電針配合威靈仙關節(jié)腔內注射對大鼠膝骨關節(jié)炎MMPs及HA的影響*

孫建琴　陳紅英　姚忠紅　穆敬平　郭俐宏（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

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電針配合威靈仙關節(jié)腔內注射對大鼠膝骨關節(jié)炎MMPs及HA的影響*

孫建琴陳紅英姚忠紅穆敬平△郭俐宏
（湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

目的 探討電針配合威靈仙膝關節(jié)腔內注射對大鼠膝骨關節(jié)炎基質金屬蛋白酶（MMPs）及關節(jié)液透明質酸（HA）影響的作用機制。方法 將40只大鼠隨機分為對照組、電針組、關節(jié)腔注射組、電針+關節(jié)腔注射組，采用膝關節(jié)腔內注射弗氏劑的方法建立膝骨關節(jié)炎動物模型；電針組取三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉及主穴以下旁開0.5 cm為配穴電針刺激20 min，關節(jié)腔注射組于關節(jié)腔內注射威靈仙注射液；電針+關節(jié)腔注射組治療方法為電針+關節(jié)腔注射；觀察膝關節(jié)腫脹率及消腫時間，采用酶免疫吸附試驗測定血清MMPs（MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13）陽性表達水平，關節(jié)腔積液中白介素（IL-1β）、HA含量。結果 與電針組及關節(jié)腔注射組比較，電針+關節(jié)腔注射組膝關節(jié)腫脹率、消腫時間、MMP-1、MMP-9表達水平明顯降低，HA明顯提高（P＜0.05）。結論 電針配合威靈仙膝關節(jié)腔內注射治療大鼠膝骨關節(jié)炎的作用機制可能與抑制MMPs過度表達并增加HA分泌而促進局部炎癥吸收，延緩關節(jié)軟骨退行性變相關。

膝骨關節(jié)炎電針關節(jié)腔注射威靈仙基質金屬蛋白酶透明質酸

膝骨關節(jié)炎（KOA）屬中醫(yī)學“筋痹”“骨痹”范疇。中醫(yī)學認為膝骨關節(jié)炎發(fā)病與血瘀氣滯、關節(jié)局部濕濁痹阻有關。外傷、關節(jié)滑膜勞損、感染等炎性及疼痛刺激使膝骨關節(jié)面滑膜毛細血管擴張、通透性增大而導致關節(jié)腔內組織液大量滲出而成關節(jié)積液［1］。以往治療時多局限于“舒筋通絡、除痹利濕、行氣止痛、活血化瘀”［2］。本實驗研究采取電針配合威靈仙膝關節(jié)腔內注射的方法治療大鼠膝骨關節(jié)炎，研究該方案對造成膝骨關節(jié)炎疼痛的病理基礎，即MMP陽性表達及HA分泌與炎性疼痛的相互關系，分析治療膝骨關節(jié)炎的鎮(zhèn)痛消炎作用機制，為臨床提供理論基礎?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組SP F級無特定病原體動物SD大鼠40只，體質量（200.0±20.0）g，雌雄各半，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK（鄂）2014-0008，實驗動物設施使用許可證：SYXK（鄂）2014-0031。采用隨機數字表編號，隨機分為對照組、電針組、關節(jié)腔注射組及電針+關節(jié)腔注射組，每組10只。

1.2試藥與儀器復方威靈仙注射液（太和醫(yī)院藥劑科制劑中心提供），藥方：威靈仙1000 g，獨活500 g，柴胡500 g，白芷500 g，川芎500 g，氯化鈉8 g，亞硫酸氫鈉1 g。弗氏完全佐劑（上海實生細胞生物技術有限公司）；MMPs測試盒 （上海森雄科技實業(yè)有限公司）；SDZ-Ⅱ型電子針療儀（上海坤弘，型號：SDZ-Ⅱ）。

