鯽魚溫和氣單胞菌的中藥藥浴組方研究

高桂生，史秋梅，張艷英，高光平，陳丹，韓紅升，黃曉媛，繳寶豐，宋青春

（1.河北科技師范學院河北省預(yù)防獸醫(yī)學重點實驗室，河北秦皇島066600；2.秦皇島糧豐海洋生態(tài)科技股份有限公司，河北秦皇島066600；3河北皓海生物科技有限公司，河北秦皇島066004）

鯽魚溫和氣單胞菌的中藥藥浴組方研究

高桂生1，史秋梅1，張艷英1，高光平1，陳丹1，韓紅升2，黃曉媛2，繳寶豐2，宋青春3

（1.河北科技師范學院河北省預(yù)防獸醫(yī)學重點實驗室，河北秦皇島066600；2.秦皇島糧豐海洋生態(tài)科技股份有限公司，河北秦皇島066600；3河北皓海生物科技有限公司，河北秦皇島066004）

溫和氣單胞菌存在于淡水、土壤、淤泥、污水等環(huán)境中，有時在海水魚類中也可觀察到，世界各地均有分布［1］。該菌能引發(fā)羅非魚、鯉魚、鯽魚等多種魚類［2-6］及其他動物的疾?。?-9］。采用抗生素類化學藥物控制這類疾病會容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性［10-11］。相對而言，用中草藥代替抗生素是水產(chǎn)病害防治中的一個發(fā)展方向［12］。有的研究［13-16］表明，中草藥對嗜水氣單胞菌等有較好的抑菌和殺菌效果。近年來，河北省秦皇島市淡水養(yǎng)殖的鯽魚、泥鰍、羅非魚等有溫和氣單胞菌感染的現(xiàn)象。研究探討了18種中草藥對1株分離自鯽魚病魚體內(nèi)的溫和氣單胞菌的抑菌作用，以期為由溫和氣單胞菌引發(fā)的常見氣單胞菌病防治提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料

18味中藥∶桉樹葉、薄荷、五倍子、大黃、魚腥草、沙棘、石榴皮、甘草、穿心蓮、蘇木、黃柏、馬齒莧、石菖蒲、辣蓼、公丁香、烏梅、黃連、陳皮等均購自安國市神禾藥材飲片有限責任公司。試驗用菌株∶溫和氣單胞菌臨床分離株分離自河北省某養(yǎng)殖場的病死魚，經(jīng)外部形態(tài)特征、生理生化鑒定、感染試驗和16s rRNA基因序列測定等方法鑒定該菌株為溫和氣單胞菌。試驗用魚∶鯽魚來自昌黎縣碣石山市場，試驗前在水族箱中馴養(yǎng)15 d，定時定量喂食和換水。

1.2中藥液制備

取單味中藥生藥100 g，加入500 mL蒸餾水，浸泡1 h后在電爐上小火煮沸30 min，大約剩下濃縮液100 mL，過濾，濃度為1 g/mL，裝瓶備用。

1.3藥物敏感性試驗

采用瓊脂擴散法∶即在營養(yǎng)瓊脂平板上，用無菌棉蘸取溫和氣單胞菌菌液涂抹在營養(yǎng)瓊脂上，再用直徑6 mm的打孔器在培養(yǎng)基上等距離打6個孔，用移液槍移取生藥提取液的各種單味中藥液200 μL，勿使其外溢，每種藥液在平皿內(nèi)做3個孔，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，量出抑菌圈直徑，得出平皿每個單味中藥三個孔的平均值。藥物抑菌試驗判斷標準∶無抑菌環(huán)者為耐藥、抑菌環(huán)直徑在7～10 mm為低度敏感（低敏）、在11～15 mm為中度敏感（中敏）、≥16 mm的為高度敏感（高敏）。

1.4組方治療試驗

將敏感性高的中藥組成組方再次進行藥敏試驗。

組方1∶五倍子、魚腥草、烏梅、石榴皮、公丁香；組方2∶桉樹葉、魚腥草、烏梅、陳皮；組方3∶桉樹葉、五倍子、大黃、烏梅、魚腥草、薄荷。三個組方按比例取中草藥后，按1∶5的比例加水浸泡1 h后在電爐上小火煮沸30 min，大約剩下濃縮液500 mL過濾，裝瓶備用（原藥1 g相當于藥液1 mL）。

