噻嗎洛爾對人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI 8226增殖、凋亡的影響及其機制

李婷，郭鵬翔，雷霆雯，王季石

(1 貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2.貴州省人民醫(yī)院；3 貴州醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室；4 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

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噻嗎洛爾對人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI 8226增殖、凋亡的影響及其機制

李婷1，郭鵬翔2，雷霆雯3，王季石4

(1 貴州醫(yī)科大學，貴陽550004；2.貴州省人民醫(yī)院；3 貴州醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室；4 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院)

目的觀察非選擇性β-腎上腺素能受體阻斷劑噻嗎洛爾對人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI 8226增殖及凋亡的影響，并探討其可能機制。方法取對數(shù)生長期RPMI 8226細胞分為實驗1、2、3、4、5、6組，分別加入終濃度為1、2.5、5、20、50、100 μmol/L的噻嗎洛爾培養(yǎng)，以不添加細胞和藥物的培養(yǎng)液為空白對照組，以不添加藥物的細胞液為陰性對照組，觀察培養(yǎng)24、48、72 h時各組細胞增殖情況。另取適量RPMI 8226細胞，分為A、B、C組，分別加入終濃度為 2.5、20、50 μmol/L噻嗎洛爾培養(yǎng)，設只加細胞培養(yǎng)液的對照組。取培養(yǎng)72 h時各組細胞，觀察細胞凋亡情況，檢測細胞Bax、B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9 mRNA和蛋白表達。結果隨濃度升高，細胞增殖抑制率升高，且隨干預時間增加，細胞增殖抑制率升高，P均<0.05。培養(yǎng)72 h時A、B、C組及對照組細胞凋亡率分別為7.17%±0.06%、10.56%±0.65% 、15.27%±0.86%、3.93%±0.25%，組間兩兩比較，P均<0.05。A、B、C組 Bax mRNA及蛋白的相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。B、C組Bcl-2 mRNA及蛋白的相對表達量均高于對照組(P均<0.05)；C組Bcl-2 mRNA相對表達量高于A組(P<0.05)。B、C組Caspase-3 mRNA相對表達量高于A組(P均<0.05)。A、B、C組 Caspase-9 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。結論噻嗎洛爾可抑制RPMI 8226 細胞增殖、促進細胞凋亡，其機制可能與噻嗎洛爾可上調Bax、Caspase-3、Caspase-9表達，抑制Bcl-2表達有關。

噻嗎洛爾;多發(fā)性骨髓瘤;細胞增殖；細胞凋亡；B細胞淋巴瘤因子2；Bax；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種漿細胞惡性克隆性疾病，病理特征為異常增生的漿細胞分泌大量單克隆免疫球蛋白及其片段，臨床可表現(xiàn)為廣泛骨質破壞，伴有反復感染、貧血、高鈣血癥、高黏滯綜合征、腎功能不全等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞增殖和凋亡的失衡是其發(fā)生、發(fā)展的重要因素，B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bax是細胞凋亡的重要信號分子，可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9，促進細胞凋亡。放、化療及造血干細胞移植是臨床常用的治療方法，可改善MM預后[3]，但具有價格昂貴等缺點。以往臨床常用β受體阻滯劑治療心血管疾病[4]，近年研究發(fā)現(xiàn)其可抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成、抑制腫瘤的浸潤和轉移[5，6]。噻嗎洛爾同為非選擇性β受體阻滯劑，具有生物利用度高等優(yōu)點。2014年9月～2016年2月，我們觀察了噻嗎洛爾對人MM細胞株RPMI 8226增殖及凋亡的影響，并探討其可能機制?，F(xiàn)將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞、藥物、儀器及試劑RPMI 8226細胞由重慶醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科所惠贈，用含10%滅活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中隔天換液，24～48 h傳代1次。噻嗎洛爾購自德國Dr Ehrenstorfer公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，F(xiàn)BS購于杭州四季青公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，F(xiàn)ITC Annexin V Apoptosis Detection Kite I購自美國BD Biosciences公司，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)購自北京康為世紀生物科技有限公司。PCR引物由上海生工生物科技有限公司設計合成。兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax 多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體、兔抗人Caspase-9多克隆抗體均購自美國Proteintech公司。