1.3模型制備碘伏消毒大鼠膝關節(jié)及以下部位，采用改良Huhh造模法制備膝骨關節(jié)炎動物模型［3］。造模時于第1、3、7日分別將弗氏完全佐劑0.1 mL注入大鼠右膝關節(jié)腔，根據臨床超疲勞易導致膝骨關節(jié)炎發(fā)病的特點，強迫動物每日活動30～40 min，于2周后出現以下癥狀即可確定大鼠膝關節(jié)炎模型成功：1）關節(jié)出現紅、腫、熱、痛癥狀，有右膝軟組織腫脹或關節(jié)腔積液現象；2）右膝關節(jié)活動受限、周圍僵硬；3）發(fā)病部位在膝等關節(jié)；4）關節(jié)積液檢查白細胞介素-1β降低、HA明顯升高現相；5）關節(jié)病理切片顯示關節(jié)軟骨面粗糙、滑膜增生、粘連、肥厚；6）出現以上任意3條均可判定為膝骨關節(jié)炎。

1.4治療方法1）電針組：將大鼠固定于大鼠固定器，右膝遁經取穴，三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉為主穴。針法：由內向外斜刺2～3分。主穴以下旁開0.5 cm為配穴，行導氣手法用一次性無菌針灸針齊刺入骨膜，以三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉為正極，配穴為負極，得氣后接 SDZ-II型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針電針刺激20 min。2）關節(jié)腔注射組：于右膝關節(jié)腔內注射威靈仙注射液，每日1次，每次0.1～0.2 mL。3）電針+關節(jié)腔注射組：先同電針組相同治療完成后，于右膝關節(jié)腔內注射威靈仙注射液。4）對照組：大鼠每日僅消毒處理作為對照。以上4組動物治療2周為1個療程。

1.5標本采集及檢測參考文獻［4］，大鼠眼眶靜脈取血，采用免疫酶連吸附試驗 （ELISA）測定MMPs （MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13）血清中的表達水平；抽取膝關節(jié)腔關節(jié)積液備用，測定關節(jié)積液中IL-1β、HA含量。按文獻［5］方法：先取100 mL量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用50 mL注射器吸取量筒內蒸餾水約30 mL。于每只大鼠右前肢膝關節(jié)縫矢狀面用記號筆做一標記，然后把大鼠左足緩慢伸入量筒內，使標記與量筒最高處平齊。再用已吸入30 mL水的注射器向量筒內緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及大鼠膝關節(jié)標記處一致，讀取注射器內剩余液體體積，再用30 mL注射器內剩余液體體積即為大鼠的右前肢膝關節(jié)容積，重復3次取平均值。右前肢膝關節(jié)腫脹百分率（%）=（造模后容積-造模前容積）/造模前容積×100%。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。實驗數據以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間差異采用Dunnett檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組動物足腫脹度及消腫時間見表1。治療后電針組、關節(jié)腔注射組足腫脹度及消腫時間均低于本組治療前及對照組（P＜0.05），但兩組治療后比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。電針+關節(jié)腔注射組足腫脹度及消腫時間明顯低于電針組及關節(jié)腔注射組 （P＜0.05）。

表1　各組大鼠足腫脹度及消腫時間比較（±s）

表1　各組大鼠足腫脹度及消腫時間比較（±s）

與本組治療前比較，△P＜0.05；與對照組治療后比較，▲P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05；與關節(jié)腔注射組比較，*P＜0.05。下同。

組別　n　消腫時間（d）足腫脹度（%）治療前　治療后對照組　10　45.92±3.90 34.21±3.32　13.79±4.78電針組　10　10.33±2.32△▲關節(jié)腔注射組　10　8.54±2.21△▲#47.41±4.33 28.34±3.17△▲48.29±3.88 16.39±2.47△▲#電針+關節(jié)腔注射組　10　6.34±1.49#*46.27±4.03 10.30±1.36#*

2.2各組動物治療前后IL-1β及HA表達水平比較見表2。電針組HA有一定的升高，IL-1β有降低趨勢，但與本組治療前及對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），關節(jié)腔注射組IL-1β明顯降低，HA明顯升高（P＜0.05）；與電針組及關節(jié)腔注射組比較，電針+關節(jié)腔注射組IL-1β明顯降低，HA明顯升高（P＜0.05）。