人工感染治療試驗∶馴養(yǎng)15 d的鯽魚每10條一組，分為5組，試驗設(shè)對照組，一組為健康對照組（不感染溫和氣單胞菌的鯽魚），二組為感染對照組（感染溫和氣單胞菌，不給藥），三四五組為組方1、組方2和組方3治療組（感染溫和氣單胞菌的鯽魚，然后用藥治療組）。將溫和氣單胞菌接種于普通肉湯中，28℃恒溫培養(yǎng)8～12 h，用一次性注射器，每尾取0.5 mL菌液腹腔注射（細菌含量為2×106/ mL），使其感染溫和氣單胞菌而發(fā)病。試驗分組及處理方法見表1。

表1　試驗分組及處理方法

2　結(jié)果

2.1單味中藥藥敏試驗結(jié)果

實驗結(jié)果顯示∶五倍子、魚腥草、烏梅抑菌作用較強，為高敏；桉樹葉、薄荷、大黃、沙棘、石榴皮、蘇木、公丁香、陳皮有一定抑菌作用，為中度敏感；黃柏、黃連低度敏感；甘草、穿心蓮、馬齒莧、石菖蒲、辣蓼耐藥。各種中草藥抑菌直徑見表2。

2.2三個中藥組方藥敏試驗結(jié)果

表2　各種中草藥抑菌直徑

試驗結(jié)果顯示∶組方1抑菌直徑達18 mm，組方2抑菌直徑達20 mm，組方3抑菌直徑達23 mm。

2.3三個中藥組方藥浴試驗結(jié)果

根據(jù)藥浴組方研究效果，用組方3（藥物濃度均為1∶200）分別潑灑于第三、四、五組感染溫和氣單胞菌的黃顙魚水體，每天定時換水換藥。剩余的一、二2組，定時換水喂食，觀察5組魚的變化情況。感染對照組∶鯽魚注射溫和氣單胞菌后反應(yīng)遲鈍、攝食量減少，嚴重者拒食；眼眶、鰓蓋、鰭及肌肉等部位充血、出血；內(nèi)臟出現(xiàn)各種病變，膽囊腫大，呈墨綠色，肝呈暗褐色，部分試驗魚體出現(xiàn)潰爛。3個組方治療組的病魚也陸續(xù)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、攝食量減少，嚴重者體表潰爛，個別有死亡，但一段時間后陸續(xù)好轉(zhuǎn)，藥浴10 d后，感染魚癥狀消失，沒有發(fā)現(xiàn)死亡，其中以組方3效果最好。3組方藥浴效果見表3。

3　小結(jié)

關(guān)于各單味中草藥抑菌作用與功效∶采用紙片法和中藥打孔法測定了中藥抗菌效果，兩種方法以中藥打孔法效果好，即將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種檢測菌的瓊脂平板上或在孔內(nèi)滴加中藥液，紙片或孔中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片或孔周圍區(qū)域擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片或孔周圍抑菌濃度范圍內(nèi)形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映檢測菌對測定藥物的敏感程度。結(jié)果表明∶五倍子、魚腥草、烏梅抑菌作用較強；桉樹葉、薄荷、大黃、沙棘、石榴皮、蘇木、公丁香、陳皮、黃柏、黃連有一定的抑菌效果。該次試驗通過藥物敏感試驗，確定了各種中草藥對鯽魚溫和氣單胞菌的抑菌效果，文獻［17-18］也有類似報道。

表3　三組方藥浴效果

關(guān)于各單味中草藥組方抑菌作用與功效∶通過五倍子與黃連、大黃等以清熱解毒功效為主的中藥組成復(fù)方治療鯽魚感染的溫和氣單胞菌，再選用抑菌效果較強的中草藥組成藥浴組方對患病鯽魚進行藥浴試驗，得到滿意結(jié)果。資料也表明∶桉樹葉可治感冒、流感、痢疾、腸炎濕疹，還有殺蟲、殺菌等功效。五倍子含大量鞣酸，能凝固蛋白質(zhì)，有較強的殺菌能力，對革蘭陽性細菌和陰性細菌均有抑制作用，可用于防治魚類白頭白嘴病、黏細菌病、氣單胞菌病、假單胞菌病、白皮病、赤皮病、癤瘡病等。大黃抗菌作用強，抗菌譜廣，有收斂、瀉下、增加血小板、促進血液凝固等作用，用于爛鰓病、出血病及白頭白嘴病等［19-20］。烏梅含檸檬酸，具有斂肺、澀腸、生津、安蛔的功效，用于治療久痢滑腸、虛熱消渴、膽道蛔蟲癥。魚腥草對各種微生物生長有抑制作用，能調(diào)節(jié)動物機體本身的防御因素，提高機體免疫力。同時具有鎮(zhèn)痛、止血、抑制漿液分泌、促進組織再生等作用，可用于防治草魚細菌性爛鰓病。黃連有抑菌、消炎、解毒等功能，用于防治細菌性腸炎［21］。由上述單味中藥組成的3個組方對人工感染溫和氣單胞菌的病魚藥浴時均具有較好的臨床效果，與體外抑菌試驗效果一致。但臨床應(yīng)用組方時，應(yīng)該注意中藥濃度、水體環(huán)境以及應(yīng)用療程，以發(fā)揮更好的效果。

