硒蛋白x基因沉默和過氧化氫處理對(duì)人正常肝臟細(xì)胞中硒蛋白基因表達(dá)和抗氧化酶活性的影響

湯加勇　趙　華　賈　剛　劉光芒　陳小玲　蔡景義　吳彩梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都611130)

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硒蛋白x基因沉默和過氧化氫處理對(duì)人正常肝臟細(xì)胞中硒蛋白基因表達(dá)和抗氧化酶活性的影響

湯加勇趙華*賈剛劉光芒陳小玲蔡景義吳彩梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都611130)

本試驗(yàn)旨在探討硒蛋白x(Selx)基因沉默和過氧化氫(H2O2)處理對(duì)人正常肝臟細(xì)胞(LO2)中硒蛋白基因表達(dá)和抗氧化酶活性的影響，為探索Selx與其他硒蛋白之間的調(diào)控關(guān)系及Selx的功能奠定基礎(chǔ)。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的Selx基因穩(wěn)定沉默LO2細(xì)胞株(siSelx)和對(duì)照細(xì)胞株(CK)，利用噻唑蘭(MTT)法比較其生長(zhǎng)速率；siSelx和CK用200 μmol/L H2O2處理2.5 h后，采用熒光定量PCR技術(shù)考察25個(gè)硒蛋白基因的表達(dá)量；同時(shí)比較Selx基因沉默以及H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)的影響。結(jié)果顯示：1)Selx基因沉默顯著降低了LO2細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率(P<0.05)；2)Selx基因沉默顯著上調(diào)了Gpx6、Txnrd2、Seli基因的表達(dá)量(P<0.05)，顯著下調(diào)了Dio2、Dio3、Selm、Sepw1基因的表達(dá)量(P<0.05)；H2O2處理顯著上調(diào)了Dio1基因的表達(dá)量(P<0.05)，顯著下調(diào)了Gpx2基因的表達(dá)量(P<0.05)；Selx基因沉默后H2O2處理顯著上調(diào)了Gpx6、Txnrd2、Dio1基因的表達(dá)量(P<0.05)，顯著下調(diào)了Txnrd3、Dio2、Selm、Sepw1、Selv基因的表達(dá)量(P<0.05)；3)Selx基因沉默顯著提高了LO2細(xì)胞株GSH-Px活性(P<0.05)，顯著提高了SOD的活性(P<0.05)；Selx基因沉默后H2O2處理顯著提高了GSH-Px活性(P<0.05)。由此可見，Selx基因沉默降低了LO2細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率，Selx基因沉默后H2O2處理影響部分硒蛋白基因在細(xì)胞中的表達(dá)量，同時(shí)也影響了GSH-Px、SOD活性。

Selx基因；沉默；H2O2；表達(dá)

硒(Se)是哺乳動(dòng)物新陳代謝所必需的基本微量元素，在動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖等方面起著重要作用。Se在動(dòng)物體內(nèi)主要以硒蛋白的形式來(lái)發(fā)揮其多種生理功能，在人中已分離得到了25種硒蛋白[1]。很多硒蛋白在動(dòng)物體內(nèi)是作為細(xì)胞重要的抗氧化防御系統(tǒng)，起著清除氧自由基、保護(hù)生物膜完整等功能[2-4]。在動(dòng)物飼糧中添加一定量的Se可以增加體內(nèi)硒蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫及抗氧化功能等[3-4]。到目前還有很多硒蛋白的功能和作用機(jī)理不完全清楚，其中就包含硒蛋白x(Selx)。Selx也稱為硒蛋白R(shí)(SelR)和蛋氨酸亞砜還原酶B1(MsrB1)，在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，隸屬于蛋氨酸亞砜還原酶(Msr)家族，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。Msr是一種氧化還原修復(fù)酶，它可修復(fù)被氧化的核糖體蛋白使其恢復(fù)蛋白質(zhì)的功能[5]?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)的大量產(chǎn)生或不完全清除可以使生物機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷，為了抵抗ROS的氧化損傷，機(jī)體擁有一定的防御體系，其中蛋氨酸亞砜還原酶就是一種修復(fù)酶和間接的ROS清除劑。蛋氨酸是蛋白質(zhì)中最易被氧化的氨基酸殘基之一，它可被過氧化氫(H2O2)、羥自由基、次氯酸鈉、過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)等氧化，生成蛋氨酸亞砜(MetO)[6]。同其他Msr一樣，Selx可把生成的MetO還原為蛋氨酸，抵御機(jī)體受到氧化損傷，可抑制ONOO-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。有研究表明，Selx基因沉默會(huì)誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(hLE)ROS水平的顯著增加，從而激活細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制[8]；本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，Selx基因沉默可以降低人正常肝臟細(xì)胞(human normal hepatocyte，LO2)的活性，增加細(xì)胞的凋亡[9]。