表2　各組治療前后大鼠HA、IL-1β表達水平比較（±s）

表2　各組治療前后大鼠HA、IL-1β表達水平比較（±s）

組　別　時間　HA（μg/L）　IL-1β（pg/mL）對照組　治療前　1.72±0.35　41.28±5.30 （n=10）　治療后　1.93±0.27　42.50±5.22電針組　治療前　1.68±0.25　39.89±4.53 （n=10）　治療后　1.89±0.24　37.31±3.49關節(jié)腔注射組　治療前　1.70±0.34　41.45±5.20 （n=10）　治療后　0.72±0.09△▲#20.34±2.40△▲#電針+關節(jié)腔注射組　治療前　1.68±0.37　40.73±5.24 （n=10）　治療后　0.49±0.06#*　13.34±1.47#*

2.3各組動物治療前后MMPs表達水平比較見表3。對照組大鼠血清MMPs各指標治療后仍保持在較高水平，與對照組及治療前比較，電針組及關節(jié)腔注射組MMP-1、MMP-9表達水平均降低（P＜0.05）。電針+關節(jié)腔注射組MMP-2、MMP-3、MMP-13均有一定程度降低，但與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MMP-1、MMP-9表達水平則顯著降低，與電針組及關節(jié)腔注射組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3　各組治療前后大鼠MMPs表達水平比較（ng/L，±s）

表3　各組治療前后大鼠MMPs表達水平比較（ng/L，±s）

MMP-10　MMP-13 65.67±5.34 81.31±7.81 61.52±5.39 78.27±7.24 63.65±5.37 82.20±8.02 （n=10）　治療后　76.±6.82△▲　78.9±7.32 60.7±5.39　53.7±5.02△▲　59.2±4.29　79.2±7.29關節(jié)腔注射組　治療前　92.70±8.21　79.21±6.84 61.79±5.57 76.10±7.62　65.01±5.37 80.73±7.71 （n=10）　治療后　70.80±6.81△#▲75.22±6.31 58.30±4.92 44.87±3.68△#▲61.74±5.12 77.27±6.21電針+關節(jié)腔注射組　治療前　91.52±8.72　80.27±7.21 63.27±5.27 77.20±7.42　63.54±5.98 82.79±7.28 （n=10）　治療后　52.81±4.82#*76.20±6.97 59.60±4.29 35.30±2.74#*59.79±5.34 78.27±7.02組別　時間對照組　治療前（n=10）　治療后電針組　治療前MMP-1　MMP-2　MMP-3 93.28±8.76　80.21±7.17 62.72±5.45 89.34±8.07　76.25±6.19 59.35±5.24 94.78±8.87　81.21±7.84 63.79±5.52 MMP-9 79.17±7.62 76.02±6.81 77.10±6.67

3　討　論

威靈仙注射液由毛莨科植物威靈仙干燥根及根莖，經加工提取的滅菌溶液，內含常春藤皂苷元及齊墩果酸等成分，具有消炎抑菌、清熱解毒、強心利尿之功效［6］?！侗静菥V目》記載威靈仙“味微辛咸、通經絡、消痰涎、祛風濕、散癖積，藥性辛散溫通，通行十二經脈，既能祛風濕，又能通經止痹痛”［7］。膝骨關節(jié)炎常出現關節(jié)積液，其病理改變?yōu)殛P節(jié)腔及滑膜炎性浸潤，造成關節(jié)面軟骨被破壞、變性并繼發(fā)滑液炎癥，是關節(jié)軟骨細胞的分解與合成代謝紊亂造成的慢性、退行性關節(jié)疾?。?］。臨床上多發(fā)于35歲以上的中年人，臨床以膝關節(jié)疼痛、變形和活動受限為主要特點，目前治療辦法多以抗炎消腫為主，但療效并不理想［9］。中醫(yī)學認為，當膝關節(jié)因外傷或其他原因受損傷后，局部關節(jié)血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，針灸治療當以舒筋通絡、行氣止痛，中藥內服外敷治療當以活血化瘀、利濕除痹而達到臨床治愈的目的［10］。

研究表明，軟骨細胞外MMPs的病理性降解可導致膝骨關節(jié)炎發(fā)生［11］，MMPs有20多種，但在膝骨關節(jié)炎病理改變則以MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13表達異常增高為主，其中MMP-1、MMP-9是胞外基質降解的主要蛋白水解系統(tǒng)［12］，MMP-1、MMP-9與膝骨關節(jié)炎發(fā)生密切相關［13］，同時，正常的骨關節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1β，當膝骨關節(jié)炎發(fā)生時IL-1β則會異常增高。HA可減少膝關節(jié)炎關節(jié)內PGE2等炎性介質的合成及擴散，減少滑膜的通透性及關節(jié)內滲液［14］。故本實驗研究以MMPs、IL-1β、HA等主要指標評價電針配合威靈仙注射液治療大鼠膝骨關節(jié)炎的影響。

