基于氣相色譜法指紋圖譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用識別的溫陽扶正散質(zhì)量控制方法研究

楊思成 黃 菊 周仲瑜 黃 偉 陳樹和 段雪云 劉國秀 翟華強(qiáng) 孫婉瑾 黃正德

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 湖北省中醫(yī)藥研究院針灸科，湖北武漢 430061；3.湖北省中醫(yī)院 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 湖北省中醫(yī)藥研究院藥事部，湖北武漢 430061；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥調(diào)劑標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，北京 102488

隨著祖國醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們對體質(zhì)的研究也越來越深入，WHO 調(diào)查結(jié)果顯示，全世界人口中，處于亞健康狀態(tài)的人數(shù)高達(dá)75%，而痰濕質(zhì)和陽虛質(zhì)在總調(diào)查人群中人數(shù)最多，分別為17.03%、16.30%[1]。陽虛質(zhì)患者主要表現(xiàn)癥狀為精神不振、睡眠時(shí)間偏多、平素畏冷等。痰濕質(zhì)是肥胖發(fā)生的病理基礎(chǔ)[2-3]。

“陰陽調(diào)理灸法”創(chuàng)始人，湖北省中醫(yī)院針灸科周仲瑜教授認(rèn)為調(diào)理患者亞健康狀態(tài)關(guān)鍵在于糾正患者偏頗體制，治療陽虛質(zhì)及痰濕質(zhì)當(dāng)以溫陽散寒、健脾祛濕為基本原則。因此，周教授結(jié)合其多年理論鉆研成果及豐富的醫(yī)療臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)立溫陽扶正散，該方由附子、丁香、干姜、肉桂、吳茱萸，按照一定比例調(diào)配而成。通過外用溫灸，使患者皮膚更有效地吸收藥物成分，用于調(diào)理人體亞健康狀態(tài)[4-5]，經(jīng)臨床驗(yàn)證安全、有效。

溫陽扶正散的化學(xué)成分較復(fù)雜，其中含有的揮發(fā)油，通過對表皮的刺激，形成穴位刺激發(fā)揮類針灸療效。該調(diào)理方中包含多種揮發(fā)性成分，主要被報(bào)道的有抑制腸道內(nèi)異常發(fā)酵[6-8]；擴(kuò)張血管、促進(jìn)人體內(nèi)血液循環(huán)、降低血壓、緩解肢體疼痛[9-12]；解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎[13-14]；抗血栓及抑制血小板聚集[15-17]等多方面的作用。同時(shí)該復(fù)方含有的某些揮發(fā)性成分還具有一定的促透皮吸收功能[18-19]。臨床研究表明，該方對陽虛質(zhì)和痰濕質(zhì)患者具有顯著療效。為保障本方調(diào)理亞健康狀態(tài)臨床療效的穩(wěn)定性，需對不同批次的復(fù)方進(jìn)行質(zhì)量控制研究。本文采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）對溫陽扶正散的主要作用成分，即其揮發(fā)性成分進(jìn)行指紋圖譜研究，基于指紋圖譜模式，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對桉油精、α-石竹烯、桂皮醛、丁香酚4 種成分進(jìn)行了識別和對應(yīng)，為本方的質(zhì)量評價(jià)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑

α-石竹烯對照品（批號：PS1174-0100，成都普思生物科技有限公司）、丁香酚對照品（批號：110725-201917，中國食品藥品檢定研究院）、桂皮醛對照品（批號：110710-202022，中國食品藥品檢定研究院）、桉油精對照品（批號：110788-201707，中國食品藥品檢定研究院）；無水硫酸鈉、甲醇、無水乙醇均為分析純；高純度氮?dú)猓ā?9.999%）（武漢市同和氣體制造有限公司）、高純氦氣（≥99.999%）（武漢華星工業(yè)技術(shù)有限公司）；本實(shí)驗(yàn)所用溫陽扶正散制劑均由湖北省中醫(yī)院制劑中心制備。