硒蛋白是Se以硒代半胱氨酸(Sec)的形式存在，且Sec大多位于蛋白質(zhì)的活性中心。Sec由密碼子UGA編碼，而該密碼子在普通蛋白質(zhì)合成中是終止密碼子，Sec的插入依賴于硒蛋白mRNA自身3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)穩(wěn)定的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)序列元件SECIS(selenocysteine insertion sequence)[2]。由于SECIS結(jié)構(gòu)的特殊性，可針對(duì)硒蛋白的3′-UTR，利用沉默技術(shù)設(shè)計(jì)引物，使其基因沉默表達(dá)，從而探討其功能。目前已有GPX4[10]、TR1[11]、SelW[12]、Sep15[13]等基因沉默的研究報(bào)道。

目前已知在人和哺乳動(dòng)物中有25個(gè)硒蛋白基因，很多硒蛋白在維持機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡中起著重要作用，但硒蛋白之間是否具有功能互作尚不清楚，Selx基因沉默是否會(huì)對(duì)其他硒蛋白基因表達(dá)產(chǎn)生影響也未見報(bào)道。前期的研究表明，Selx基因在肝臟和腎臟中具有較高的表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)室已通過沉默技術(shù)，成功構(gòu)建了LO2的Selx基因沉默細(xì)胞株(siSelx)和空載穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LO2對(duì)照細(xì)胞株(CK)[9]。在此，本試驗(yàn)旨在考察Selx基因沉默對(duì)LO2細(xì)胞株生長(zhǎng)速率及細(xì)胞形態(tài)的影響；同時(shí)比較Selx基因沉默和H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株中25個(gè)硒蛋白mRNA表達(dá)的影響，及其對(duì)細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)的影響。研究結(jié)果可望為探索Selx與其他硒蛋白之間可能的調(diào)控關(guān)系提供線索，為探索Selx的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步探討硒蛋白如何在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮Se的營(yíng)養(yǎng)功能提供一定的線索。

1　材料與方法

1.1主要儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、生物安全柜(Thermo)、酶標(biāo)儀(Molecular Devices)、5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、Milli Q Plus超級(jí)純水儀(Millipore)、Nanodrop微量核酸分析儀(Thermo)、7900HT熒光定量PCR儀(ABI)、倒置熒光顯微鏡(Nikon TS100)。

1.2主要試劑及細(xì)胞株

主要試劑：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、TRIzol regent(Invitrogen)均購(gòu)于Thermo Fisher公司；Prime ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、SYBR Green Mix熒光染料均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物公司合成；GSH-Px活性測(cè)定試劑盒、SOD活性測(cè)定試劑盒和T-AOC測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

細(xì)胞株：siSelx和CK均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.3siSelx和CK的培養(yǎng)

將siSelx和CK分別接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和600 μg/mL潮霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.4siSelx和CK的生長(zhǎng)速度比較

用血球計(jì)數(shù)板法將siSelx和CK濃度調(diào)整在1×104個(gè)/mL左右，然后按200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每排邊上2孔為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，剩余10孔為siSelx和CK細(xì)胞株各5孔(n=5)，其余7排與此相同。加樣后，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。每間隔24 h，對(duì)一排的細(xì)胞進(jìn)行處理，即棄培養(yǎng)液，加入新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基180 μL/孔，然后加入噻唑蘭(MTT)溶液(5 mg/mL)20 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。4 h后小心去掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL/孔的二甲基亞砜(DMSO)，反復(fù)吹打，使結(jié)晶物充分溶解。將孔內(nèi)液體吸至另一新的96孔板中，測(cè)定其在570 nm波長(zhǎng)處的吸收值，用空白孔調(diào)零，以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5siSelx和CK在H2O2處理前后的形態(tài)觀察

