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    Navβ1亞基對KCNQ通道電流特性的調(diào)控

    2023-06-25 01:39:22劉思佳白占濤
    關(guān)鍵詞:電流強(qiáng)度亞基電流密度

    姜 鳴,劉思佳,岳 杰,劉 霞,白占濤

    (1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院;2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心;3.延安市多肽資源藥物工程技術(shù)研究中心;4.延安市神經(jīng)腫瘤免疫與干細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 延安 716000)

    電壓門控鉀通道(voltage-gated potassium channel,Kv)Kv7 家族也被稱為KCNQ 鉀通道,是一種介導(dǎo)M電流外向整流的電壓門控型鉀離子通道,在人體生理過程中起關(guān)鍵作用,包括心臟動作電位,鉀穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)元興奮性等[1-2]。KCNQ通道包含5個α亞基(Kv7.1-Kv7.5),由KCNQ1至KCNQ5基因編碼,這些α亞基排列為同源或異源,各自具有特征性組織分布和功能,KCNQ基因突變通常與許多心臟、聽覺和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[3-6]。選擇性激動劑和抑制劑對KCNQ 通道的調(diào)節(jié)可以改善由KCNQ 通道異常誘發(fā)的心律失常、癲癇發(fā)作、進(jìn)行性聽力損失和疼痛等相關(guān)疾病的診治。KCNQ 通道不同亞型特異性激活劑和抑制劑的開發(fā)與使用有助于理解KCNQ通道參與許多疾病發(fā)生的作用機(jī)制,尋求更優(yōu)的診療方法[7]。

    電壓門控鈉離子通道β1 亞基(Voltage-gated sodium channels β1 subunit,Navβ1),由SCN1B基因編碼,定位于心室細(xì)胞的夾層、T管及心房細(xì)胞的閏盤,是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)電壓門控鈉離子通道的動力學(xué)和表達(dá)的輔助亞基[8-9],也與細(xì)胞的遷移、神經(jīng)突增長以及軸突向?qū)У肉c通道α 亞基所缺失的功能有關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)Navβ 亞基在癲癇、神經(jīng)病、心臟功能性疾病以及癌癥中都有一定的作用[11],Navβ1 亞基雖然以鈉離子通道輔助亞基的身份被發(fā)現(xiàn),但其對Kv通道也具有調(diào)控作用。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)Navβ1亞基與不同Kv 通道共表達(dá)時,其可以激活Kv4.3 通道的開放[12-13],增強(qiáng)Kv4.2 通道的電流密度[14],通過加強(qiáng)與通道的結(jié)合,抑制Kv1.2和Kv1.3通道依賴電壓的激活[15],而有關(guān)Navβ1 亞基對KCNQ 通道的調(diào)控作用鮮有報道。本研究利用體外全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)明確了Navβ1亞基對KCNQ 通道及其亞型的調(diào)控作用,為解析KCNQ 通道的結(jié)構(gòu)功能以及KCNQ通道疾病的診療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    研究中所使用的培養(yǎng)細(xì)胞是HEK 293T 人胚腎上皮細(xì)胞系(BNCC353535,北納生物);質(zhì)粒培養(yǎng)菌株為大腸桿菌DH5α(CD201-01,全式金),Navβ1亞基和KCNQ(1、2、3、4)表達(dá)質(zhì)粒由中國科學(xué)研究院、昆明動物研究所、上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院贈予。

    1.2 試劑

    DMEM 培養(yǎng)基(11995,Solarbio),完全培養(yǎng)基DMEM+胎牛血清(Gibco?by life technlogies TM);青霉素-鏈霉素混合液(P7630,Solarbio);DMEM+FBS;HEK 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA Lip 3 000;Opti-MEM培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基);細(xì)胞外液:150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES(pH7.4),滲透壓280~300 mOs,配制好后用0.22 μm 濾頭過濾,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞內(nèi)液:130 mmol/L 天冬氨酸鉀、5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L EGTA(pH7.2),滲透壓280~300 mOsm,配制好后用0.22 μm濾頭過濾,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

    HEK 293T 細(xì)胞培養(yǎng):HEK 293T 復(fù)蘇置于37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),鏡檢觀察細(xì)胞狀態(tài)(密度60%~80%)。

