一種快捷的單細(xì)胞藻類計(jì)數(shù)方法
——運(yùn)用Photoshop軟件分析細(xì)胞顯微圖像輪廓

李茉莉，喬　琨

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

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一種快捷的單細(xì)胞藻類計(jì)數(shù)方法
——運(yùn)用Photoshop軟件分析細(xì)胞顯微圖像輪廓

李茉莉1，喬琨2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

細(xì)胞計(jì)數(shù)是藻類培養(yǎng)、赤潮調(diào)查和環(huán)境監(jiān)測中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本文設(shè)計(jì)并測試了一種單細(xì)胞藻類計(jì)數(shù)方法：利用體視顯微鏡及配套的CCD數(shù)字成像系統(tǒng)，獲取固定體積樣品的全視野圖像，運(yùn)用Photoshop軟件對細(xì)胞顯微圖像輪廓進(jìn)行分析計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞粒徑差異，實(shí)驗(yàn)選取5種代表性單細(xì)胞藻類，分別采用新方法和顯微鏡計(jì)數(shù)法對其進(jìn)行細(xì)胞密度測定。研究結(jié)果表明，新方法在測定亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)時(shí)，結(jié)果較顯微鏡計(jì)數(shù)明顯偏低。而在測定東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和血紅哈卡藻(Akashiwosanguinea)時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果非常接近，較可信。其計(jì)數(shù)結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果具有較好的線性相關(guān)性(R2≥0.981 1，P<0.01)。新方法能夠有效測定粒徑15 μm以上純種或混合培養(yǎng)的單細(xì)胞藻類的生物量，簡化了測定程序的同時(shí)，減少了人為誤差，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

單細(xì)胞藻類；藻類計(jì)數(shù)方法；Photoshop軟件分析；細(xì)胞顯微圖像輪廓

在微藻培養(yǎng)和赤潮監(jiān)測中，一般需要定時(shí)定點(diǎn)分析生物量來確定細(xì)胞生長狀態(tài)及增殖情況。隨著科技的進(jìn)步，目前生物量測定的方法很多，包括顯微鏡計(jì)數(shù)法[1-2]、葉綠色a含量測定法[1-3]、可見分光光度法[4]、熒光分光光度法[5-8]、流式細(xì)胞顯微計(jì)數(shù)法[9-11]、庫爾特計(jì)數(shù)法[11]等。胡先文、侯建軍等先后探討過不同計(jì)數(shù)方法衡量某一種類微藻生物量的可行性[4，11-13]。然而，因微藻種類不同、形態(tài)多樣、細(xì)胞大小、不同生長階段細(xì)胞組分變化(如葉綠素含量)、甚至地域差異[14]，很難有一種計(jì)數(shù)方法適合所有微藻。顯微鏡計(jì)數(shù)是較常用、最經(jīng)典的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，是微藻生物量測定的基本方法，也是確定其他測定方法有效性的依據(jù)。但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，存在一定的人為誤差，不適合分析大批量樣品[13]。

因此，本實(shí)驗(yàn)在顯微鏡計(jì)數(shù)基礎(chǔ)上，針對細(xì)胞的顯微圖像輪廓，設(shè)計(jì)并測試了一種單細(xì)胞藻類計(jì)數(shù)的新方法。利用體視顯微鏡及配套的CCD數(shù)字成像系統(tǒng)，獲取固定體積樣品的全視野圖像，運(yùn)用Photoshop軟件，對細(xì)胞顯微圖像輪廓進(jìn)行分析計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞粒徑差異，選取5種代表性單細(xì)胞藻類，采用新方法和顯微鏡計(jì)數(shù)法分別計(jì)數(shù)，分析兩種計(jì)數(shù)方法之間的差異，并探討了新方法的可行性及應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1藻種

實(shí)驗(yàn)用5種藻株由近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廈門大學(xué))海洋微型藻類保種中心(CCMA)提供。包括：亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和血紅哈卡藻(Akashiwosanguinea)。

1.2方法

5種藻株皆用K培養(yǎng)基[15]培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度23℃，鹽度30，光照強(qiáng)度60 μE/(m2·s)和光暗周期14 h∶10 h。當(dāng)細(xì)胞生長至指數(shù)期時(shí)，將藻液放在振蕩器上搖勻后開始取樣，測試濃度梯度分別為：20%、40%、60%、80%、100%，分別用新方法和顯微鏡計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞測定。其中，新方法和顯微鏡計(jì)數(shù)的樣品用2%的Lugol's固定劑固定。樣品稀釋采用滅菌海水。