將siSelx和CK分別接種1個(gè)6孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到70%培養(yǎng)板時(shí)，在顯微鏡下觀察它們的形態(tài)特征；然后分別加入200 μmol/L H2O2處理2.5 h后，再觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.6硒蛋白基因表達(dá)定量分析

用血球計(jì)數(shù)板法將siSelx和CK濃度調(diào)整在2×104個(gè)/mL，按照0.5 mL/孔接種24孔培養(yǎng)板，每個(gè)細(xì)胞系各接種2板。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到90%培養(yǎng)板時(shí)，siSelx和CK分別加入H2O2終濃度為0或200 μmol/L的完全培養(yǎng)基處理2.5 h，然后收集細(xì)胞[9]：先用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗1次后，每孔加入200 μL的TRIzol regent，將4個(gè)孔樣品合并為1個(gè)樣(n=6)。用TRIzol法提取總RNA[14]，通過瓊脂糖電泳和核酸測(cè)定儀檢測(cè)其質(zhì)量，合格后將RNA濃度調(diào)整到200 ng/μL，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于基因定量分析。

25個(gè)硒蛋白基因和2個(gè)看家基因[β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]序列均從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載，采用ABI Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)定量引物，送上海生工生物公司合成，引物序列詳見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含：5.0 μL 2×SYBR Green Mix，cDNA 0.5 μL，上、下游引物混合液1.5 μL(2 μmol/L)，H2O 3.0 μL，每個(gè)樣重復(fù)2次。熒光定量PCR(RT-PCR)反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)，熔解曲線(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。定量數(shù)據(jù)采用ΔΔCt法計(jì)算分析，具體方法為：ΔCt值是目標(biāo)基因和參比基因Ct值的差值(ΔCt=Cttarget-Ctreference)，以空載CK中目標(biāo)基因表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，假定其表達(dá)量為1，其ΔCt值定為ΔCtR，其他樣品中目標(biāo)基因的ΔCt值減去ΔCtreference值的差值即為ΔΔCt(ΔCttarget-ΔCtreference)，根據(jù)基因PCR擴(kuò)增是2n擴(kuò)增的原理，則目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt。

表1　硒蛋白基因PCR引物序列

續(xù)表1基因Genes登錄號(hào)Accessionnumber上游引物Forwardprimers(5'—3')下游引物Reverseprimers(5'—3')SelsNM_203472.1AAGAAGCCCCAGGAGGAAGATCCCCGCAAAGGCTTTCSeltNM_016275.3TTGAGGAGTACATGCGGGTTATTATATATTGGTTGAGGGAGGTAATTCTCTSelxAF166124.1TCTCCAGCCGCTCGAAGTATGCTGTCGGCGTGAATGGTSelvNM-182704.1GTGACCTACTGTGGCCTCTGAAGTGCTGCTCCAGGCTCTTTTTSepp1NM_005410.2CCATCGCCTCATTACCATCATGTTGCTGATTCTCTGAAAGCTCACTSepw1NM_003009.2CGGCCGCCTGGACATAATCAACTTCCCGGCTACCASephs2U43286.1TCGTTGGCATTGTGGAAAAGTCGCGGCTTGTCAATGATC

1.7細(xì)胞抗氧化酶活性指標(biāo)分析

用血球計(jì)數(shù)板法將siSelx和CK濃度調(diào)整在2×104個(gè)/mL，按照2 mL/孔接種6孔培養(yǎng)板，每個(gè)細(xì)胞株各接種8板。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到90%培養(yǎng)板時(shí)，siSelx和CK分別加入H2O2終濃度為0或200 μmol/L的完全培養(yǎng)基處理2.5 h，然后收集細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS清洗2次，然后每孔加入150 μL的PBS，采用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，將4個(gè)孔樣品混合為1個(gè)樣(n=6)。細(xì)胞收集后，用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞釋放蛋白質(zhì)，離心后取上清測(cè)定抗氧化劑酶活性，按照試劑盒的操作說(shuō)明分別測(cè)定樣品GSH-Px、SOD活性及T-AOC。

1.8數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。生長(zhǎng)速率采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，硒蛋白基因表達(dá)量及酶活性指標(biāo)分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組之間的差異顯著性，并結(jié)合Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著水平。

