鎘脅迫對泥鰍氧化毒性及肝組織損傷效應(yīng)

雷 忻，屈 蓉，杜妙柔，楊超超，譚 婷，王 琪

（延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，延安市生態(tài)恢復(fù)重點實驗室，陜西 延安 716000）

鎘（Cadmium，Cd）作為一種廣泛存在于水體中的重金屬污染物，具有毒性持久、難以消除的特點，對水生動物具有潛在危害性［1-2］。近年來，隨著能源化工的快速發(fā)展，鎘對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響，尤其是對魚類的生存和繁殖有著顯著的影響［3-4］。延河流域作為能源化工基地重要區(qū)域重金屬鎘污染較為嚴重，對其水生生物的生理生態(tài)毒性研究較為迫切。

目前，有關(guān)Cd 對水生生物的毒性效應(yīng)研究較多。例如，劉艷平等［5］通過紅細胞微核實驗研究鎘對小鳙魚的遺傳毒性發(fā)現(xiàn)，鳙魚紅細胞的微核細胞率隨水環(huán)境中Cd2+濃度升高而升高，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。賈秀英等［6］研究表明，高濃度組鎘對兩棲類黑斑蛙肝臟指數(shù)呈逐漸減少的趨勢，肝組織、腎組織、心臟組織Na+-K+-ATPase 隨著暴露時間的延長，呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，表明Cd 對黑斑蛙作用是明顯的時間、劑量-效應(yīng)關(guān)系。雷忻等［7］研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+濃度的升高、染毒時間延長，雄性泥鰍肝臟Vtg 呈升高的趨勢，同時也表現(xiàn)了環(huán)境雌激素效應(yīng)。關(guān)于Cd 對泥鰍的氧化毒性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)報道得較少，有關(guān)Cd脅迫下泥鰍抗氧化機制響應(yīng)研究對進一步探究環(huán)境污染物對魚類代謝毒性、生殖毒性具有一定的參考意義。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）是兩種重要的與氧化作用相關(guān)的酶。SOD 具有抗氧化和氧化平衡的功能，與很多疾病的產(chǎn)生有密切的關(guān)系［8］。SOD 存在于細胞質(zhì)中，其作用將超氧陰離子（O2-）變成H2O2和O2；CAT 是一種主要的酶類清除劑，主要存在于紅細胞和一些組織中，它是一種以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，可將產(chǎn)生的H2O2進一步轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，發(fā)揮機體抗氧化作用。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、泥鰍屬（Misgunus），是一類小型硬骨淡水魚，是一種重要的水環(huán)境監(jiān)測的水生生物，分布范圍廣泛，適應(yīng)性強，在實驗室條件下易于馴養(yǎng)，適合作為毒理學(xué)實驗動物［9-10］。本研究以泥鰍為研究對象，采用靜水養(yǎng)殖法、鄰苯三酚自氧化法、鉬酸銨比色法檢測Cd對泥鰍肝臟SOD和CAT活性的影響，并采用H·E染色法觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化，為了解Cd對泥鰍的氧化毒性提供一定的參考依據(jù)，同時為推進延安地區(qū)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，控制環(huán)境污染，保持生態(tài)平衡，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用泥鰍平均體重11.86±3.0 g，平均體長11.8±2.5 cm。均由陜西省延安市水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供。將泥鰍在自然脫氯96 h 的自來水中馴養(yǎng)7 d，挑取體格強健活躍的泥鰍為研究對象。

采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法對泥鰍染毒［11］，按照《國家漁業(yè)水質(zhì)標準》（Cd2+濃度＜0.005 mg/L），參照文獻［11-14］設(shè)置4 個濃度梯度0.005、0.050、0.500、5.000 mg/L 和1 個曝氣自來水對照組，每組隨機投放25條泥鰍，試驗過程中每天更換受試藥液。

1.2 實驗藥品與主要儀器

氯化鎘（西安化學(xué)試劑廠）、鉬酸銨（天津市凱達化工廠）、焦性沒食子酸、伊紅和蘇木色精（天津博迪化工股份有限公司）。所有試劑均為分析純。UV-2600 紫外可見分光光度計（日本島津企業(yè)管理公司）、輪式切片機（德國）和Leica 正置光學(xué)顯微鏡DM6B。