桉樹葉、烏梅、五倍子、大黃、魚腥草、薄荷等對鯽魚溫和氣單胞菌有較強抑菌作用，其中藥組方藥浴對人工感染發(fā)病鯽魚有較好的治療效果。

參考文獻：

［1］Janda J M，Abbott S L.Evolving concepts regarding the genus Aeram onas:an expanding Panorama of species，disease presentations and unanswered questions［J］.Clin Infect Dis，1998，27（2）：332-344.

［2］蔡完其，孫佩芳.羅非魚溫和氣單胞菌病的病原研究和藥敏試驗［J］.中國水產(chǎn)科學，2002，9（3）：243-246.

［3］劉敏，韓英.鯉溫和氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2005，36（4）：486-489.

［4］陸文浩，陳輝，黃春貴.異育銀鯽氣單胞菌病原菌鑒定和藥敏試驗［J］.廣東海洋大學學報，2009，29（1）：26-30.

［5］董傳甫，林天龍，陳日升，等.日本鰻鱺敗血腹水病病原研究［J］.水產(chǎn)科學，2002，21（1）：5-8.

［6］蘇應(yīng)兵，鄒桂偉，袁科平.斑點叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定［J］.淡水漁業(yè)，2006，36（5）：37-41.

［7］孫佩芳，蔡完其.中華鱉溫和氣單胞菌病的病原研究［J］.淡水漁業(yè)，1998，28（4）：3-5.

［8］劉金鵬，陳永林，胥哲.黑天鵝溫和氣單胞菌的分離與鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2001，37（5）：56-57.

［9］葉雪平，顧金華，楊廣智.牛蛙溫和氣單胞菌病病原及防治［J］.上海水產(chǎn)大學學報，2000，9（1）：78-80.

［10］張明，王建華，趙毅，等.20味中藥對鰻弧菌的藥敏試驗［J］.動物醫(yī)學進展，2005，26（8）：77-79.

［11］李茜，張懿瑾，華汝泉，等.23種中草藥及復(fù)方對鯽腸道3種細菌的體外抑菌試驗［J］.淡水漁業(yè)，2007，37（4）：7-11.

［12］程志斌，葛長榮，韓劍眾.中草藥有效成分對動物免疫功能的影響及其應(yīng)用［J］.動物科學與動物醫(yī)學，2002，19（1）：16-17.

［13］喻運珍，艾桃山，張萍香，等.嗜水氣單胞菌對4種中草藥和4種抗生素耐藥性的比較研究［J］.內(nèi)陸水產(chǎn)，1999（5）：5-6.

［14］王玉娥，邢晨光，王國良.5種海洋致病性弧菌對34種中草藥敏感性的測定［J］.水產(chǎn)科學，2008，27（5）：221-225.

［15］毛芝娟，卓華龍，楊季芳，等.鋸緣青蟹細菌性傳染病的病原菌研究［J］.臺灣海峽，2001，20（2）：187-192.

［16］金珊，王國良，趙青松，等.海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的鱸魚皮膚潰瘍病的防治藥物［J］.臺灣海峽，2000，19（2）：232-236.

［17］蔡完其，孫佩芳.羅非魚溫和氣單胞菌病的病原研究和藥敏試驗［J］.中國水產(chǎn)科學，2002，9（3）：243-246.

［18］張海濱，張書霞.溫和氣單胞菌對10種中草藥耐藥性的初步研究［J］.信陽師范學院學報，2003，16（1）：39-41.

［19］溫周瑞，劉慧集，駱敏，等.中草藥對水產(chǎn)動物免疫作用研究進展［J］.水利漁業(yè)，2004（2）：1-3.

［20］王權(quán)，謝獻勝.中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治上的應(yīng)用［J］.水產(chǎn)科技情報，2006，33（4）：163-165.

［21］呂永輝，王玉堂.漁藥中的中草藥［J］.中國水產(chǎn)，2006（7）：92-94.

資助項目∶河北省科技廳獎勵性后補助項目（15926620H）；秦皇島市科技局科技支撐計劃（201401A067，201402B043）
作者簡介∶高桂生（1964-），男，副教授，碩士，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病防治.E-mail∶Ggs1964@163.com
通信作者∶史秋梅（1965-），女，教授.E-mail∶shiqiumei@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2016.03.016

收稿日期：（2015-09-03）