2　結(jié)果與分析

2.1siSelx和CK生長(zhǎng)速率分析

活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，其在570 nm波長(zhǎng)處有特異的光吸收峰，該吸光度值可間接反映細(xì)胞數(shù)量。siSelx和CK生長(zhǎng)速率采用MTT法共連續(xù)測(cè)定8 d，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，Selx基因沉默后，LO2細(xì)胞株在570 nm處的吸光度值從第3天開始出現(xiàn)差異，siSelx組生長(zhǎng)速度在第3至7天均顯著低于對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，在第8天時(shí)2組在570 nm的吸光度值無(wú)差異。

siSelx：LO2的Selx基因沉默細(xì)胞株；CK：對(duì)照細(xì)胞株。下圖或表同。

siSelx: The LO2 cells withSelxknockdown; CK: control cells. The same as below.

圖1siSelx和CK生長(zhǎng)速率的分析比較

Fig.1Comparison of growth rate between siSelx and CK (n=5)

2.2Selx基因沉默及H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株形態(tài)的影響

Selx基因沉默及H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株形態(tài)的影響結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，Selx基因沉默后對(duì)LO2細(xì)胞株的形態(tài)沒有影響，CK和siSelx在形態(tài)上沒有明顯區(qū)別；經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2.5 h后，CK和siSelx均出現(xiàn)了一定程度形態(tài)變圓的變化。

CK-H2O2：H2O2處理對(duì)照細(xì)胞株；siSelx-H2O2：H2O2處理LO2的Selx基因沉默細(xì)胞株。下圖或表同。

siSelx: H2O2challenge the LO2 cells withSelxknockdown; CK: H2O2challenge control cells. The same as below.

圖2Selx基因沉默和H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株形態(tài)的影響

Fig.2Effects ofSelxknockdown and H2O2challenge on the morphology of LO2 cells

2.3Selx基因沉默及H2O2處理對(duì)細(xì)胞硒蛋白基因表達(dá)的影響

Selx基因沉默及H2O2處理對(duì)細(xì)胞硒蛋白基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。從圖中可看出，Selx基因在siSelx中基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其表達(dá)量只有對(duì)照組的26%。在LO2細(xì)胞株中，Selx基因沉默使Gpx6、Txnrd2和Seli基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，使Dio2、Dio3、Selm和Sepw1基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；H2O2處理顯著上調(diào)了Dio1基因的表達(dá)量(P<0.05)，顯著下調(diào)了Gpx2基因的表達(dá)量(P<0.05)；Selx基因沉默后H2O2處理細(xì)胞2.5 h，顯著上調(diào)了Gpx6、Txnrd2和Dio1基因的表達(dá)量(P<0.05)，顯著下調(diào)了Txnrd3、Dio2、Selm、Sepw1和Selv基因的表達(dá)量(P<0.05)。

2.4Selx基因沉默及H2O2處理對(duì)細(xì)胞抗氧化酶活性影響

Selx基因沉默和H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株中GSH-Px、SOD活性和T-AOC的影響結(jié)果見表2。從表中可看出，Selx基因沉默顯著提高了LO2細(xì)胞株中GSH-Px的活性(P<0.05)，提高了66.6%；顯著提高了SOD的活性(P<0.05)，提高了51.9%；對(duì)T-AOC無(wú)顯著影響(P>0.05)。H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞株中GSH-Px、SOD活性和T-AOC均無(wú)顯著影響(P>0.05)。Selx基因沉默后進(jìn)行H2O2處理，LO2細(xì)胞株中GSH-Px的活性與CK相比，顯著提高了1.97倍(P<0.05)；SOD活性與CK相比無(wú)顯著影響(P>0.05)，但與siSelx相比卻顯著降低了19.8%(P<0.05)；T-AOC的活性與CK及siSelx相比均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

