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    甲型副傷寒沙門氏菌cdtB亞基的原核表達(dá)及對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響

    2016-08-25 01:51:09陳鴻鵠吳圓圓梅玲玲
    關(guān)鍵詞:阻斷劑副傷寒沙門氏菌

    陳鴻鵠,吳圓圓,占 利,梅玲玲

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    甲型副傷寒沙門氏菌cdtB亞基的原核表達(dá)及對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響

    陳鴻鵠1,吳圓圓2,占利1,梅玲玲1

    目的研究甲型副傷寒沙門氏菌感染過程中,cdtB對(duì)宿主巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子的影響。NF-κB信號(hào)通路阻斷劑對(duì)cdtB誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。方法對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌cdtB亞基進(jìn)行原核表達(dá),制備并模型純化重組蛋白,建立其刺激人THP-1巨噬細(xì)胞模型,ELISA檢測THP-1分泌IL-6,IL-8和TNF-α等細(xì)胞因子。在共培養(yǎng)體系中加入NF-κB 信號(hào)通路阻斷劑,ELISA檢測THP-1分泌IL-6,IL-8和TNF-α等細(xì)胞因子。結(jié)果成功構(gòu)建甲型副傷寒沙門氏菌cdtB原核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)并純化重組cdtB蛋白,與空白對(duì)照相比,受到cdtB刺激的THP-1細(xì)胞上清中的IL-6,IL-8和TNF-α濃度顯著上升,而在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50可以顯著抑制重組cdtB誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α分泌。結(jié)論甲型副傷寒沙門氏菌cdtB能夠通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α,在甲型副傷寒相關(guān)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進(jìn)作用。

    甲型副傷寒沙門氏菌; cdtB;細(xì)胞因子;巨噬細(xì)胞

    甲型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiA)引起的甲型副傷寒是常見的腸道傳染病,被列為國家重點(diǎn)監(jiān)測的13種傳染病之一。近年來,傷寒和副傷寒的總發(fā)病率一直保持穩(wěn)定,但是其中甲副傷寒的發(fā)病比例顯著增高[1-2]。 可見,甲型副傷寒沙門氏菌已替代傷寒沙門氏菌成為優(yōu)勢(shì)致病菌。在感染急性期,傷寒和甲副傷寒病人血清中炎癥因子IL-6,IL-8和TNF-α顯著升高[3]。但是,甲型副傷寒沙門氏菌或甲型副傷寒沙門氏菌的組分如何導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥的機(jī)理還有待闡明。

    細(xì)胞致死性腫脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)是首先發(fā)現(xiàn)于空腸彎曲桿菌的一種外毒素,重組的空腸彎曲桿菌CDT具有類DNA酶的作用,能損傷巨噬細(xì)胞DNA,而使得細(xì)胞周期停滯,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞腫脹、凋亡。CDT由cdtA、 cdtB和cdtC 3種多肽組成,其中,cdtB引起染色體DNA降解,cdtA和cdtC運(yùn)送cdtB進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。 傷寒沙門氏菌只表達(dá)cdtB,不表達(dá)cdtA和cdtC,由于傷寒沙門氏菌可以被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞到胞內(nèi),傷寒沙門氏菌可以直接在胞內(nèi)致死宿主細(xì)胞[4]。伴放線桿菌CDT可以直接介導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子[5]。巨噬細(xì)胞是病原菌引發(fā)的炎癥反應(yīng)的核心,通過抗原提呈和釋放炎癥細(xì)胞因子激活宿主固有免疫系統(tǒng),巨噬細(xì)胞在宿主控制和清除沙門氏菌感染的過程中發(fā)揮了重要作用[6]。甲型副傷寒沙門氏菌攜帶編碼cdtB的基因cdtB(GenBank accession No.: NC_006511.1),不攜帶cdtA和cdtC。本研究對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌cdtB亞基進(jìn)行原核表達(dá),制備并模型純化了重組蛋白并建立其刺激人THP-1巨噬細(xì)胞模型。利用ELISA等檢測細(xì)胞因子的分泌水平,從細(xì)胞水平上研究甲副傷寒沙門氏菌cdtB亞基對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-6,IL-8和TNF-α的影響。