1.3 抗氧化酶活性檢測

同上取樣，用4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，用濾紙擦拭干燥表面，快速準確計量，加入用6.7 mmol/L磷酸鹽緩沖液，冰浴中研磨成漿，以3 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液放置于冰箱中，采用鄰苯三酚自氧化法檢測SOD 活性［15］，采用鉬酸銨比色法檢測CAT活性［16］。

1.4 肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察

同上取樣，放入Bouin’s 固定液中將其固定24 h，沖洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片、染色，中性樹脂封片，鏡檢、觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件（版本v26.0）進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果用Origin軟件制圖，以及Microsoft Excel 2003處理以平均數(shù)±標準差的形式表示，分析各濃度處理組與對照組的差異顯著性。其中，P＜0.05 表示有顯著差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟SOD活性的變化

由圖1 可見，與對照組相比，雌性泥鰍在Cd 暴露下處理10 d，肝臟SOD 活性呈現(xiàn)上升趨勢，在最高濃度組（5.000 mg/L）極顯著升高（P＜0.01），并達到最大值；Cd 暴露20 d 時，0.050 mg/L 濃度組肝臟SOD 活性顯著升高（P＜0.01），之后呈下降再升高的U形趨勢；Cd暴露30 d時，0.005 mg/L濃度組SOD活性就極顯著升高（P＜0.01），并達到最大值，之后呈下降再升高的U 形趨勢。與對照組相比，雄性泥鰍在暴露10、20、30 d 時，最低Cd 濃度組（0.005 mg/L）SOD 活性均極顯著升高（P＜0.01），之后隨濃度增大，活性基本呈下降趨勢；Cd暴露30 d時，SOD 活性在各濃度組均極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖1 重金屬Cd對泥鰍肝臟SOD活性的影響

2.2 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟CAT活性的變化

由圖2可見，與對照組相比，0.005、0.050 mg/L Cd濃度組在暴露第10 d 時，雌性泥鰍肝臟CAT 活性極顯著升高（P＜0.01），之后隨濃度繼續(xù)增大而活性下降，5.000 mg/L 濃度組CAT 活性極顯著降低（P＜0.01）；Cd暴露20 d時，各濃度組泥鰍肝臟CAT活性均極顯著升高（P＜0.01），并隨著濃度增大呈先升高后下降趨勢；Cd 暴露30 d 時，0.050、0.500 mg/L 濃度組CAT 活性極顯著升高（P＜0.01），但5.000 mg/L濃度組活性極顯著降低（P＜0.01）；Cd 暴露10、20、30 d，0.050 mg/L 濃度組雌性泥鰍CAT 活性均達到最大值，之后隨濃度增大均呈下降趨勢。與對照組相比，雄性泥鰍在Cd 低濃度組（0.005 mg/L）暴露10、20、30 d，CAT活性均顯著升高（P＜0.05）；Cd暴露20 d時，高濃度組（5.000 mg/L）CAT活性下降及其顯著；雌、雄性泥鰍在相同暴露時間，CAT 活性均隨Cd濃度增大，呈現(xiàn)升高后下降的趨勢。

圖2 重金屬Cd對泥鰍肝臟CAT活性的影響

2.3 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟的組織學(xué)變化

由圖3 可以看出，空白對照組中，雌性、雄性泥鰍的肝臟細胞分布比較均勻，細胞核均在細胞中央，為圓形或者橢圓狀（圖3A、E）。與對照組比較，在低濃度0.050 mg/L Cd 中暴露30 d 后，肝組織間隙增大、空泡化（圖3B、F）；隨著濃度增加，雌性、雄性泥鰍肝組織中的細胞間隙進一步加大，同時發(fā)生嚴重的肝細胞腫大、空泡化、核溶解現(xiàn)象。在同一濃 度下，雄性損傷要比雌性損傷結(jié)果更加明顯。

