纈沙坦對(duì)雄性成年大鼠生殖功能安全性的初步探討

趙艷玲，李興旺，朱永林（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州3507；.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州35000）

纈沙坦對(duì)雄性成年大鼠生殖功能安全性的初步探討

趙艷玲1，李興旺1，朱永林2
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州325027；2.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州325000）

目的研究纈沙坦對(duì)雄性成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響。方法40只90天齡SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和纈沙坦組，每組20只，對(duì)照組給予玉米油（2mL/kg），纈沙坦組給予纈沙坦（15mg/kg）持續(xù)灌胃，灌胃7天后腹腔注射75 mg/kg二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）。EDS后第4天、14天、21天、35天各處死大鼠5只，采集血液、留取睪丸，采用放射免疫法（RIA）測(cè)定血清睪酮（T）、促黃體生成素（LH）水平；睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性的羥類固醇 （3β-HSD）可由3β-HSD染色來鑒定，組織染色后使用圖像分析軟件估計(jì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果EDS后第4天、14天、21天、35天，兩組血清T和LH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)論纈沙坦對(duì)雄性大鼠成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育無明顯影響，對(duì)雄性成年大鼠生殖功能較安全，進(jìn)一步研究需對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志基因進(jìn)行測(cè)定。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞；纈沙坦；睪酮；生殖功能

流行病學(xué)調(diào)查表明，慢性腎臟?。–KD）及高血壓的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，中青年男性人群高血壓患病率逐年上升，降壓/降低尿蛋白的控制血壓、延緩腎功能進(jìn)展的常規(guī)用藥是ACEI（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑）和ARB（血管緊張素受體拮抗劑）。大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有較高的血管緊張素Ⅱ （AⅡ）親和性受體，此受體激活可抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶活性，減少間質(zhì)細(xì)胞釋放睪酮［1］。纈沙坦是ARB的一種，目前其對(duì)成年雄性生殖內(nèi)分泌細(xì)胞即睪丸間質(zhì)細(xì)胞（adult Leydig cell，ALC）發(fā)育和功能的影響國內(nèi)外尚無研究［2］，因其關(guān)乎優(yōu)生優(yōu)育，具有重要意義。本文就纈沙坦對(duì)雄性成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料40只90天齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250g，平均（219.2±37.0）g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 （清潔級(jí)）（編號(hào) SCXK （滬）2013-0005），全部大鼠在正常溫控光照和自由攝食條件下飼養(yǎng)。XH-6020γ計(jì)數(shù)儀、顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研中心提供；纈沙坦（代文）由諾華公司提供；硝酸藍(lán)四唑（NBT）購自Am resco公司；二甲基磺酸乙烷、醇酮購自稞新材料科技（上海）有限公司；睪酮（T）、促黃體生成素（LH）測(cè)定試劑盒（testosterone reagent kit）購自天津九鼎公司。

1.2方法40只90天齡SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和纈沙坦組，每組20只，對(duì)照組給予溶媒玉米油（2mL/kg），纈沙坦組按照15mg/kg予以纈沙坦持續(xù)灌胃，每天1次，灌胃7天后，腹腔單次注射給予每只大鼠 75mg/kg二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）處理，EDS是一種烷化劑，高度選擇性殺死睪丸間質(zhì)細(xì)胞，大鼠接受單次腹腔注射75mg/kg EDS后，4天時(shí)清除睪丸間質(zhì)細(xì)胞，睪丸間質(zhì)內(nèi)不能見到睪丸間質(zhì)細(xì)胞。EDS處理后第4天、14天、21天、35天各處死大鼠5只，采集血液、留取睪丸。血液以3000r/min離心20分鐘，收集血清，保存于-20℃，用于血清T、LH水平測(cè)定；冰凍睪丸，進(jìn)一步組織化學(xué)染色。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1激素水平測(cè)定采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定血清T、LH水平。按照試劑盒操作步驟，使用標(biāo)準(zhǔn)血清和樣品，分別加入125I-T和125I-LH作為閃標(biāo)，進(jìn)行測(cè)定，T和LH的批內(nèi)變異系數(shù)＜8%，批間變異系數(shù)＜10%。