1.2噻嗎洛爾對RPMI 8226細胞增殖的影響觀察采用MTT法。取適量對數(shù)生長期RPMI 8226細胞，1×105/孔接種于96孔板，將細胞分為實驗1、2、3、4、5、6組，分別加入噻嗎洛爾使藥物終濃度為1、2.5、5、20、50、100 μmol/L，以不添加細胞和藥物的培養(yǎng)液為空白對照，以只添加細胞不添加藥物為陰性對照。分別于干預24、48、72 h各取200 μL 細胞培養(yǎng)液接種于適量各組細胞，每組5個復孔，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，離心后取上清，加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，使結晶物充分溶解，采用酶標儀檢測各組在490 nm 波長處的吸光度(A)，重復3次，取平均值計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(A對照組-A給藥組)/A對照組×100%。

1.3噻嗎洛爾對RPMI 8226細胞凋亡的影響及細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9 mRNA和蛋白檢測①噻嗎洛爾對RPMI 8226細胞凋亡的影響觀察：采用流式細胞儀。取對數(shù)生長期RPMI 8226細胞，1×106/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，分為A、B、C組，分別加入終濃度為 2.5、20 、50 μmol/L的噻嗎洛爾，每組5個復孔，同時設只加培養(yǎng)液的5個復孔為對照組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取適量各組細胞，1 000 r/min離心8 min，棄上清，3 mL PBS沖洗兩次。加入AnnexinV Binding Buffer和PI各5 μL，混勻后室溫避光孵育15 min。加入400 μL AnnexinV Binding buffer后混勻，采用流式細胞儀檢測各組干預72 h細胞的凋亡情況，計算細胞凋亡率。②各組RPMI 8226細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9 mRNA和蛋白檢測：采用RT-PCR法。檢測各組干預72 h時細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2 mRNA：采用TRIzol試劑盒提取總RNA，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。UltraSYBR Mixture試劑盒進行熒光定量PCR檢測，其中GAPDH作為內參。Bcl-2上游引物5′-TGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3′，下游引物5′-GATCCAGGTGTGCAGGTG-3′)；Bax上游引物5′-TCTGACGGCAACTTCAACTG-3′，下游引物5′-GTCCCAAAGTAGGAGAGGAGG-3′;Caspase-3上游引物5′-CAAATGGACCTGTTGACCTG-3′，下游引物5′-ATGGCACAAAGCGACTGGATG-3′；Caspase-9上游引物5′-TGGATGCCCTGTGTCGGTC-3′，下游引物5′-CTGAAGACGAGTCCCCTGGC-3′；GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。PCR反應條件：預變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、1 min，延伸60 ℃、1 min。以GAPDH作為內參校正，采用2-ΔΔCt法來分析基因的相對表達量。采用Western blotting法檢測1.4方法中各組干預72 h細胞Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達：取適量對數(shù)生長期各組細胞，按照蛋白抽提試劑盒說明提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度，取50 μg變性后蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜至PVDF膜上；5%牛血清蛋白TBS溶液室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜，加二抗室溫孵育1 h。TBST 洗滌，顯影、曝光。實驗均重復3次，取平均值

2　結果

2.1各組不同時間點細胞增殖抑制率比較不同時間點各組細胞增殖抑制率見表1，與對照組相比，各實驗組的細胞增殖抑制率均降低(P均<0.05)，且呈濃度、時間依賴性(P均<0.05)。

表1　不同時間點各組細胞增殖抑制率±s)

2.2各組RPMI 8226細胞凋亡率比較干預72 h時A、B、C組及對照組細胞凋亡率分別為7.17%±0.06%、10.56%±0.65% 、15.27%±0.86%、3.93%±0.25%，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3各組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達比較各組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白比較見表2。

