集落刺激因子、干擾素-β及腫瘤壞死因子-α在潰瘍性結(jié)腸炎中的檢測價值

周海新，麥聯(lián)任，張達坤

(海南省中醫(yī)院，海南 ?？?570203)

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論著

集落刺激因子、干擾素-β及腫瘤壞死因子-α在潰瘍性結(jié)腸炎中的檢測價值

周海新，麥聯(lián)任，張達坤

(海南省中醫(yī)院，海南 ?？?570203)

目的探討集落刺激因子(CSF)、干擾素-β(IFN-β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在潰瘍性結(jié)腸炎患者血清和結(jié)腸黏膜組織中表達情況及檢測價值。方法選擇符合診斷標準的活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者30例作為患者組，以及同期健康對照者30例作為正常組，分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)及熒光定量PCR法檢測2組血清及結(jié)腸黏膜組織中CSF、IFN-β及TNF-α表達情況。結(jié)果患者組血清CSF、TNF-α水平及結(jié)腸黏膜組織中CSF mRNA、TNF-α mRNA表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，血清IFN-β水平及結(jié)腸黏膜組織中IFN-β mRNA表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)。CSF、IFN-β、TNF-α變化與潰瘍性結(jié)腸炎病情存在相關(guān)性。結(jié)論潰瘍性結(jié)腸炎患者血清及結(jié)腸黏膜組織中CSF、TNF-α表達水平均明顯增高，IFN-β表達水平均明顯降低，CSF、IFN-β及TNF-α表達水平可作為判斷潰瘍性結(jié)腸炎病情的重要參考指標。

集落刺激因子；干擾素-β；腫瘤壞死因子-α；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是基因易患，腸道共生菌群、環(huán)境及食物抗原、腸道免疫交互作用，結(jié)腸免疫失衡引起的一種腸道非特異性炎癥疾病[1]。先天固有免疫失衡、腸道黏膜免疫屏障破壞、炎癥持續(xù)放大被認為是UC反復(fù)發(fā)作，甚至炎癌轉(zhuǎn)化的重要機制[2]。中性粒細胞作為機體中最重要的免疫細胞，是機體天然免疫防御的重要細胞群，占人體白細胞總量的55%～70%，被認為在UC發(fā)病中有著重要作用，而白細胞濾過法治療UC有效，亦反證中性粒細胞與UC密切相關(guān)[3]。集落刺激因子(CSF)作為最為重要的造血生長因子，在髓系細胞的增殖、分化及成熟過程中占據(jù)重要地位，干擾素-β(IFN-β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為中性粒細胞所分泌的重要細胞因子，在炎癥發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用。本課題組基于上述研究進展，以健康志愿者為正常對照，探討CSF、IFN-β及TNF-α表達在UC中的作用及臨床意義，以期為UC病情判斷提供新的指標。

1　臨床資料

1.1一般資料選擇2015年1—12月海南省中醫(yī)院消化科門診及住院部確診的活動期UC患者30例作為患者組，UC診斷參照 2012 年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見( 2012年.廣州)》[4]，綜合臨床癥狀、內(nèi)鏡檢查及病理組織學(xué)確診。年齡18～65歲，其中男19例，女11例；年齡(37.21±11.25)歲；病程(3.21±0.43)年；依據(jù)改良Mayo標準評分[5]病情輕度(3～5分)21例，中度(6～10分)6例，重度(11～12分)3例。另選擇同期于我院健康體檢中心體檢健康者30例作為正常組，除外有風濕免疫等疾病史者，男16例，女14例；年齡(32.17±9.81)歲。入選者理解和簽署知情同意書，排除哺乳期婦女和孕婦。