    HEK 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:KCNQ 通道質(zhì)粒,Navβ1質(zhì)粒采用了脂質(zhì)體介導(dǎo)法,通過脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA靜電作用結(jié)合為DNA 脂質(zhì)體復(fù)合體,鑲嵌于膜表面,內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,從而在細(xì)胞膜表達(dá)。

    1.3.2 細(xì)胞膜片鉗電流記錄實(shí)驗(yàn)

    細(xì)胞膜電壓鉗制在-80 mV,以10 mV 的增量從-80 mV 步階進(jìn)至+30 mV,持續(xù)時間為200 ms,誘導(dǎo)出KCNQ、KCNQ+Navβ1電流。

    1.3.3 全細(xì)胞電壓鉗檢測

    顯微鏡下將細(xì)胞調(diào)至視野中央,利用電子顯微操作儀將微電極下降到細(xì)胞外液液面后給予液接電位補(bǔ)償,此時觀察電極入液電阻,2~8 MΩ 較佳(入液電阻太小或太大的電極棄之);通過電子顯微操作儀控制電極,當(dāng)電極處于細(xì)胞的斜上方時,調(diào)整速度慢慢靠近細(xì)胞表面,觀察到電阻值略微升高時,利用小針管施加負(fù)壓,待高阻封接(1 GΩ 以上)狀態(tài)穩(wěn)定后,給予電容補(bǔ)償,破膜,記錄電流數(shù)據(jù):細(xì)胞膜電容(Cm)、串聯(lián)電阻(Rs)、接入電阻(Ra)、時間常數(shù)(t)、Hold。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    由于細(xì)胞的電流大小受細(xì)胞狀態(tài),細(xì)胞大小不同的影響,本文通過記錄全細(xì)胞電流(I),細(xì)胞膜電容(Cm)計算分析電流密度(Id),對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。電流密度表示單位細(xì)胞膜面積的通道電流大小,利用式(1)計算。

    數(shù)據(jù)的統(tǒng)計統(tǒng)計學(xué)分析采用Clampfit 10.3、OriginPro 9.0、GraphPad prism 7.0 軟件分析,所有分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,即Mean±SEM。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 Navβ1亞基對KCNQ1通道電流的調(diào)制作用

    為了明確Navβ1亞基對KCNQ 通道及其亞型的調(diào)制作用,利用全細(xì)胞膜片鉗記錄了HEK 293T 細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染KCNQ通道和與Navβ1亞基共同轉(zhuǎn)染時細(xì)胞電流特性的變化。將細(xì)胞鉗制在-80 mV,以10 mV的增量步階增進(jìn)至+30 mV,誘導(dǎo)出KCNQ1和KCNQ1+Nav β1 電流(圖1A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染KCNQ1 通道時,隨著激活電壓增加,KCNQ1 通道的激活電流強(qiáng)度穩(wěn)步增加(圖1C),當(dāng)與Navβ1亞基共同轉(zhuǎn)染時,KCNQ1通道的激活電流強(qiáng)度增加幅度減緩(圖1D)。在激活電壓為+30 mV 時KCNQ1 通道單獨(dú)轉(zhuǎn)染的電流密度達(dá)到峰值為63.9±0.3 pA/pF。與Navβ1 亞基共同轉(zhuǎn)染時,KCNQ1 通道的電流密度顯著下降,僅為31.5±1.4 pA/pF(圖1B)。結(jié)果表明,細(xì)胞中Navβ1 亞基的表達(dá)可以顯著抑制KCNQ1 通道的電流密度,說明Navβ1亞基減少了KCNQ1通道的離子流量,抑制了KCNQ1通道的開放。