表2　干預72 h各組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與A組比較，◇P<0.05。

3　討論

目前，MM發(fā)病率占惡性血液疾病中的13.4%，病死率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤病死率的19%[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MM是一種克隆性B細胞疾病，其特征為骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白過度生成，常伴有多種并發(fā)癥，且極易出現(xiàn)細菌性感染[6]。MM發(fā)病機制目前仍不明確，與遺傳因素、細胞因子異常以及骨髓微環(huán)境等密切相關，目前的主要治療方法是化療及造血干細胞移植，普通化療以及蛋白酶抑制劑和免疫調節(jié)劑等新藥的應用生存率有所提高[7]，但該病仍無法治愈，化療耐藥及副作用是難以逾越的難題。而造血干細胞移植其昂貴的價格也限制了其在中國患者中的應用。多發(fā)性骨髓瘤及其治療常影響腎臟、免疫、骨骼、血液和神經系統(tǒng)功能等。由此造成的器官功能障礙往往影響患者的生活質量，并限制隨后的治療，甚至可能導致死亡，因此尋求有效藥物提高療效十分必要。

噻嗎洛爾又叫噻嗎心安，是一種非選擇性β-腎上腺素能拮抗劑,臨床常用于其治療高血壓病、心絞痛、心動過速及青光眼，是治療青光眼的一線藥物。其主要作用機制是通過抑制腎上腺素能受體從而減慢心率、減弱心肌收縮力、降低血壓、減少心肌耗氧量,改善左室和血管的重構以及減少房水生成。最新研究發(fā)現(xiàn)，噻嗎洛爾可用于治療嬰幼兒血管瘤[8]，其作用機制可能是：早期通過減少一氧化氮釋放使血管收縮;中期通過抑制促血管生成的信號如血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、基質金屬蛋白酶9，并導致生長停滯；后期通過誘導血管內皮細胞凋亡從而造成腫瘤消退[9]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，噻嗎洛爾能明顯抑制RPMI 8226細胞的增殖，并呈時間劑量依賴性，其對RPMI 8226增殖的IC50值約為20 μmol/L。在相同藥物時間作用下，細胞凋亡率隨藥物濃度升高而逐漸增加。細胞凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡，與維持細胞自身的穩(wěn)定及腫瘤的發(fā)生有密切關聯(lián)。研究顯示，凋亡抑制基因過表達及促凋亡基因活性減低與骨髓瘤的發(fā)病、治療耐藥及預后密切相關[10]，因此，干預細胞凋亡途徑，誘發(fā)腫瘤細胞凋亡已成為骨髓瘤治療的重要手段。目前凋亡發(fā)生的途徑有：線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑。線粒體途徑，也叫內源性途徑，在細胞凋亡中起中心作用。Bcl-2家族是細胞凋亡通路中最為重要的一組信號分子，此家族分子包括抗細胞凋亡(如 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1)和促細胞凋亡(如Bax、Bad、Bak)蛋白兩大類[11]，其中Bax/Bcl-2在細胞凋亡過程中相互作用，調控細胞色素C等物質從線粒體的釋放，最終調控線粒體凋亡途徑。Bax 可通過在細胞內質膜結構上打孔、改變構象或者發(fā)生寡聚化，破壞線粒體膜，引起細胞色素C釋放，從而促進細胞凋亡[12]。而Bcl-2則相反，其主要分布于細胞膜及細胞質中，控制著線粒體膜的通透性，抑制細胞色素C的釋放及Caspase的激活進而抑制凋亡。另外，Bcl-2還可通過與 Bax 形成復合物阻斷其功能從而抑制細胞凋亡[13]。在本研究顯示，與對照組相比抗凋亡蛋白Bcl-2在mRNA和蛋白水平表達均下調，而促凋亡蛋白Bax 表達增加，使得Bax/Bcl-2比值升高，從而促進腫瘤細胞的凋亡，提示噻嗎洛爾誘導人多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI 8226凋亡可能是通過Bcl-2家族的變化而實現(xiàn)的。