    1 材料與方法

    1.1菌株來源和培養(yǎng)甲型副傷寒沙門菌參考標(biāo)準(zhǔn)株(CMCC 50001)由本實(shí)驗(yàn)室保存,采用營養(yǎng)肉湯(Oxoid)培養(yǎng)。

    1.2cdtB基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定采用細(xì)菌基因組DNA制備試劑盒(Axygen)提取甲型副傷寒沙門菌CMCC 50001株基因組DNA,分光光度法測定其濃度。PCR擴(kuò)增全長cdtB基因(GenBank accession No. NC_006511.1),引物序列如下:上游 5′-CGC CAT ATG (NdeI) AAAAAACCTGTTTTTTTCCT-3′,下游 5′-CGC CTC GAG (XhoI) ACAGCTTCGTGCCAAAAAGG-3′。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。采用1 μg/mL溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)cdtB基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMDl9-T形成重組質(zhì)粒pMDl9-TcdtB,委托上海Invitrogen公司測序。pMDl9-TcdtB和表達(dá)載體pET42a(Novagen)分別用NdeI(TaKaRa)和XhoI(TaKaRa)雙酶切,瓊脂糖電泳分離酶切片段后切膠回收目的片段。在T4 DNA連接酶(TaKaRa)作用下,將cdtB基因片段與線性化pET42a連接后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21DE3 (Novagen)形成E.coliBL21DE3pET42a-cdtB表達(dá)重組cdtB。用10%分離膠的SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢查重組cdtB的表達(dá)情況,Ni-NTA親和層析柱(BioColor)提純重組cdtB。

    1.3去除重組cdtB中的LPS為了避免大腸桿菌表達(dá)得到的重組cdtB中可能出現(xiàn)的大腸桿菌LPS污染,本研究通過Detoxi-Gel內(nèi)毒素去除膠(Thermo Scientific, USA)去除重組cdtB中的LPS。為了檢測LPS是否完全去除,我們利用鱟試劑檢測重組cdtB,重組cdtB稀釋到不同濃度,各取100 μL加入等量鱟試劑,37 ℃孵育1 h。倒置試管,內(nèi)容物凝固不能從管壁滑落為陽性結(jié)果;內(nèi)容物從管壁滑落為陰性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中,無熱原水作為陰性對(duì)照,大腸桿菌LPS (Invivogen, USA)作為陽性對(duì)照。

    1.4人單核分化巨噬細(xì)胞THP-1的分化與培養(yǎng)THP-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(1×106細(xì)胞/孔,2 mL每孔),于37 ℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)過夜使成單層細(xì)胞。THP-1細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前加入終濃度為50 ng/mL佛波酯(PMA)刺激分化48 h,使之分化為巨噬細(xì)胞。

    1.5重組cdtB蛋白刺激人單核分化巨噬細(xì)胞THP-1在經(jīng)過PMA處理的THP-1(105/mL)的培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0.1,1和10 μg/mL的重組cdtB,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,收集上清,ELISA(ebioscience)檢測上清中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度。本實(shí)驗(yàn)中,不外加重組cdtB的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為空白對(duì)照。

    1.6NF-κB信號(hào)通路阻斷研究 為了研究NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)重組cdtB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響,20 μmol/L NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50 (Tocris Bioscience, USA) 加入經(jīng)過PMA預(yù)處理的THP-1細(xì)胞(2×10/孔)培養(yǎng)基中,1 h后用1 μg/mL重組cdtB刺激THP-1細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,收集上清,ELISA檢測培養(yǎng)上清中的IL-6、IL-8和TNF-α的濃度。本實(shí)驗(yàn)中,不外加NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50和重組cdtB的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為空白對(duì)照,重組cdtB刺激的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陽性對(duì)照。