圖3 Cd脅迫下雌、雄性泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)變化

3 討論

3.1 Cd對雌、雄性泥鰍氧化毒性效應(yīng)

SOD 和CAT 是水生動物抗氧化酶系的重要成分，它們的變化可反映外源污染物對動物的氧化毒性效應(yīng)。宋志慧等［17］發(fā)現(xiàn)低濃度氧化樂果會激活椎實螺體內(nèi)酶活響應(yīng)機制，導(dǎo)致CAT 活性升高；高濃度氧化樂果會損傷靜水椎實螺抗氧化系統(tǒng)，使得CAT 活性降低。張楠等［15］通過研究Zn2+對大型溞（Daphniamagna）生理毒性時發(fā)現(xiàn)，在一定時間范圍內(nèi)，隨Zn2+的濃度升高，大型溞SOD 和CAT 活性基本呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的規(guī)律。賈秀英等［16］對鯽魚的研究也顯示在低濃度的Cu2+、Cd2+的脅迫下，肝組織SOD 酶活性升高，隨著Cu2+、Cd2+濃度的增大，酶活性又呈明顯下降趨勢。孫淑紅等［18］研究表明低濃度Cd 脅迫下，泥鰍肝組織中SOD 活性即可被顯著誘導(dǎo)。本研究中，雌性泥鰍在Cd暴露10 d時肝臟SOD 活性在最高濃度組（5.000 mg/L）表現(xiàn)為極顯著升高，而在暴露30 d時，最低Cd濃度組（0.005 mg/L）SOD 活性就升高極其顯著，并在相同時間，SOD活性呈下降再升高的U 形趨勢，表明了雌性泥鰍肝臟組織在Cd暴露達到一定時間和劑量時，才顯著誘導(dǎo)SOD 活性，產(chǎn)生較強的氧化毒性效應(yīng)。而雄性泥鰍在Cd 暴露10 d 時，最低Cd 濃度組（0.005 mg/L）SOD活性就升高極其顯著，并在相同暴露時間，SOD活性隨著Cd濃度增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，提示低濃度Cd 即可對雄性泥鰍SOD 活性產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，表現(xiàn)出明顯的氧化毒性效應(yīng)。因此，Cd 對雄性泥鰍SOD 活性誘導(dǎo)作用較雌性泥鰍強。雌性泥鰍在最低Cd 濃度組（0.005 mg/L）暴露10 d 時，肝臟CAT 活性升高就極其顯著，在0.050 mg/L 濃度組暴露10 d、20 d、30 d 時，CAT 活性均達到最大值，之后隨濃度增大均呈下降趨勢。Cd 暴露中的雄性泥鰍CAT 活性變化趨勢類似雌魚，但變化程度不及雌魚劇烈。泥鰍在Cd 脅迫下產(chǎn)生了大量的O2-，為了保護機體清除多的自由基，肝臟SOD 和CAT 的活性被大量激活，而隨著時間延長，Cd在體內(nèi)大量富集，對抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，又會抑制兩種酶活性，因此具有一定的劑量-效應(yīng)與時間-效應(yīng)關(guān)系。

3.2 Cd對雌、雄性泥鰍肝組織損傷效應(yīng)

肝臟是魚體內(nèi)重要的解毒器官，當有害物質(zhì)進入機體后，會對肝組織結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷［19］。沈文靜等［20］研究表明斑馬魚短期接觸敵草快后，肝細胞發(fā)生了腫脹、空泡，隨著敵草快濃度的升高，肝組織的損害更加嚴重，肝細胞發(fā)生明顯壞死，導(dǎo)致動物肝功能喪失而死亡。王文龍等［21］對吉富羅非魚幼魚的研究表明，銅可使肝臟表現(xiàn)出不同程度病變，隨著銅濃度的增加，肝臟被誘導(dǎo)致濁腫變性和脂肪變性。王利等［22］觀察到銅暴露下鯉魚肝細胞有空泡變形、腫大、細胞核溶解的現(xiàn)象。本研究中，隨著Cd濃度增加和染毒時間的延長，雌、雄性泥鰍肝細胞都出現(xiàn)空泡化、細胞腫大、核溶解、變形等組織結(jié)構(gòu)異常，說明Cd可對泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷效應(yīng)，并且對雄性損傷要比雌性損傷更為嚴重。

4 結(jié)論

1）一定劑量Cd 對泥鰍肝臟SOD 活性有明顯誘導(dǎo)作用，其中對雄性的誘導(dǎo)作用較雌性強烈；一定劑量Cd 對泥鰍肝臟CAT 活性也有明顯誘導(dǎo)作用，其中對雌性的誘導(dǎo)作用較雄性強烈。因此，Cd 對雌、雄性泥鰍均可產(chǎn)生明顯的氧化毒性效應(yīng)。

2）一定劑量Cd 脅迫可對泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷效應(yīng)，其中對雄性損傷要比雌性損傷更為嚴重。