3　討　論

基因沉默是研究基因功能的重要手段，由于硒蛋白基因3′-UTR在不同基因之間的序列同源性低，因此利用沉默技術(shù)針對(duì)硒蛋白基因3′-UTR設(shè)計(jì)引物對(duì)其沉默表達(dá)，成為研究硒蛋白基因功能的重要手段[11]。本研究在前期成功獲得Selx基因穩(wěn)定沉默LO2細(xì)胞株基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討Selx基因沉默對(duì)細(xì)胞中其他硒蛋白基因表達(dá)的影響。已知硒蛋白在維護(hù)機(jī)體正常生長(zhǎng)、繁殖、抗氧化等方面起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)硒蛋白基因沉默后影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，Txnrd1基因沉默后降低TMCK-1細(xì)胞生長(zhǎng)速率約10%左右[11]；Sep15基因沉默后顯著降低HCT116和HT29細(xì)胞生長(zhǎng)速率[13]。在本研究中，Selx基因沉默后顯著降低第3～7天LO2細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率，但對(duì)細(xì)胞株的形態(tài)沒有影響，H2O2處理明顯導(dǎo)致CK和siSelx形態(tài)發(fā)生改變。

硒蛋白是一類特殊蛋白，目前在任何哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定出25種硒蛋白[1]，研究表明，硒蛋白在動(dòng)物體內(nèi)起著重要功能。但硒蛋白相互之間是否存在功能互補(bǔ)或相互調(diào)控尚不清楚，在此本研究考察了Selx基因沉默后對(duì)其他硒蛋白基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，Selx基因沉默上調(diào)了Gpx6、Txnrd2和Seli基因的表達(dá)量，下調(diào)了Dio2、Dio3、Selm和Sepw1基因的表達(dá)量。在上調(diào)的硒蛋白基因中，Gpx6基因在機(jī)體內(nèi)主要起抗氧化保護(hù)機(jī)體的功能[15]；Txnrd2基因主要存在于動(dòng)物體的肝臟、腎臟以及心臟組織中，其主要功能是依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)催化各種氧化還原系統(tǒng)(主要是核糖核苷酸還原酶的DNA合成、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)等)，減少氧化的硫氧還蛋白[2]。下調(diào)的硒蛋白基因中，Dio2和Dio3基因都隸屬于脫碘酶家族，主要功能是參與動(dòng)物體內(nèi)甲狀腺激素的調(diào)節(jié)，從而影響物質(zhì)、能量的代謝[2]；Selx基因沉默后顯著降低LO2細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率，但是否是通過下調(diào)Dio2和Dio3基因而起作用尚不清楚；SelM基因具有硫醇-二硫化物異構(gòu)酶的活性，可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)二硫鍵的形成；SelW基因具有抗氧化劑或氧化還原的功能?；蛟诩?xì)胞中通常受到網(wǎng)絡(luò)狀調(diào)控，相互之間可能存在功能互作效應(yīng)，一個(gè)基因受抑制，可能其他基因會(huì)增加表達(dá)，以彌補(bǔ)功能不足。Selx基因沉默導(dǎo)致其他硒蛋白基因在LO2細(xì)胞株中上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，預(yù)示著這些基因與Selx基因之間可能存在功能互補(bǔ)或相互調(diào)控作用，但其調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。肝臟是重要代謝器官，Selx基因沉默是否影響肝細(xì)胞抗氧化損傷尚不清楚。ROS過量產(chǎn)生是細(xì)胞氧化損傷的主要因素，而H2O2是ROS的主要成分[16]，不同的細(xì)胞類型對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的敏感性不同，同時(shí)還受H2O2的濃度和處理時(shí)間的影響[12]。本試驗(yàn)考察了LO2細(xì)胞中Selx基因沉默后，再進(jìn)行H2O2氧化應(yīng)激處理，對(duì)其他硒蛋白基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示在Selx基因沉默條件下進(jìn)行H2O2應(yīng)激處理，導(dǎo)致LO2細(xì)胞株中Gpx6、Txnrd2和Dio1的表達(dá)量上調(diào)，Txnrd3、Dio2、Selm、Sepw1和Selv的表達(dá)量下調(diào)。其中Gpx6、Txnrd2、Dio1、Dio2、Selm和Sepw1在Selx基因沉默或H2O2處理中就有顯著差異表達(dá)，預(yù)示著Selx基因沉默和H2O2對(duì)LO2細(xì)胞株的氧化應(yīng)激損傷可能具有一定的疊加作用；單獨(dú)H2O2應(yīng)激處理時(shí)下調(diào)Gpx2表達(dá)量，Selx基因沉默影響Seli和Dio3表達(dá)量，但這3個(gè)基因在Selx基因沉默并伴隨H2O2應(yīng)激處理中無(wú)顯著差異表達(dá)(相對(duì)CK)，這預(yù)示著Selx基因沉默和H2O2對(duì)LO2細(xì)胞株的氧化損傷可能存在一定互補(bǔ)效應(yīng)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖3　Selx基因沉默和H2O2處理對(duì)LO2細(xì)胞硒蛋白基因表達(dá)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

