利用不確定度評定對改進后水產品中喹乙醇的檢測方法進行確證研究

張惠峰，閆先春，甄　昕

(長春市水產品質量安全檢測中心，吉林 長春 130033)

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利用不確定度評定對改進后水產品中喹乙醇的檢測方法進行確證研究

張惠峰，閆先春，甄昕

(長春市水產品質量安全檢測中心，吉林 長春 130033)

建立了水產品中喹乙醇測定的改進方法。改進了前處理方式，樣品用熱水提取后，經硅藻土和正己烷凈化，并對色譜條件進行優(yōu)化，從而提高檢測效率。結果表明，改進后的方法高效簡易、靈敏準確，在4個不同基質樣品的2個加標水平下的平均回收率為77.2%～87.0%，相對標準偏差為0.4%～6.3%，檢出限10 μg/kg，定量限30 μg/kg 。建立了不確定度評定數學模型，通過計算和分析測量過程中各不確定度，對方法和測試條件進行確證。測量系統(tǒng)相對不確定度小于8%，主要受測量過程的隨機效應、標準曲線擬合、回收率等因素影響。該方法高效便捷、準確可靠、快速且節(jié)約成本，適用于水產品中喹乙醇的檢測。此外，本研究對利用不確定度評定進行檢測方法確證有十分重要的指導意義。

喹乙醇；不確定度；水產品；檢測；確證

喹乙醇(Olaquindox，OLA)又名喹酰胺醇、快育靈、倍育諾等，屬喹喔啉類抑菌促生長劑[1-2]，被廣泛應用于水產品養(yǎng)殖業(yè)[3-6]。因喹乙醇具有光敏毒性[7]、致突變和致癌作用[8-12]，國家已明令禁止在水產養(yǎng)殖中使用喹乙醇[13]。目前國內外對水產品中喹乙醇的檢測主要采用高效液相色譜法、高效液相串聯質譜法等。水產品中喹乙醇殘留量檢測行業(yè)標準[14]實際回收率極低[15]。于慧娟、艾曉輝等[16-17]采用熱水提取后去凈化后高效液相色譜法測定喹乙醇，操作簡單，但檢出限高。田強兵[18-20]等采用有機溶劑提取凈化濃縮后高效液相色譜法測定喹乙醇，操作復雜，所需耗材昂貴。曾靜等[21-22]采用高效液相串聯質譜法測定喹乙醇，方法檢出限低，但所用儀器設備昂貴，適應范圍受限。本研究的檢測方法，與原國家頒布的行業(yè)標準方法相比，操作較簡便，使用的有機試劑較少，方法檢出限低，準確度較高，樣品回收率可達85%左右。本方法不僅降低了檢測成本，還縮短了檢測時間，可廣泛適用于水產品中喹乙醇的定量檢測分析。

測量不確定度對于方法的確認、檢測過程重點因素質控、能力驗證、檢驗結論意見解釋等都有著十分重要的意義，因此在水產品安全檢測等各領域越來越受到重視[23-26]，但尚未有利用不確定度評定對新檢測方法進行確證的報道。本文依據不確定度評定的基本方法、程序[27-30]，建立了本方法的測量不確定度數學模型，首次利用不確定度評定對檢測新方法進行了確證，并通過對各不確定度分量的計算分析，確定該測量系統(tǒng)是否滿足需要，以及測量系統(tǒng)所需要的環(huán)境、儀器、試劑等因素是否具有所需要的統(tǒng)計特性，進一步發(fā)現顯著影響因素，從而不斷改進方法以提高檢測質量，以期為指導利用不確定度評定進行方法確證和證實及日常檢測工作的不確定度評定和結果質量控制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

喹乙醇標準品(純度99%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；硅藻土(Celite545)：美國Sigma-Aldrich公司；甲醇(色譜純)：美國Fisher公司；試驗用水均符合GB/T 6682一級水的要求，其余試劑均為國產分析純。水產品樣品：購于長春東北亞物流有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜儀(配紫外檢測器和自動進樣器)：美國Agilent公司；TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；TE212-L電子天平：德國 Sartorius公司；Research plus可調量程移液器：德國Eppendorf公司；XS205分析天平：瑞士Mettler公司。

1.3試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：精密稱取喹乙醇標準品10.0 mg，用少量水溶解。用甲醇定容于100 mL棕色容量瓶中，質量濃度為100 μg/mL，避光冷藏保存。標準使用液，現配現用。

1.3.2 樣品提取

稱取試樣10 g(精確到0.01 g)置于50 mL離心管中，加入硅藻土1 g，準確加入10 mL水，渦旋振蕩2 min，60℃恒溫水浴振蕩提取15 min，全程注意避光，以4 000 r/min離心5 min，將上清液倒入另一個50 mL離心管中，再向殘留物中加入10 mL水，同上操作，合并上清液，混勻。

1.3.3凈化

取2 mL提取液于5 mL離心管中，加入正己烷2 mL，漩渦振蕩2 min，靜置分層。棄去正己烷相，再加入正己烷2 mL，重復上述操作。取水相層，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(ZORBAX Eclipse XDB 150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(15∶85 ，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：380 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