    1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定甲型副傷寒沙門菌CMCC 50001株基因組DNA中可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的cdtB基因片段(圖1)。測序及序列分析結(jié)果顯示,與GenBank中甲型副傷寒沙門菌ATCC26695株cdtB基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為97.62%和99.82%。

    M: DNA marker; Lane 1: Blank control; Lane 2: Amplification fragments of cdtB gene from S.para CMCC 50001 strains.圖1 甲型副傷寒桿菌CMCC 50001株cdtB基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR result of cdtB gene from S.para CMCC 50001 strains

    2.2重組cdtB的表達(dá)及提純效果在IPTG誘導(dǎo)下,E.coliBL21DE3pET42a-cdtB能夠高效表達(dá)重組cdtB,該重組蛋白以可溶的形式存在。利用Ni-NTA親和層析法提純重組cdtB蛋白,SDS-PAGE結(jié)果顯示,重組cdtB蛋白在膠上表現(xiàn)為單一的蛋白條帶(圖2)。

    M: protein marker; Lane 1: Blank control (wild-type pET42a). Lane 2 and 3: The expressed and purified SPA-rCdtB protein, respectively.圖2 甲型副傷寒桿菌CMCC 50001株重組CdtB表達(dá)和提純效果Fig.2 Effects of rCdtB expression and purification effects of S.para CMCC 50001 strains

    2.3重組cdtB對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影為了研究重組cdtB對(duì)巨噬細(xì)胞的促炎作用,我們用不同濃度的重組cdtB(0.1 μg/mL,1 μg/mL和10 μg/mL)刺激THP-1細(xì)胞。24 h后,ELISA檢測培養(yǎng)上清中的IL-6、IL-8和TNF-α。結(jié)果顯示,與沒有受到重組cdtB刺激的對(duì)照組相比,受到cdtB刺激的THP-1細(xì)胞上清中IL-6,IL-8和TNF-α濃度上升,并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(t=4.13,P<0.05)。不同刺激時(shí)間(h)對(duì)上清中IL-6,IL-8和TNF-α濃度影響的研究結(jié)果顯示,上清中的IL-6濃度在6~12 h間顯著上升(t=4.38,P<0.05),約在24~48 h時(shí)到達(dá)峰值。IL-8的分泌在2~6 h開始顯著升高(t=6.07,P<0.05),約在24~48 h時(shí)到達(dá)峰值。TNF-α的表達(dá)在2~6 h間顯著上升(t=3.78,P<0.05),約在12~24 h時(shí)到達(dá)峰值(圖3)。

    圖3 不同濃度重組CdtB對(duì)THP-1細(xì)胞因子分泌的影響Fig.3 Ability of rcdtB proteins to induce IL-6, IL-8 and TNF-α in THP-1 cells

    2.4NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)重組cdtB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-8、TNF-α分泌的影響在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NF-α信號(hào)通路阻斷劑SN50,1 h后用重組cdtB刺激THP-1細(xì)胞,24 h后,ELISA檢測培養(yǎng)上清中的IL-6、IL-8和TNF-α。結(jié)果顯示,與沒有加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑的陽性對(duì)照組相比,在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50可以顯著抑制重組cdtB誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α分泌(t=2.41,P<0.05)(圖4)。

    圖4 NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)重組cdtB誘導(dǎo)THP-1分泌細(xì)胞因子的影響Fig.4 Influence of NF-κB signaling pathways inhibitor in rcdtB inducing IL-6, IL-8 and TNF-α