    圖1 Navβ1亞基對KCNQ 1通道電流的調(diào)制作用

    2.2 Navβ1亞基對KCNQ2通道電流的調(diào)制作用

    在對KCNQ2通道的檢測時,發(fā)現(xiàn)Navβ1亞基可以抑制KCNQ2 通道的電流。以10 mV 的增量從-80 mV 步階增加至+30 mV,誘導(dǎo)出KCNQ2 電流特征(圖2A)。隨著激活電壓增加,KCNQ2 通道的激活電流強(qiáng)度穩(wěn)步增加,但其增加幅度較小(圖2C),而當(dāng)其與Navβ1 亞基共同轉(zhuǎn)染時,隨著激活電壓的增加電流強(qiáng)度的增幅顯著減?。▓D2D)。在電流密度的檢測中發(fā)現(xiàn),單獨(dú)轉(zhuǎn)染時KCNQ2通道的電流密度在+30 mV 時達(dá)到峰值為19.1±2.1 pA/pF。與Navβ1 亞基共同轉(zhuǎn)染時,KCNQ2 通道的電流密度在激活電壓為-80 mV 與+10 mV 之間與其單獨(dú)轉(zhuǎn)染時無差異。當(dāng)激活電壓為+20 mV 時,與Navβ1亞基共同轉(zhuǎn)染的KCNQ2通道電流密度到達(dá)峰值,為10.76±1.0 pA/pF,相較KCNQ2 單獨(dú)轉(zhuǎn)染時有顯著下降(圖2B)。這一結(jié)果表明Navβ1 亞基抑制了KCNQ2通道的電流密度,在激活電壓達(dá)到+20 mV以上時表現(xiàn)出抑制效果。

    圖2 Navβ1亞基對KCNQ2通道電流的調(diào)制作用

    2.3 Navβ1亞基對KCNQ3通道電流的調(diào)制作用

    利用激活電壓以10 mV 的增量從-80 mV 步階增加至+30 mV 刺激,誘導(dǎo)KCNQ3 電流時發(fā)現(xiàn)(圖3A),相較于單獨(dú)轉(zhuǎn)染KCNQ3 通道,Navβ1 亞基可以增強(qiáng)KCNQ3 通道的電流密度,從-40 mV 開始Navβ1 亞基對KCNQ3 通道電流密度的增強(qiáng)作用便具有顯著差異,并且從0 mV 開始其電流密度曲線急速上升,在+30 mV 時達(dá)到峰值為56.6±3.0 pA/pF(圖3B)。單獨(dú)轉(zhuǎn)染KCNQ3 通道的電流密度峰值僅為22.2±1.5 pA/pF。在電流軌跡圖中也發(fā)現(xiàn),單獨(dú)轉(zhuǎn)染KCNQ3 通道的電流強(qiáng)度總體較低,僅+10 mV以上高電壓激活時的電流強(qiáng)度有明顯上升(圖3C)。Navβ1 亞基和KCNQ3 共轉(zhuǎn)時電流強(qiáng)度增幅更顯著,從-20 mV 開始就有顯著增強(qiáng)(圖3D)。以上結(jié)果表明Navβ1亞基可以增加通過KCNQ3通道的離子流,激活KCNQ3通道。

    圖3 Navβ1亞基對KCNQ3通道電流的調(diào)制作用

    2.4 Navβ1亞基對KCNQ4通道電流的調(diào)制作用

    Navβ1 亞基也可以增強(qiáng)KCNQ4 通道的電流。激活電壓以10 mV的增量從-80 mV步階增進(jìn)至+30 mV 的誘導(dǎo)過程中(圖4A),電流軌跡圖中Navβ1亞基共轉(zhuǎn)染對KCNQ4 通道的電流強(qiáng)度并未有顯著的影響(圖4C 和D)。電流密度統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示,當(dāng)激活電壓為0 mV 以上時,Navβ1 亞基可以顯著增強(qiáng)KCNQ4 通道的電流密度。在+30 mV 時,相較于單獨(dú)轉(zhuǎn)染KCNQ4 通道的電流密度峰值14.2±0.6 pA/pF,與Navβ1亞基共轉(zhuǎn)染KCNQ4通道電流密度峰值可顯著上升至24.2±2.2 pA/pF(圖4B)。這一結(jié)果表明對于Navβ1亞基與KCNQ4通道共轉(zhuǎn)時,可以促進(jìn)KCNQ4 通道的開放,加快通過KCNQ4 通道的離子流速,激活通道。

    圖4 Navβ1亞基對KCNQ4通道電流的調(diào)制作用

    2.5 Navβ1 亞基對KCNQ 通道不同亞型電流的調(diào)制差異

    Navβ1 亞基對KCNQ 通道不同亞型電流密度峰值作用的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,Navβ1 亞基可以顯著抑制KCNQ1通道的電流密度峰值,其下調(diào)幅度可達(dá)50.71%,對KCNQ2 電流密度峰值的抑制幅度為43.70%。Navβ1 亞基可以增強(qiáng)KCNQ3 和KCNQ4 的電流密度峰值,其增強(qiáng)幅度分別為154.64% 和70.56%(圖5)。結(jié)果說明,Navβ1 亞基可以抑制KCNQ1 和KCNQ2 通道的電流,激活KCNQ3 和KCNQ4的電流,對KCNQ3的激活效果優(yōu)于KCNQ4。