Caspase細胞凋亡家族也與Bax/Bcl-2密切相關，Bax表達增多或Bcl-2表達減少均可誘導Caspase家族蛋白激活，繼而發(fā)揮促凋亡作用[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)Caspase家族成員共14個，其中Caspase-3被認為是該家族中最關鍵的蛋白酶[15],有“死亡執(zhí)行蛋白酶”的稱號。正常情況Caspase-3以無活性酶原形式存在于胞漿中，被活化后可酶解切割DNA依賴的蛋白激酶等，從而干擾DNA復制及損傷修復等。Caspase-9是凋亡啟動蛋白，位于級聯(lián)反應的上游，常參與啟動下游的蛋白酶，引起凋亡[16]。在本次噻嗎洛爾對RPMI 8226細胞的凋亡誘導過程中Caspase-3及Caspase-9的mRNA表達均上調，而在蛋白水平未見明顯變化，出現(xiàn)以上差異的原因可能與轉錄、轉錄后調控、翻譯等眾多因素有關。由此我們推測噻嗎洛爾可能是通過抑制Bcl-2和激活Bax信號通路途徑促進骨髓瘤細胞凋亡來實現(xiàn)抗腫瘤的，但是否還通過其它凋亡相關蛋白促進其凋亡仍需進一步研究。

綜上所述，噻嗎洛爾可抑制RPMI 8226 細胞增殖、促進細胞凋亡，其機制可能與上調Bax、Caspase-3、Caspase-9表達，抑制Bcl-2的表達有關。

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Effects of timolol on proliferation and apoptosis of human multiple myeloma cell line RPMI 8226

LI Ting1,GUO Pengxiang,LEI Tingwen,WANG Jishi

(1 Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

ObjectiveTo investigate the effects of timolol on cell proliferation and apoptosis of human multiple myeloma cell line RPMI-8226,and to explore its potential anti-tumor mechanism.MethodsThe RPMI 8226 cells in the logarithmic phase were divided into groups 1,2,3,4,5,and 6,and then were added with 1,2.5,5,10,20,50 and 100 μmol/L timolol,respectively.The nutrient solution without adding cells and drugs was taken as the blank control group.The negative control group was only added with cells.At 24,48 and 72 h of cultivation,MTT method was used to observe the proliferation of different groups.In addition,the appropriate amount of RPMI 8226 cells were divided into groups A,B and C which were added with 2.5,20 and 50 μmol/L timolol as the final concentrations,respectively.Meanwhile,the control group was only added with cell culture fluid.And then flow cytometry was used to detect the apoptosis effect.Changes in the expression of Caspase-3,Caspase-9,Bax and Bcl-2 protein and mRNA were detected by Western blotting and RT-PCR,respectively.ResultsAfter treated with timolol for 24,48 and 72 h,the inhibition rate increased with the increase of drug concentrations and the extension of the time(all P<0.05).After treated with timolol for 72 h,the apoptotic rates of groups A,B,C were 7.17%±0.06%,10.56%±0.65%,15.27%±0.86% and 3.93%±0.25%(all P<0.05).The mRNA and protein expression of Bax in the group A,B and C was significantly high than that of the control group(all P<0.05).The mRNA and protein expression of Bcl-2 in the groups B and C was much higher than that in the control group(all P<0.05).Compared with group A,the mRNA expression of Bcl-2 in the group C was higher.Meanwhile,the Caspase-3 mRNA expression was higher in groups B and C as compared with that of group A(all P<0.05).And the mRNA expression of Caspase-9 in the groups A,B and C was higher than that in the control group(all P<0.05).ConclusionTimolol inhibits the proliferation and promotes apoptosis of RPMI 8226 cells,the mechanism may be that it can up-regulate the expression of Bax,Caspase-3 and Caspase-9,and inhibit the Bcl-2 expression.

timolol;multiple myeloma;cell proliferation;apoptosis;Bcl-2;Bax;Caspase-3;Caspase-9

貴州省科技計劃資助項目(黔科合LH字2014-7010)。

李婷(1990-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向為惡性血液病。E-mail：1044207658@qq.com。

簡介：郭鵬翔(1971-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要研究方向為血液病的治療。E-mail：gxgdx118@sna.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.007

R730.2

A

1002-266X(2016)27-0024-04

2016-02-25)