1.2 儀器

Agilent 7890B-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電子轟擊離子源[（electron impact ion source，EI）；7697A頂空進(jìn)樣器，G4513A 自動進(jìn)樣器]；PerKElmer Clarus 580 氣相色譜儀（美國PerKElmer 公司）；SPH-300 型氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；CA-2 型靜音無油空氣泵（武漢科林普豐儀器有限公司）；Elite-WAX ETR（max 250℃，0.25 μm×0.25 mm×30 m）毛細(xì)管色譜柱；中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A 科研類國家藥典委員會）；真空機(jī)械泵（德國Pfeiffer Vacuum 公司）；NIST17 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；Agilent Masshunter Qualitative Analysis 定性工作站。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC 及GC-MS 條件

GC 條件：采用高純度氮?dú)猓ā?9.999%）為載氣，載氣流量為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為1.0 μl，進(jìn)樣口溫度為200℃，分流比為20∶1；FID 檢測器溫度為280℃，氫空比為45∶450 ml/min；升溫程序設(shè)置為初始溫度50℃，保持時(shí)間1 min；以10℃/min 的升溫速率升溫至180℃，保持時(shí)間3 min；再以10℃/min 的升溫速率升溫至240℃，保持時(shí)間5 min。

GC-MS 條件：EI 源，轟擊電壓70 eV，正離子模式，離子源溫度為230℃，四級桿溫度為170℃，接口溫度為220℃，MS 掃描范圍為m/z 30～500 amu。數(shù)據(jù)采集模式為全掃描。

2.2 揮發(fā)油的提取與得油率測定

本質(zhì)量控制研究只針對本方揮發(fā)性成分，因而只進(jìn)行揮發(fā)油的提取。選取湖北省中醫(yī)院制劑中心不同批次生產(chǎn)的10 批代表性方劑，各稱取約40 g，按照2020版《中華人民共和國藥典》[20]第四部通則2204 中揮發(fā)油測定法甲法提取，各批次信息及揮發(fā)油得率見表1。

表1 本復(fù)方揮發(fā)油得率

2.3 供試品溶液及對照品溶液的配置

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下所得揮發(fā)油0.20 ml，加入無水乙醇稀釋10 倍，0.45 μm 有機(jī)濾膜濾過即得供試品溶液；分別精密量取α-石竹烯對照品10 μl、丁香酚對照品80 μl、桂皮醛對照品10 μl、桉油精對照品5 μl，置于2 ml 棕色容量瓶中，加入無水乙醇定容稀釋，0.45 μm 有機(jī)濾膜濾過即得對照品溶液。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件對得到的揮發(fā)性成分氣相色譜圖譜進(jìn)行后續(xù)處理與分析，建立本質(zhì)量控制研究的模型。

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取1 號供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄指紋圖譜。測定各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對保留時(shí)間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）值，RSD 值分別處于0.05%～0.45%和0.05%～2.70%，均＜3%。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取1 號樣品，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的配置方法再平行配置6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。測定各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值，RSD值分別處于0.05%～0.64%和1.24%～2.82%，均＜3%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 號供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1 次，記錄指紋圖譜。測定各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 值，RSD 值分別處于0.05%～0.52%和0.05%～2.80%，均＜3%。

2.6 結(jié)果

2.6.1 基于氣相色譜指紋圖譜的質(zhì)量控制模型的建立為控制溫陽扶正散的質(zhì)量，保障臨床療效穩(wěn)定，將各批次所得揮發(fā)油的氣相色譜圖，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，設(shè)定1 號樣品為參照圖譜，得到10 批溫陽扶正散氣相色譜指紋圖譜疊加圖（圖1）和共有模式對照圖譜（圖2），識別出12 個(gè)主要色譜峰作為共有峰，其中2 號峰為桉油精、5 號峰為α-石竹烯、10 號峰為桂皮醛、11 號峰為丁香酚（圖3），這幾種揮發(fā)性成分在本方中具有明確療效。同時(shí)計(jì)算出10 批溫陽扶正散氣相色譜指紋圖譜相似度，S1 至S10 的相似度數(shù)據(jù)見表2。因丁香酚對照品在氣相色譜圖中的分離較好，且含量較高，故在指紋圖譜評價(jià)系統(tǒng)中將其作為內(nèi)參峰。