2　結果與分析

2.1 喹乙醇色譜圖

按色譜條件進行分析，喹乙醇與干擾物質完全分離，峰形良好。喹乙醇標準色譜圖見圖1。

2.2 提取凈化與上機檢測

依據喹乙醇微溶于熱水、難溶于冷水、不溶于一般有機溶劑及對熱穩(wěn)定在70～90℃經30 min無變化的特性，采用熱水做提取劑，60℃振蕩提取15 min。提取過程中加入硅藻土，能均勻分散基質且有效去除提取液中的很多雜質。處理后的提取液經正己烷脫脂，經微孔濾膜過濾后可直接上機。使用ZORBAX Eclipse XDB 150 mm×4.6 mm色譜柱，優(yōu)化色譜條件，減少了色譜測定時間。喹乙醇見光分解速度很快，試驗全過程需要避光。該方法操作簡便，有效縮短了試驗時間，從而避免喹乙醇在檢測過程中見光分解，提高了回收率，滿足水產品中殘留檢測的要求。

2.3 不確定度評定數學模型建立及來源分析

不確定度的來源主要包括曲線校準過程(標儲液定容、標液稀釋、最小二乘法曲線擬合)、樣品質量、試樣定容、儀器測試、測試過程隨機效應及平均回收率校正結果引入的不確定度等。本研究依據相對標準不確定度小于0.006時可忽略不計的原則(結果保留2位有效數字，故擴展不確定度最小為1μg/kg。另考慮數據修約，當擴展不確定度小于0.50μg/kg時可視為0μg/kg，故當測試結果在38～45μg/kg時，相對標準不確定度小于0.006時可忽略不計)，通過對各不確定度分量的計算，分析測量系統(tǒng)所需要的環(huán)境、儀器、試劑等因素的測試要求。2.4 曲線校準引入的不確定度評定和線性范圍、檢出限的確證

2.4.1曲線校準引入的相對標準不確定度u(cal)rel

u(cal)rel主要來源于標準儲備液制備、標準溶液稀釋過程及曲線擬合。

1)標儲溶液配制引入的相對不確定度uVsrel及標準物質確證

原始標準物質引入的不確定度為B類評定：據標準物質(純度99%)證書給出的擴展不確定度Up=0.01，包含因子k=2，得up=Up/k=0.005，即標準物質的相對不確定度uprel=up/p=0.005 1。故由原始標準物質引入的不確定度可忽略不計，所用標準物質滿足方法要求。依據相對標準不確定度小于0.006時可忽略不計的原則，計算得，原始標準物質純度大于83%時，所引入相對標準不確定度均可忽略。

標儲溶液配制相對不確定度合成為uVsrel==0.006 1。若標儲溶液配制時使用B級容量瓶定容引入相對標準不確定度為0.001 2，對最終結果影響不大。如溫度變化范圍為9℃時，標儲定容時因溫度引入的相對標準不確定度為0.006 2，故在檢測過程中控制溫度范圍為12～28℃較為適宜。

2)標準溶液稀釋引入的相對標準不確定度uVWrel

表1　量器校準引入的不確定度

注：所使用定容容量瓶均為A級。

Note：Volumetric flasks used were A-levels.

表2　環(huán)境溫度變化引入的不確定度

3)標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度u(xpred)rel

配制喹乙醇的5個不同質量濃度標準溶液(5、10、50、100、500 ng/mL)，采用最小二乘法擬合相應的峰面積A。線性回歸方程為Y=0.051 252 9X+0.018 933 6(Y=bX+a，a為截距，b為斜率)，方程的線性相關系數為，r=0.999 99，詳見表3。

表3　 喹乙醇標準曲線測定結果

用最小二乘法擬合的標準工作曲線引入的相對不確定度為A類評定，計算公式見式(2)。

4)曲線校準過程引入的相對標準不確定度合成

2.4.2 線性范圍確證

利用相關系數法對該回歸方程的線性進行檢驗：查相關系數檢驗表得r =0.917，因為r=0.999 99>0.917= r(0.01，n=6)，且殘余標準誤差小于0.05(s=0.048 70)，故該曲線各點擬合較好，線性相關關系特別顯著。

2.4.3 方法檢出限確證

根據高若梅[34]等對分析方法的檢出限和測定下限的研究，通過對5 ng/mL標準溶液測定21次，獲得目標峰與4.500～6.500 min信號的平均信噪比的S/N=2.9，按稱樣量10.00 g，經換算(式1)得方法檢出限為10μg/kg，結合平均回收率統(tǒng)計得本方法的定量限為30 μg/kg 。

表4　 信噪比

2.5樣品質量引入的相對標準不確定度umrel

使用賽多利斯TE212-L電子天平(Ⅲ級天平，最大允許誤差為±0.05 g)，稱量10.00 g樣品。按照均勻分布計算得um=0.0289g，相對標準不確定度為umrel=0.0029，為B類評定。由樣品稱量引入的相對不確定度遠小于0.006，可忽略不計。