本實驗中選用三陰交、足三里、行間、血海、太沖、陽陵泉等諸穴，是因為陽陵泉可強筋祛濕，主治膝痹；足三里具有養(yǎng)血益氣之功效，主治下肢痿痹；而血海穴主活血，與陽陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡、利通關節(jié)之奇效［15］。實驗數據顯示，電針+關節(jié)腔注射組大鼠MMP-1、MMP-9表達水平、IL-1β及左足趾關節(jié)腫脹率明顯降低，消腫時間明顯低于電針組、關節(jié)腔注射組。這可能與電針刺激可激發(fā)經氣，促進局部血液循環(huán)及局部病變組織新陳代謝，降低痛閾、減輕關節(jié)滑膜表面神經末梢對炎性因子IL-1β刺激的反應敏感度有關，故其關節(jié)腫脹率明顯降低，消腫時間縮短。電針+關節(jié)腔注射組HA較單用電針刺激及威靈仙關節(jié)腔注射組增高明顯，IL-1β進一步降低，這可能是威靈仙吸收后明顯抑制MMP-1MMP-9產生，促使滑膜內襯B型滑膜細胞和單核吞噬細胞大量分泌HA，達到潤滑關節(jié)、延緩軟骨退變及保護關節(jié)軟骨的作用。MMP-1、MMP-9產生降低可減輕MMPs對關節(jié)組織細胞外基質降解，減輕IL-1β對關節(jié)表面軟骨細胞的破壞作用。

綜上所述，電針刺激配合威靈仙注射液膝關節(jié)腔內注射對大鼠膝骨關節(jié)炎有明確的治療作用，促進局部組織血液循環(huán)及新陳代謝，明顯降低MMP-1、MMP-9對關節(jié)組織細胞外基質降解及IL-1β對膝關節(jié)的破壞，延緩關節(jié)軟骨退行性變，提高大鼠對炎癥因子IL-1β等刺激的痛閾，增加HA對膝關節(jié)潤滑及保護作用。

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Experimental Study on Effects of Electroacupuncture Combined with Weilingxian Intra-articular Injection on MMPs and HA in Rats with Knee Osteoarthritis

SUN Jianqin，CHEN Hongying，YAO Zhonghong，et al.Taihe Hospital of Shiyan，Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine，Hubei，Shiyan 442000，China.

【Abstract】Objective：To investigate the effect and mechanism of electro acupuncture combined with Weilingxian intra-articular injection on MMPs and HA in rats with knee osteoarthritis.Methods：40 rats were randomly divided into the control group，electroacupuncture group，Weilingxian group，electroacupuncture plus acupoint injection group.Osteoarthritis animal model was established with the method of intra articular injection of the knee joint.Electroacupuncture group took electroacupuncture below 0.5 cm of Zusanli，Sanyinjiao and Xingjian，Xuehai，Taichong，Yang Ling Quan and the main points for 20 minutes.Weilingxian group took intra-articular injection of Weilingxian.Electroacupuncture plus acupoint injection group received both treatment above.The knee swelling rate and joint swelling time were observed，and the following data was determined by enzyme-linked immunosorbent assay：positive expression level of serum MMPs（MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，MMP-13），IL-1β in articular effusion and the content of HA.Results：Knee joint swelling rate，swelling time of MMP-1，MMP-9 expression levels in electroacupuncture plus point injection group were significantly lower than those of Weilingxian group，and HA was obviously improved（P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of electroacupuncture combined with knee intra-articular injection of Weilingxian on knee osteoarthritis in rats should be related to the inhibition of overexpression of MMPs and the increase the secretion of HA，so as to promote inflammation absorption and delay cartilage degenerative change.

Kneeosteoarthritis；Acupuncture；Acupointinjection；Weilingxian；Matrixmetalloproteinases；Hyaluronic acid

R245.9+7

A

1004-745X（2016）05-0791-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.012

湖北省科技廳項目（2013cfc037）
△

（電子郵箱：2051494669@qq.com）

2016-01-09）