1.3.2組織化學(xué)染色睪丸間質(zhì)細(xì)胞通過組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。方法：取睪丸冰凍切片，厚8μm。睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有特異性標(biāo)志物，即羥類固醇脫氫酶 （3β-HSD）。在該酶的作用下，0.4mmol醇酮、1mg NBT和輔酶（NAD+）發(fā)生反應(yīng)，NBT被還原，生成藍(lán)色雙蟻脂沉淀沉積于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞漿部位。用二脒基苯基吲哚（DAPI）染細(xì)胞核。睪丸切片通過上述組織化學(xué)染色后，連接到計(jì)算機(jī)的顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)來觀察染色情況，并使用圖像分析軟件估計(jì)細(xì)胞數(shù)（計(jì)數(shù)每100個(gè)小管中含有藍(lán)色雙蟻脂沉淀細(xì)胞數(shù)）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值采用（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1血清T、LH水平EDS后第4天、14天、21天、35天，兩組血清T和LH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　兩組血清T、LH水平的比較（x±s，ng/mL）

2.2睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)采用3β-HSD染色測(cè)定EDS處理后第4天、14天、21天、35天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞見圖1～4。在EDS處理后第4天、14天、21天、35天，兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1　EDS處理后第4天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（1A：對(duì)照組；1B：纈沙坦組）

圖2　EDS處理后第14天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（2A：對(duì)照組；2B：纈沙坦組）

圖3　EDS處理后第21天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（3A：對(duì)照組；3B：纈沙坦組）

圖4　EDS處理后第35天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（4A：對(duì)照組；4B：纈沙坦組）

表2　兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)的比較（x±s）

3　討論

雄性哺乳動(dòng)物體內(nèi)睪酮主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，因而睪酮含量的下降很大程度上與間質(zhì)細(xì)胞功能相關(guān)，血清中低睪酮水平通過負(fù)反饋機(jī)制引起LH分泌增多。EDS處理模型可以很好地觀察成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程［3-4］。單次腹腔注射EDS后，成年睪丸內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞被完全清除。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的喪失導(dǎo)致循環(huán)內(nèi)LH升高，LH同其他局部生長因子和細(xì)胞因子促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增生和分化。血清睪酮是反映睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生的指標(biāo)［5］。本實(shí)驗(yàn)中血清T在EDS處理后第4天沒有測(cè)出，但之后恢復(fù)，說明睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育。

大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有較高的血管緊張素Ⅱ（AⅡ）親和性受體，此受體激活可抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶活性，減少間質(zhì)細(xì)胞釋放睪酮［1］。纈沙坦為血管緊張素受體拮抗劑，可能影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶活性及間質(zhì)細(xì)胞釋放睪酮，可能增加局部血管緊張素濃度，進(jìn)而影響精子發(fā)生過程和下丘腦-腦垂體-睪丸軸分泌功能。目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定EDS處理后第4天、14天、21天、35天兩組T及LH水平，EDS處理后第4天兩組LH均較高，而T不能測(cè)出；第35天時(shí)兩組T較高，而LH較低，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故纈沙坦對(duì)成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程影響不大。研究中采用3β-HSD染色測(cè)定EDS處理后第4天、14天、21天、35天睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)第4天兩組少見睪丸間質(zhì)細(xì)胞，此后逐漸增多，第35天時(shí)較多，同時(shí)間段兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），纈沙坦未導(dǎo)致EDS處理后成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)發(fā)生明顯改變，說明纈沙坦對(duì)雄性成年大鼠生殖功能安全性較好。

通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用纈沙坦治療，短期內(nèi)未見睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生發(fā)生異常，但長期使用或加倍劑量使用的安全性有待進(jìn)一步觀察，包括睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化情況、測(cè)定睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化基因等。

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溫州市科學(xué)技術(shù)局科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20120042）