2.6 測試過程隨機效應導致的不確定度和回收率、精密度確證

表 5　樣品試驗結果

2.6.2 方法回收率和精密度

分別稱取大黃魚(Larimichthyscrocea)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)陰性樣品各2份于離心管中，加標進行方法的精密度和回收率測定，結果見表6。 本方法在2個不同添加水平的平均回收率為82.7%，對應的平均相對標準偏差為4.7%。精密度和回收率均滿足水產品中喹乙醇的測定要求。采用本方法對長春市流通市場及產地水產品的69份樣品進行了測定，均未檢出喹乙醇。

表 6 　回收率和精密度試驗結果

根據美國ASTMCS94制定的測試性能指標評價法評價本方法的精密度。據相關質量控制規(guī)范[35-36]及標準方法要求，查CV≤15%，則經計算r=0.124 1，Lsd=0.039 02，得TPIr=0.89，則當0.7

TPIr=Lsd/Sr

(3)

2.8 由定容體積引起的相對標準不確定度uVrel

樣品使用10 mL移液器加入20 mL水定容，計算過程同uVWrel。20℃時10 mL移液器容量允許誤差為±0.6%，由環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變極其微小，故不考慮。則由定容體積引起的相對不確定度合成為uVrel=0.004 9。該相對不確定度小于0.006，可忽略不計。

2.9由液相色譜儀引入的不確定度uuvwrel

由液相色譜儀引入的不確定度為B類評定：查儀器檢定證書得整機定量重復性RSD6%=0.12，得uuvwrel=0.001 2。該部分引入的相對不確定度遠小于0.006，在不確定度評定時可忽略不計。

2.10 合成不確定度及擴展

2.11測量結果報告

2.12各影響因素的不確定結果

各影響因素的不確定結果見表7。

表 7　各影響因素的不確定度結果

3　結論

1)改進方法以水為提取劑，經硅藻土和正己烷凈化后用反相高效液相色譜法測定水產品中喹乙醇，節(jié)省部分檢測時間和有機試劑，高效便捷、安全環(huán)保。經驗證，方法的線性范圍、檢出限、精密度、加標回收率等均滿足水產品中喹乙醇的測定要求，檢測結果準確可靠。

2)該方法不確定度評定模型的建立，對于不確定度評定和質量控制工作具有十分重要的指導意義。在評估過程中，對測量系統(tǒng)所需要的環(huán)境、儀器、試劑等因素的統(tǒng)計特性進行了分析，發(fā)現測量過程的隨機效應、標準曲線擬合、樣品回收率等因素對測量系統(tǒng)有顯著的影響。日常進行不確定度評定時，可根據情況不考慮稀釋標液時的溫度、樣品質量稱量、定容體積及液相色譜儀等引入的不確定度。

3)通過對各不確定度分量的評估，進一步確證該測量系統(tǒng)的測定要求。因此建議在實際操作過程中全程注意避光，試驗應使用純度較高的喹乙醇標準物質(至少應大于83%)；稱量標準物質時應使用檢定等級為I級的分析天平；溶液制備過程中應使用精度較高的A級器皿進行溶液的移取和定容；在檢測過程中控制溫度范圍為12～28℃較為適宜；應增加平行樣品的測定次數并根據預估值選擇適當的工作曲線線性范圍。

4)根據t檢驗判斷平均回收率與1.0有顯著性差異，檢測結果必須經過修正；此外應不斷熟悉樣品處理過程以提高檢測結果的準確性和可靠性且增加平行樣的測定次數，盡量選擇適當的工作曲線線性范圍。

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Evaluation of uncertainty was used to verify a new improved detection method on Olaquindox in aquatic products

ZHANG Huifeng，YAN Xianchun，ZHEN Xin

(Changchun Inspection Center for Aquatic Products Safety and Quality，Changchun 130033，China)

An improved method was established for the detection of Olaquindox in aquatic products.An improved pre-treatment method was used in this study.The samples were extracted with hot water and separated by diatomite and n-Hexane，and the chromatographic parameters were optimized，so detection efficiency was raised significantly.The results showed that the average recoveries at two different samples and four different spiked levels was 77.2%～87.0%，the relative standard deviation of 0.4%～6.3%，the detection limit 10 μg/kg，the limit of quantification 30 μg/kg.A mathematical model of uncertainty evaluation was established.Reliability and test conditions were verified by uncertainty analysis and calculation.Relative uncertainty of this method was less than 8%，which was affected by random effect and calibration curve and recovery.This method is not only simple,sensitive and accurate，but also rapid and cost savings，so it is very suitable for the determination of Olaquindox in aquatic products.This study that uncertainty evaluation is used to verify the detection method is very important.

Olaquindox；uncertainty；aquatic products；detection；verify

2016-05-27

長春市水產品質量安全風險評估專項(2014-1485).

張惠峰(1982-)，女，助理研究員，碩士，主要從事水產品質量安全及水環(huán)境研究. E-mail：xiaoqiutong@126.com

TS

A

1006-5601(2016)03-0244-10

張惠峰，閆先春，甄昕.利用不確定度評定對改進后水產品中喹乙醇的檢測方法進行確證研究[J].漁業(yè)研究，2016，38(3)：244-253.