1.2方法

1.2.1血清CSF、IFN-β及TNF-α檢測取2組入選者靜脈血5 mL，靜置4 h，自然凝固后，3 000 r/min離心15 min，置于-20 ℃保存，應(yīng)用ELISA法檢測血清CSF、IFN-β及TNF-α水平，CSF、IFN-β及TNF ELSIA試劑盒購自上海森雄生物技術(shù)有限公司，具體步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.2.2結(jié)腸黏膜組織中CSF、IFN-β及TNF-α mRNA表達情況檢測收集2組入選者結(jié)腸黏膜組織，置于-70 ℃超低溫冰箱。應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測結(jié)腸黏膜組織中CSF、IFN-β及TNF-α mRNA表達情況，具體步驟按說明進行，委托廣州藝佳生物技術(shù)有限公司完成。CSF、IFN-β、TNF及GAPDH引物設(shè)計見表1。

表1　CSF、IFN-β、TNF及GAPDH引物設(shè)計

注：GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物。

2　結(jié)　　果

2.12組血清CSF、IFN-β及TNF-α水平比較患者組血清CSF、TNF水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，IFN-β水平明顯低于正常組(P<0.05)。見表2。

2.22組結(jié)腸黏膜組織中CSF、IFN-β及TNF-α mRNA表達情況比較患者組結(jié)腸黏膜組織中CSF及TNF-α mRNA相對表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，IFN-βmRNA相對表達量明顯低于正常組(P<0.05)，見表3。各指標檢測擴增、熔解曲線見圖1～4。

表2　2組血清CSF、IFN-β及TNF-α水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

表3　2組結(jié)腸黏膜組織中CSF、IFN-β及TNF-α mRNA相對表達量比較±s)

注：①與正常組比較，P<0.05。

圖1　GAPDH擴增、熔解曲線

圖2　CSF擴增、熔解曲線

圖3　IFN-β擴增、熔解曲線

2.3CSF、IFN-β及TNF-α表達情況與UC關(guān)系Logistic相關(guān)性分析顯示CSF、IFN-β及TNF-α表達情況與UC病情存在顯著相關(guān)性。見表4。

圖4　TNF-α擴增、熔解曲線

表4　CSF、IFN-β及TNF-α表達情況與UC關(guān)系Logistic分析結(jié)果

3　討　　論

炎癥作為一把雙刃劍，通過清除外來抗原和體內(nèi)衰老細胞而維持人體免疫平衡；當炎癥反應(yīng)過度，超過機體組織耐受時，必然對靶器官造成損傷，導(dǎo)致功能障礙[6]。生理狀態(tài)下腸道處于一種弱炎癥狀態(tài)，其目的在于保證腸道免疫屏障完整，這對于維持腸道穩(wěn)態(tài)是非常重要的[7]。UC是一種反復(fù)發(fā)作難以治愈的非可控性炎癥，機體免疫系統(tǒng)對腸道正常菌群的免疫反應(yīng)發(fā)生異常被認為是UC的重要發(fā)病機制[8-9]，它涉及免疫反應(yīng)的整個過程，即便UC緩解期患者，其腸道免疫系統(tǒng)仍然處于失衡狀態(tài)[10]，這或許能夠解釋在特定條件下為何UC會反復(fù)發(fā)作。UC急性活動期，從中性粒細胞活化-大量向炎癥部位聚集-發(fā)揮抗炎效用，這是一個涉及細胞因子、趨化因子等共作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，其中CSF作為髓系粒細胞成熟、活化的重要細胞因子在上述進程中具有不容忽視的地位。本研究亦發(fā)現(xiàn)活動期UC患者結(jié)腸黏膜及血清中CSF表達水平明顯高于正常組，CSF上升是否可以作為預(yù)測UC炎癥活動的重要指標值得深入分析。

