue in CIA and 20 mg·kg-1·d-1artesunate group was obviously higher than that in other artesunate groups,CIA and hydroxychloroquine group(P<0.05),but the expression of Foxp3 in the CIA and spleen lymphocytes had statistical difference compared with CIA and methylprednisone group and had no statistical difference compared with the CIA and methotrexate group(P>0.05).ConclusionArtesunate can up-regulate the expression of Foxp3 in T lymphocytes and synovial tissue,moreover is positively correlated with the dosage.When the dose is 20 mg·kg-1·d-1,the effect is most significant.

arthritis,experimental;arthritis,rheumatoid;Foxp3;artesunate

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.001

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160376、81360462)；廣西自然科學(xué)基金資助項目(2013GXNSFAA019111)。作者簡介：洪學(xué)志(1989-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從風(fēng)濕病學(xué)研究?！?/p>

，Tel:18007730655；E-mail:mohanyou@hotmail.com。

R392.8

A

1671-8348(2016)13-1729-04

2015-11-29

2015-12-16)