Selx作為重要的氧化還原酶，在抵御機(jī)體受到氧化損傷中起著重要作用[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Selx基因沉默后進(jìn)行H2O2處理，顯著提高了LO2細(xì)胞株的凋亡率[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，Selx基因沉默或Selx基因沉默并伴隨H2O2處理均顯著提高了LO2細(xì)胞株中GSH-Px和SOD的活性，這可能是Selx基因沉默后，LO2細(xì)胞株的氧化還原功能減弱，反饋性增加了GSH-Px和SOD的分泌來(lái)維護(hù)機(jī)體的代謝平衡。H2O2單獨(dú)處理對(duì)LO2細(xì)胞株中GSH-Px和SOD的活性沒有顯著影響，這與H2O2處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[17]、HLE細(xì)胞[18]和PC12細(xì)胞[19]，使細(xì)胞中GSH-Px和SOD活性均顯著下降結(jié)果不一致，這可能是由于本試驗(yàn)H2O2使用濃度較低以及處理時(shí)間較短所致。

4　結(jié)　論

①Selx基因沉默后顯著降低了肝臟LO2細(xì)胞株的生長(zhǎng)速率。

②Selx基因沉默及H2O2處理影響了肝臟LO2細(xì)胞株中其他硒蛋白基因的表達(dá)。

③Selx基因沉默及H2O2處理影響了肝臟LO2細(xì)胞株GSH-Px、SOD活性。

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(責(zé)任編輯武海龍)

, associate professor, E-mail: zhua666@126.com

Effects of Selenoprotein x Knockdown and Hydrogen Peroxide Challenge on Selenoprotein Genes Expression and Antioxidant Enzyme Activities in Human Normal Hepatocyte

TANG JiayongZHAO Hua*JIA GangLIU GuangmangCHEN XiaolingCAI JingyiWU Caimei

(Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

The objective of this experiment was to explore the effects of selenoprotein x (Selx) gene knockdown and hydrogen peroxide (H2O2) challenge on selenoprotein genes expression and antioxidant enzyme activities in human normal hepatocyte (LO2), for further study its roles and regulatory relationship with other selenoprotein. The LO2 cells with Selx silenced (siSelx) and the control cells (CK) kept in our lab were used to compare the cell growth rates by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) methods. The siSelx and CK were further exposed to H2O2for 2.5 h, and the mRNA levels of selenoprotein genes and activities of GSH-Px, SOD and T-AOC in cells were detected. The results showed as follows: 1)Selxknockdown significantly decreased cell growth rates in LO2 cells (P<0.05). 2)Selxknockdown significantly up-regulatedGpx6,Txnrd2, Seli genes expression and significantly down-regulatedDio2,Dio3,SelmandSepw1 genes expression (P<0.05); H2O2challenge significantly up-regulated Dio1 gene expression and down-regulatedGpx2 gene expression (P<0.05);Selxknockdown followed H2O2challenge significantly up-regulatedGpx6,Txnrd2,Dio1 genes expression (P<0.05), and significantly down-regulatedTxnrd3,Dio2,Selm,Sepw1 andSelvgenes expression (P<0.05). 3)Selxknockdown significantly improved the activities of GSH-Px and SOD in LO2 cells (P<0.05). Selx knockdown followed H2O2challenge further significantly improved GSH-Px activity (P<0.05). In conclusion,Selxknockdown decreases the growth rate of LO2 cells and affects the expression of other selenoprotein genes with H2O2challenge, also affects the activities of GSH-Px and SOD.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2431-2438]

selenoprotein x gene; knockdown; H2O2; expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.014

2016-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31072043，31272468)；四川隆達(dá)畜牧科技有限公司項(xiàng)目(2015SCLD001)

湯加勇(1981—)，男，四川樂山人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究領(lǐng)域?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)。E-mail: 410699653@qq.com

趙華，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zhua666@126.com

S811.3

A

1006-267X(2016)08-2431-08