表2 10 批溫陽扶正散氣相指紋圖譜相似度

圖1 10 批溫陽扶正散揮發(fā)油氣相色譜疊加圖譜

圖2 10 批溫陽扶正散揮發(fā)油氣相共有圖譜

圖3 混合對照品圖譜

2.6.2 氣質(zhì)定性結(jié)果 按照“2.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，用正己烷稀釋100 倍后，按“2.1”項(xiàng)下GC-MS 條件進(jìn)樣分析，針對共有模式下12 個(gè)共有峰，經(jīng)MS 庫對照分析，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行識別[21-24]，結(jié)果見表3。

表3 共有峰化合物信息

3 討論

基于溫陽扶正散中揮發(fā)性成分與臨床療效有著直接關(guān)聯(lián)，本研究創(chuàng)新性的采用指紋圖譜和成分識別的研究模式，探討了其質(zhì)量穩(wěn)定性。為了得到最佳氣相色譜圖，本研究參考了不同的程序升溫條件[21-24]，觀察每個(gè)樣品色譜圖中主要色譜峰的情況，尤為關(guān)注各峰之間的分離度，經(jīng)過多次嘗試和篩選，最終得到本研究中的程序升溫色譜條件。本研究通過GC-MS 分析技術(shù)，NIST17 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻(xiàn)檢索識別出12 種化合物，其中丁香酚為本實(shí)驗(yàn)測得溫陽扶正散揮發(fā)油中含量最高的成分，在各批次中保持穩(wěn)定占比，在質(zhì)量控制模型中可作為參照峰，其余共有峰從含量占比上看，均與指紋圖譜結(jié)果吻合，即含量高的峰對應(yīng)指紋圖譜上的峰高相對較高，同類型的質(zhì)控指標(biāo)含包括α-石竹烯、桂皮醛等。含量占比較低的峰在批次間波動較大，無法作為質(zhì)量控制參數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合GC-MS 分析技術(shù)進(jìn)行定性研究，不僅揭示了共有峰所代表化合物的本質(zhì)，也進(jìn)一步揭示了本方物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于充分對各指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。而以往指紋圖譜研究在建立共有模式的基礎(chǔ)上未進(jìn)行定性研究，多未將共有峰與化合物相關(guān)聯(lián)[25-27]。中藥指紋圖譜技術(shù)能全面反映整體內(nèi)在化學(xué)特征，適用于評價(jià)復(fù)雜因素導(dǎo)致的各化學(xué)組分差異。由于制劑中心的原輔料供貨單位、人員、生產(chǎn)季節(jié)等隨著批次的不同不斷變化，不同批次的方劑存在綜合因素導(dǎo)致的質(zhì)和量的改變，需要建立質(zhì)控模型整體進(jìn)行評價(jià)。物質(zhì)基礎(chǔ)質(zhì)和量的變化會直接影響臨床療效，質(zhì)控模型的建立對保證臨床療效有著重大意義。在本研究中，10 號樣品與其他樣品相比相似度較小，根據(jù)指紋圖譜，10 號樣品中月桂烯、桉油精、α-蒎烯、α-律草烯四種成分含量差異與其他樣品相比較大，綜合批號信息，考慮樣品是在冬季制備，藥材粉碎后，分子量較小的揮發(fā)性物質(zhì)受溫度影響不易溢出所致。提示臨床用藥時(shí)，可能會出現(xiàn)在冬季用藥類針灸效果不佳的現(xiàn)象。建議在冬季對藥粉稍加熱后使用。