    圖5 Navβ1亞基作用對KCNQ通道亞型電流密度峰值的影響

    3 討論與結(jié)論

    Navβ1亞基是電壓門控鈉離子通道的輔助亞基之一,通過與電壓門控鈉離子通道α 亞基結(jié)合調(diào)控通道的門控特性與通道的激活和失活[16]。前期研究報道指出Navβ1 亞基作為輔助亞基也可以與鉀離子通道結(jié)合[14],并對鉀離子通道產(chǎn)生不同的調(diào)控作用,Navβ1 亞基在體外可增強(qiáng)異源表達(dá)的Kv4.2通道和Kv4.3 通道電流密度[12-13],易化Kv1.1 和Kv1.2 通道的激活,而抑制Kv1.6通道的活化[14]。本研究利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Navβ1 亞基可以差異性調(diào)控異源表達(dá)的KCNQ 通道電流特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Navβ1 亞基可以抑制KCNQ1 和KCNQ2 通道的活性,而激活KCNQ3 和KCNQ4 通道。同時我們發(fā)現(xiàn),KCNQ2 通道僅在+30 mV 時表現(xiàn)出抑制作用(圖2B),而Navβ1 亞基對KCNQ1 通道的抑制作用從-70 mV 開始便具有顯著差異(圖1B),說明Navβ1 亞基的結(jié)合延緩了KCNQ1 通道的激活,相較于KCNQ2通道Navβ1亞基可能更易與KCNQ1 通道發(fā)生作用。KCNQ 通道在閾值膜電位下開放,激活閾值接近靜息膜電位,對膜興奮性有強(qiáng)烈的抑制作用[1],Navβ1 亞基對KCNQ1 和KCNQ2 通道的抑制作用可能與其協(xié)同電壓門控鈉離子通道電流參與細(xì)胞興奮性有關(guān)。Nguyen 等報道Navβ1 亞基通過胞外“Ig”結(jié)構(gòu)域與Kv1.3 通道α亞基結(jié)合抑制Kv1.3 通道的開放[14],本研究中發(fā)現(xiàn)Navβ1 亞基對KCNQ1 和KCNQ2 通道的抑制效果與Kv1.3 相似,提示Navβ1 亞基可能也是通過其胞外“Ig”結(jié)構(gòu)域與KCNQ1 和KCNQ2 通道結(jié)合產(chǎn)生抑制作用,而Navβ1 亞基對KCNQ1 和KCNQ2 通道抑制效果的差異可能與KCNQ不同亞型和Navβ1亞基之間的結(jié)合差異有關(guān),其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    本研究發(fā)現(xiàn)Navβ1 亞基可以易化KCNQ3 和KCNQ4 通道的激活,但作用也具有差異性。Navβ1亞基對KCNQ3 通道的激活效果更加地顯著,在-40 mV 的激活電壓下就有明顯的激活效應(yīng)(圖3B),而對KCNQ4 通道僅在0 mV 時具有顯著的激活作用(圖4B)。Navβ1 亞基對KCNQ3 通道電流密度峰值的激活程度約為KCNQ4 通道的2 倍(圖5),該激活作用提示我們,Navβ1 亞基對KCNQ3和KCNQ4 通道的激活可能與防止癲癇相關(guān)神經(jīng)元和心肌細(xì)胞等的過度興奮及復(fù)極化有關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了Navβ1亞基對KCNQ 通道具有亞型選擇性的調(diào)控作用,其對KCNQ1 和KCNQ2 通道具有抑制作用,并且對KCNQ1 通道的抑制效果要強(qiáng)于KCNQ2通道。Navβ1亞基對KCNQ3和KCNQ4通道具有激活作用,且對KCNQ3 的激活作用要強(qiáng)于KCNQ4 通道。Navβ1 亞基的這種差異性調(diào)控功能,將為解析癲癇及心臟功能障礙等相關(guān)疾病中KCNQ通道功能異常調(diào)控以及KCNQ通道疾病的診療提供新思路。

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