1.2.1新方法

1)制備樣品全視野圖像

樣品分析前先在振蕩器上充分搖勻，取0.1 mL滴在1 mL無分格浮游植物計(jì)數(shù)框上，加上蓋玻片，細(xì)胞在計(jì)數(shù)框上平鋪，近均勻分布，少粘連、重疊。同時(shí)因樣品體積較小，會在計(jì)數(shù)框上形成一個(gè)近橢圓形區(qū)域(圖1a)。在體式顯微鏡(奧林巴斯SZX7，日本)下局部放大觀察，發(fā)現(xiàn)基本沒有細(xì)胞處于邊界上及邊界外。即：所有細(xì)胞處于橢圓區(qū)域內(nèi)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞數(shù)量即是單位體積生物量。打開配套的萬能視頻成像系統(tǒng)及scopephoto軟件(LY-WN-HP CCD 8，成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司)，調(diào)整視頻流格式及靜態(tài)圖像至最大分辨率，手動調(diào)節(jié)白平衡(R：137、G：88、B：103)，選擇自動曝光，顏色設(shè)置為黑白模式。微調(diào)放大倍數(shù)及聚焦(物鏡倍數(shù)調(diào)整為1.25X)，使目標(biāo)區(qū)域完全置于CCD相機(jī)視野內(nèi)，當(dāng)圖像達(dá)到最清晰狀態(tài)，抓圖，保存圖片為tif格式。

2)Photoshop軟件分析

操作流程：①首先在具有計(jì)數(shù)工具功能的Photoshop版本(推薦Photoshop CS5 Extended)中打開圖片，利用多邊形套索工具選取細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域，盡量將視野范圍內(nèi)的細(xì)胞全部包含在選取范圍內(nèi)，并去除不必要的區(qū)域(圖1a)；②打開主菜單中—選擇—反向，然后刪除，得到待計(jì)數(shù)區(qū)域(圖1b)；③打開主菜單中—圖像—調(diào)整—陰影/高光、曝光度和閾值，根據(jù)圖片本身適當(dāng)調(diào)節(jié)參數(shù)(圖1c)，調(diào)節(jié)時(shí)盡量提高色階值同時(shí)確保沒有新的黑色像素點(diǎn)出現(xiàn)(圖1c)；④再次打開主菜單中—圖像—調(diào)整—閾值，同樣根據(jù)圖片本身適當(dāng)調(diào)節(jié)參數(shù)(圖中左下)，盡量提高色階值并確保沒有新的黑色像素點(diǎn)出現(xiàn)(圖1d)；⑤使用魔術(shù)棒工具(容差值盡量保證能選中所有黑色像素點(diǎn))，點(diǎn)選白色區(qū)域后，主菜單—選擇—反向來選擇細(xì)胞點(diǎn)(圖1e)，打開主菜單—窗口—測量記錄，選中后打開測量記錄窗口，再打開主菜單—分析—選擇數(shù)據(jù)點(diǎn)—自定，確保選區(qū)—計(jì)數(shù)勾選(圖1f)；⑥再次打開分析—記錄測量，得到計(jì)數(shù)結(jié)果，在結(jié)果中右鍵選擇導(dǎo)出保存為txt格式；⑦用Excel打開導(dǎo)出的結(jié)果，將面積大小進(jìn)行排序后，刪除面積最大，偏小和值為1的特征行，即得到原圖中的細(xì)胞數(shù)量。

面積偏小和值為1的特征行有可能是圖像采集和處理過程中產(chǎn)生的噪聲點(diǎn)，通常是根據(jù)Excel導(dǎo)出結(jié)果的中間值來判斷，其面積值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于中間值。此外，若出現(xiàn)面積相對較大的像素區(qū)域，有可能是兩個(gè)及以上細(xì)胞粘連或疊加的像，為確保原圖中細(xì)胞對應(yīng)的像素點(diǎn)不被誤刪除，需人工校正。如需計(jì)數(shù)的圖片數(shù)量較多，可以使用Photoshop腳本進(jìn)行批量處理。