腸道黏膜免疫失衡在UC發(fā)病中具有不容忽視的作用。腸道黏膜免疫主要包括先天固有免疫和后天獲得性免疫，其中先天固有免疫系統(tǒng)主要通過模式識別受體(PRRs)結(jié)合病原相關(guān)模式分子(PAMPs)識別入侵的外源微生物，Toll樣受體( TLR)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族(NLRPs)、肽聚糖結(jié)合蛋白(PGRP)作為重要的PRRs，通過識別PAMPs分子包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖及甘露聚糖等，發(fā)揮免疫防御作用[11]。生理狀態(tài)下，PRRS識別PAMPS后可以導(dǎo)致細菌細胞壁被水解，促進抑菌肽基因表達，發(fā)揮重要的抗炎作用而維持腸道免疫平衡；但在病理情況下，炎癥持續(xù)發(fā)作，PRRS識別PAMPS信號過度活化后，可導(dǎo)致TLR信號通路下游靶基因異常轉(zhuǎn)錄，TNF-α、IL-1β、IL-22等大量釋放，使得炎癥持續(xù)而導(dǎo)致靶器官受損[12-13]。而Ⅰ型干擾素(IFN-β)、IL-10等重要的抗炎因子分泌減少，造成促炎因子與抗炎因子之間動態(tài)平衡被打破，參與UC發(fā)病，甚至與UC癌變相關(guān)。其中Ⅰ型干擾素可以通過增加抗炎因子的表達, 增強T淋巴細胞和NK細胞的功能, 并且抑制TNF-α、 IFN-γ、促炎因子的釋放來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活動期UC患者血清及結(jié)腸黏膜組織中TNF-α表達水平增高，IFN-β表達水平下降。

綜上所述，UC所涉及免疫失衡是一個非常復(fù)雜的病理進程，并不是簡單將其歸因于促炎因子和抗炎因子之間的串聯(lián)或并聯(lián)信號失衡[15]，但在UC的發(fā)生、發(fā)展中，炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞局部趨化，大量促炎癥因子釋放無疑占據(jù)重要地位。筆者通過本次研究發(fā)現(xiàn)活動期UC患者體內(nèi)存在CSF、TNF-α表達上升、IFN-β表達下降的病理變化，而且該變化與UC病情呈正相關(guān)，由此推測CSF、TNF-α、IFN-β表達水平可以作為判斷潰瘍性結(jié)腸炎病情的重要參考指標。下一步擬擴大樣本，研究應(yīng)用艾迪莎干預(yù)后UC患者血清及結(jié)腸黏膜上述指標變化特點，以進一步驗證上述指標的預(yù)測意義。

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The role and significance of colony stimulating factor, interferon-beta and tumor necrosis factor in ulcerative colitis

ZHOU Haixin, MAI Lianren, ZHANG Dakun

(The TCM Hospital of Hainan Province, Haikou 570203, Hainan, China)

Objective It is to investigate the clinical significance of colony stimulating factor (CSF), interferon-beta (IFN-β) and tumor necrosis factor (TNF-α) in the occurrence and development of ulcerative colitis by detecting the changes of above indexes in serum and colonic mucosal of ulcerative colitis.Methods 30 cases of patients with ulcerative colitis were selected to the patients group, and 30 cases of healthy people were selected to the healthy control group.The serum and colonic mucosa of patients with ulcerative colitis and healthy control group were collected.The expression of CSF, IFN-β and TNF-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Real-time PCR respectively.Results The expression of CSF and TNF-α in serum and the levels of CSF mRNA and TNF-α mRNA in colonic mucosa of the patients group were significantly higher than those of the healthy control group (all P<0.05).the expression of IFN-β in serum and the level of IFN-β mRNA in colonic mucosa were significantly lower than those of the healthy control group (all P<0.05).The changes of CSF, IFN-β and TNF-α were significantly correlated with the severity of ulcerative colitis.Conclusion The expression of CSF, IFN-β and TNF in serum can be used as an important reference index for judging the condition of ulcerative colitis.

colony stimulating factor; Interferon-beta; tumor necrosis factor-alph; ulcerative colitis

周海新，男，副主任醫(yī)師，主要從事炎癥性腸病基礎(chǔ)與臨床研究。

海南省衛(wèi)生廳資助項目(14A210219)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.24.001

R574.62

A

1008-8849(2016)24-2623-04

2016-02-10