    3 討 論

    宿主對(duì)抗傷寒或甲型副傷寒沙門氏菌感染的特點(diǎn)是釋放促炎細(xì)胞因子,LPS被認(rèn)為是傷寒和甲型副傷寒沙門氏菌的主要促炎組分。但是大多數(shù)傷寒病人血清中不能檢測到內(nèi)毒素的存在,同時(shí),傷寒沙門氏菌LPS耐受的動(dòng)物模型在受到傷寒沙門氏菌攻擊時(shí),還是表現(xiàn)傷寒熱的癥狀,說明傷寒和甲型副傷寒沙門氏菌LPS不是唯一促炎組分。傷寒和甲型副傷寒沙門氏菌的其他組分,如鞭毛蛋白,菌毛等也能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌促炎因子[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn),甲型副傷寒沙門氏菌重組cdtB能促使巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α,通過使用Detoxi-Gel內(nèi)毒素去除膠處理重組cdtB,這些促炎細(xì)胞因子的釋放可以排除LPS污染的可能性。TNF-α是早期反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子,IL-6和IL-8是炎癥反應(yīng)中重要的趨化因子,可以趨化和激活多種特異和非特異性的免疫細(xì)胞,從而激活宿主固有免疫系統(tǒng)[9-10]。這與以往的李鐵民報(bào)道的傷寒沙門氏菌能使人巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的結(jié)果是一致的[11]。

    NF-κB信號(hào)通路是調(diào)控促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的主要信號(hào)通路,NF-κB信號(hào)通路通過級(jí)聯(lián)信號(hào)放大和NF-rd3的表達(dá),可以輔助促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。本研究通過NF-κB信號(hào)通路阻斷劑,證明甲型副傷寒沙門氏菌重組cdtB主要通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α。但是,NF-κB信號(hào)通路阻斷劑不能完全阻斷甲型副傷寒沙門氏菌重組cdtB誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α,這結(jié)果說明,甲型副傷寒沙門氏菌重組cdtB可能還通過其他信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子。

    我們的研究結(jié)果證明,甲型副傷寒沙門氏菌致死性腫脹毒素能夠通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α,在甲型副傷寒相關(guān)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了促進(jìn)作用。

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    Cloning and expression of recombinantSalmonellaparatyphiA cytolethal distending toxin proteins and its effect on cytokine production by human monocyte-derived macrophages

    CHEN Hong-hu1, WU Yuan-yuan2, ZHAN Li1, MEI Ling-ling1

    (1.DepartmentofMicrobiology,ZhejiangProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310051,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,theChildren'sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China)

    To investigate the role ofSalmonellaparatyphiA cytolethal distending toxin (CDT) in pro-inflammatory cytokines induction in macrophages, we cloned and expressed cdtB, a subunit of CDT fromSalmonellaparatyphi(S.paratyphi) A inEscherichiacoli, and purified the recombinant cdtB proteins (SPA-rcdtB) to homogeneity by Ni-NTA affinity chromatography. By co-cultured SPA-rcdtB with human monocyte-derived macrophages (THP-1) and detected IL-6, IL-8 and TNF-α in supernatant by ELISA, we determined if SPA-rcdtB were able to induce human monocyte-derived macrophages to produce cytokines. In addition, NF-κB inhibitor SN50 was used to research the effect of NF-κB signaling pathways in SPA-rcdtB induced macrophage IL-6, IL-8 and TNF-α secretion. In this study, we proved that the cdtb gene segment amplified fromS.paratyphiA CMCC 50001 strains showed high nucleotide and amino acid sequence identities (97.62% and 99.82%) compared withcdtbgene in the GenBank (GenBank accession No. NC_006511.1). And the SPA-rcdtB were able to induce the synthesis by THP-1 of interleukin-6, IL-8 and TNF-α, and the IL-6, IL-8 and TNF-α induction by SPA-rCdtB was significantly suppressed by NF-κB inhibitor. This result indicated that SPA-rcdtB plays a promoting role inflammatory response associated with SPA infection.

    SalmonellaparatyphiA; cytolethal distending toxin; cytokines; macrophages.

    Supported by the grants from the Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Provention (No. 2013-11)

    Mei Ling-ling, Email: llmei@cdc.zj.cn

    梅玲玲,Email:llmei@cdc.zj.cn

    1. 浙江省疾病預(yù)防控制中心微生物所,杭州310051;2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中心,杭州310003

    R378.2

    A

    1002-2694(2016)06-0535-04

    2015-11-13;

    2016-03-30

    DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.006

    浙江省疾病預(yù)防控制中心青年科技項(xiàng)目(No.2013-11)資助

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