每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取其平均值。

1.2.2顯微鏡計(jì)數(shù)法

取充分搖勻的樣品0.1 mL滴在浮游植物計(jì)數(shù)框上，加蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡(尼康YS-100，日本)下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取其平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1運(yùn)用新方法對5種藻不同濃度梯度計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)選取的5種單細(xì)胞藻株：亞心形扁藻(長11～14 μm，寬7～9 μm)、東海原甲藻(長15～25 μm，寬8～15 μm)、米氏凱倫藻(長15.6～31.2 μm，寬13.2～24 μm)、塔瑪亞歷山大藻(長20～52 μm，寬17～44 μm)及血紅哈卡藻(長55～77 μm，寬40～50 μm)，細(xì)胞大小呈遞增趨勢。從Photoshop處理結(jié)果中可以看出：亞心形扁藻細(xì)胞個(gè)體很小，處理之后的像素點(diǎn)比處理前的細(xì)胞輪廓點(diǎn)明顯減少。而東海原甲藻及另外的3株藻，處理前后幾乎保持一致(圖2)。

2.2兩種方法測定5種藻液不同濃度梯度的線性相關(guān)性分析

根據(jù)兩種計(jì)數(shù)方法對5種藻的分析結(jié)果(表1)，分別以新方法和顯微鏡計(jì)數(shù)的結(jié)果為自變量，對各濃度梯度進(jìn)行線性回歸分析(表2)，其結(jié)果分別為：亞心形扁藻y=50 350x+5 258，R2=0.956 8，y=76 970x+1 798，R2=0.980 6；東海原甲藻y=59 480x-2 578，R2=0.984 6；y=58 540x-926，R2=0.995 8；米氏凱倫藻y=1 488x-40，R2=0.994 1；y=7 800x-108，R2=0.990 2；塔瑪亞歷山大藻y=12 800x+524，R2=0.986 1；y=13 145x+773，R2=0.986 7；血紅哈卡藻y=1 875x-151，R2=0.976 2；y=1 635x+15，R2=0.973 7。各組數(shù)據(jù)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.900，表明兩種測定方法與細(xì)胞密度梯度線性關(guān)系良好。其中，對亞心形扁藻的密度測定，顯微鏡計(jì)數(shù)法測定的結(jié)果線性關(guān)系最好、最準(zhǔn)確。新方法測定結(jié)果的線性關(guān)系稍差。而對另外4株藻類進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩種測定方法線性關(guān)系較接近。

以新方法的計(jì)數(shù)結(jié)果為自變量(x)，對顯微鏡計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果(y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果分別為：亞心形扁藻y=1.494 2x-5 015.6，R2=0.979 0；東海原甲藻y=0.975 7x+1 893.7，R2=0.993 8；米氏凱倫藻y=1.048 2x-65.185，R2=0.995 8；塔瑪亞歷山大藻y=1.025 8x+204.01，R2=0.998 5；血紅哈卡藻y=0.864 8x+153.67，R2=0.981 1。3個(gè)相關(guān)系數(shù)均大于R0.01=0.758(IBM SPSS Statistics 19)，說明相關(guān)性極顯著，兩種測定方法結(jié)果有可比性。在測定東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻時(shí)，新方法的測定值與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果線性關(guān)系較好。而在測定亞心形扁藻時(shí)，新方法的測定值與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果線性關(guān)系稍差。

表1　兩種計(jì)數(shù)方法的測定結(jié)果

表2　兩種計(jì)數(shù)方法測定結(jié)果的線性回歸分析

2.3兩種方法測定5種藻液不同濃度梯度的結(jié)果比較

結(jié)合表1數(shù)據(jù)，從圖3柱狀圖可以看出，對5種藻不同濃度計(jì)數(shù)時(shí)，新方法在測定東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果非常接近，但在測定亞心形扁藻時(shí)，結(jié)果明顯偏低。

3　討論

細(xì)胞計(jì)數(shù)是醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要環(huán)節(jié)[11]。簡單、快捷、準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法會給研究工作帶來極大的便利。對于微藻而言，細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞大小相差很大(幾微米到幾百微米不等)，又有單細(xì)胞、群體之分[14]。因此，很難有一種簡易、快捷、高效計(jì)數(shù)方法能適合所有微藻，對不同種類的微藻，一般選擇的計(jì)數(shù)方法也不盡相同。顯微鏡計(jì)數(shù)是微藻生物量測定的基本方法，也是衡量其他測定方法有效性的依據(jù)。但其操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，重現(xiàn)性不好，存在一定的人為誤差[11，13]。本文在顯微鏡成像基礎(chǔ)上，直接利用顯微鏡配套的CCD數(shù)字成像系統(tǒng)獲取樣品全視野圖像，運(yùn)用Photoshop軟件把細(xì)胞圖像輪廓處理成像素點(diǎn)，直接對像素點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。如樣品較多，可以使用Photoshop腳本進(jìn)行批量處理，簡化了測定程序的同時(shí)，省去了人工觀察的步驟，減少了人為誤差。同時(shí)，新方法是繞開細(xì)胞的大部分內(nèi)在屬性，直接計(jì)算微藻細(xì)胞顯微圖像轉(zhuǎn)換成的像素點(diǎn)，避免了因微藻種類、細(xì)胞形態(tài)差異、不同生長階段葉綠素含量變化甚至樣品地域差異對葉綠色a含量測定法[1-3]及光密度法[14]等生物量測定方法的限制。另外，新方法使用成本較低，所需硬件及軟件一般實(shí)驗(yàn)室都有配備。

從本實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果可以看出，新方法在測定東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻時(shí)，結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)接近，比較可信(P<0.01)。而在測定亞心形扁藻時(shí)，結(jié)果明顯偏低。主要是因?yàn)榧?xì)胞本身個(gè)體較小，樣品體積跟硬件限制(體視顯微鏡成像系統(tǒng)分辨率等)，Photoshop處理之后的像素點(diǎn)較分析前細(xì)胞輪廓點(diǎn)明顯減少，造成新方法在測定亞心形扁藻時(shí)與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果明顯偏低。因此，在本實(shí)驗(yàn)的硬件和軟件配置下，新方法的有效計(jì)數(shù)的細(xì)胞大小閾值在15 μm左右。

新方法在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。除了能夠有效測定粒徑15 μm以上純種或混合培養(yǎng)的單細(xì)胞藻類的生物量外，粒徑15 μm以上的固體顆粒和粉塵等都可以進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。因此在環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)養(yǎng)殖、工業(yè)制造等領(lǐng)域有一定的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然，這種方法的應(yīng)用也有一些限制因素，如對15 μm以下的藻類細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，結(jié)果偏低；只能對單細(xì)胞藻類進(jìn)行計(jì)數(shù)，在實(shí)際顯微圖像中，受玻片制樣和體視顯微系統(tǒng)景深的影響，可能會出現(xiàn)細(xì)胞粘連、重疊的現(xiàn)象。對Photoshop計(jì)數(shù)結(jié)果中面積較大的點(diǎn)，需人工對照原圖進(jìn)行修正，或采用距離變換和分水嶺算法相結(jié)合的分割方法對粘連、重疊顆粒的分割[16]。這已經(jīng)超出了Photoshop軟件的功能，需要進(jìn)一步研究新的算法。

致謝：香港浸會大學(xué)李劍平研究員在論文修改中提出了寶貴意見，在此深表謝忱。

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A method of quick determination of unicellular algae counting——using Photoshop software to analyze microscopic image contour model

LI Moli1，QIAO Kun2*

(1.College of Biological Sciences and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

Cell counting is an important step in algae culture，red tide investigation and water environment monitoring.A quick counting method of single cell algae was proposed and tested：the image of fixed volume sample was captured by the stereomicroscope and imaging instrument.And then Photoshop software was used to analyze the contour model of microscopic image.In this study，5 representative microalgae species with different cell sizes were selected and the cell densities were measured by our new method and conventional microscope counting method，respectively.The results indicated that the counted numbers of cell density by our new method were apparently lower than those by microscope measurement forPlatymonassubcordiformis.However，for other four algae species(Prorocentrumdonghaiense，Kareniamikimotoi，Alexandriumtamarense，Akashiwosanguinea)，the counting results of the two methods were quite close，presenting a significant linear correlation between them(R2≥0.981 1).Thus，for unicellular alga with sizes larger than 15 μm，the new method could determine the biomass of pure and mixed cultivation effectively.Compared with the microscope counting method，the new method simplifies the measure procedures and reduces the artificial errors.Therefore，it has a certain application value in counting of single-cell or particles.

unicellular algae；cell counting method；Photoshop software analysis；microscopic image contour model

2016-03-31

海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08)；福建省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(2014FJPT01)；廈門南方海洋研究中心項(xiàng)目(14PZY017NF17).

李茉莉(1994-)，女，本科生，研究方向?yàn)樵孱惿砩鷳B(tài). E-mail：limoli94520@163.com

喬琨(1984-)，女，助理研究員，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锛夹g(shù). E-mail：qiaokun@xmu.edu.cn

S917.3

A

1006-5601(2016)03-0236-08

李茉莉，喬琨.一種快捷的單細(xì)胞藻類計(jì)數(shù)方法——運(yùn)用Photoshop軟件分析細(xì)胞顯微圖像輪廓[J].漁業(yè)研究，2016，38(3)：236-243.