二乙烯三胺/一氧化氮聚合物誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷模型的建立

郭詠梅　張博綦　石惠宇　閆素梅　史彬林　郭曉宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

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二乙烯三胺/一氧化氮聚合物誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷模型的建立

郭詠梅張博綦石惠宇閆素梅*史彬林郭曉宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

泌乳期間的奶牛由于代謝旺盛，往往會(huì)產(chǎn)生大量一氧化氮(NO),誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。本試驗(yàn)旨在探討二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)氧化應(yīng)激的損傷條件，并建立氧化應(yīng)激模型。本試驗(yàn)利用不同濃度(0、10、30、100、500、1 000 μmol/L)的DETA/NO作為刺激源，作用BMEC 2、4、6、8、12、24 h，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、抗氧化指標(biāo)、炎癥因子和NO含量及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性，篩選適宜的DETA/NO作用時(shí)間及作用濃度，建立BMEC氧化損傷模型。結(jié)果表明：1 000 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞6 h，細(xì)胞存活率降低為74.27%，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性也均顯著降低(P<0.05)，然而，iNOS活性，NO、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、丙二醛含量則呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律，顯著升高(P<0.05)。綜上所述，1 000 μmol/L的DETA/NO處理細(xì)胞6 h，可構(gòu)建理想的BMEC氧化應(yīng)激模型。

二乙烯三胺/一氧化氮聚合物；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；氧化損傷

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在需要清除體內(nèi)老化的細(xì)胞或在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出機(jī)體對(duì)氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，并最終導(dǎo)致組織損傷，引起疾病、衰老、甚至死亡。處于泌乳期的奶牛代謝旺盛，尤其在圍產(chǎn)期和泌乳高峰期，由于機(jī)體產(chǎn)生較多的自由基而超過(guò)機(jī)體的防御能力，破壞蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，使機(jī)體正常的代謝發(fā)生紊亂，即產(chǎn)生氧化應(yīng)激[1]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)發(fā)生氧化應(yīng)激不僅會(huì)影響健康，還會(huì)因?yàn)檠趸a(chǎn)物的積累導(dǎo)致乳品質(zhì)降低[2]。建立可靠的氧化應(yīng)激模型,是揭示氧化應(yīng)激機(jī)制的重要措施之一，對(duì)改善奶牛健康和改進(jìn)乳品質(zhì)也具有重要意義。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子質(zhì)量小的生物自由基，研究證實(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的NO具有雙向調(diào)節(jié)功能。一方面，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO在體內(nèi)和體外都有抗菌及抗腫瘤的作用，保護(hù)動(dòng)物免除外界環(huán)境的感染[3]。另一方面，過(guò)高含量的NO還會(huì)導(dǎo)致活性氮的產(chǎn)生、細(xì)胞信號(hào)通路的阻斷以及全身性不可控制的炎癥，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[4]。二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(diethylenetriamine/nitric oxide adduct，DETA/NO)是一種人工合成的一氧化氮/核苷化合物，其特點(diǎn)在于它無(wú)需酶的催化作用，能夠快速釋放NO。同時(shí)，DETA/NO也是目前所獲得的半衰期最長(zhǎng)的一氧化氮/核苷化合物之一，有利于體外試驗(yàn)的長(zhǎng)時(shí)程觀察。因此，DETA/NO是較為理想的誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的外源性NO供體[5]。

然而，目前大多數(shù)細(xì)胞氧化損傷模型是以過(guò)氧化氫(H2O2)作為應(yīng)激源構(gòu)建的，關(guān)于以DETA/NO作為外源性NO供體構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型的報(bào)道鮮見(jiàn)，而針對(duì)BMEC構(gòu)建NO損傷模型的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)采用DETA/NO作為外源性NO供體，摸索造成體外培養(yǎng)的BMEC氧化損傷的適宜作用濃度和作用時(shí)間，建立DETA/NO氧化損傷模型，為進(jìn)一步深入探討B(tài)MEC氧化應(yīng)激機(jī)制及抗氧化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

DMEM/F12(貨號(hào)：12400-024)、胎牛血清(貨號(hào)：10099-141)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(貨號(hào)：51500-056)、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(貨號(hào)：25300054)、雙抗(貨號(hào)：15140-122)、膠原酶Ⅱ(貨號(hào)：17101-015)、表皮生長(zhǎng)因子(貨號(hào)：E4127)、氫化可的松(貨號(hào)：H0135)、催乳素(貨號(hào)：L6520)、兩性霉素B(貨號(hào)：AE437)、DETA/NO(貨號(hào)：146724-94-9)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.2試劑配制

DETA/NO培養(yǎng)液的配制：取10 mg DETA/NO溶于612.8 μL的超純水中，配制成濃度為0.1 mol/L的母液。再將DETA/NO母液按試驗(yàn)要求配制成不同濃度的DETA/NO貯備液(0、0.001、0.003、0.010、0.050、0.100 mol/L)。在試驗(yàn)開(kāi)始前，用不同濃度的DETA/NO貯備液配制成含不同濃度DETA/NO的細(xì)胞培養(yǎng)液(0、10、30、100、500、1 000 μmol/L)，保證各濃度培養(yǎng)液中加入的DETA/NO溶液體積相等，使細(xì)胞培養(yǎng)液中除DETA/NO濃度不同外，其他成分都相同。配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液用0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，每次換液時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用，并且避光保存。

1.3BMEC的制備

BMEC培養(yǎng)參照王新朋等[6]研究中所用的膠原酶消化法。于內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真屠宰場(chǎng)挑選采集健康的奶牛乳腺組織，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，去除乳腺外層組織，取數(shù)塊深層組織放入含3×雙抗的PBS中，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)中，依次經(jīng)含有3×雙抗的PBS清洗3遍、75%酒精(30 s)清洗1遍、含有1×雙抗的PBS清洗3遍。在深層腺泡多的地方剪取約1 mm3大小的組織塊塊裝入5 mL離心管中，進(jìn)一步充分剪碎后加入等體積的0.5%膠原酶Ⅱ。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中消化1 h，為使組織塊充分消化，期間每隔20 min拿出離心管輕輕搖晃1次。乳腺組織消化液用80目的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液于15 mL的離心管中，1 300 r/min離心5 min后，棄上清。培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待原代細(xì)胞的貼壁率達(dá)到80%～90%時(shí)，純化BMEC并進(jìn)行傳代。

本試驗(yàn)采用第3代傳代細(xì)胞進(jìn)行研究，細(xì)胞經(jīng)熒光免疫細(xì)胞染色法鑒定為BMEC[7]。連續(xù)培養(yǎng)到第3代時(shí)，將BMEC接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基(含0.5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、1 μg/mL氫化可的松、5 μg/mL催乳素、10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁率80%～90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，之后進(jìn)行后續(xù)測(cè)定試驗(yàn)。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)分為2部分。試驗(yàn)1采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將第3代貼壁生長(zhǎng)的BMEC隨機(jī)分為36個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，組細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加0、10、30、100、500、1 000 μmol/L的DETA/NO，使之分別作用2、4、6、8、12和24 h。其中，0 μmol/L為對(duì)照組。通過(guò)測(cè)定其對(duì)細(xì)胞存活率的影響，初步篩選DETA/NO適宜的作用時(shí)間。

試驗(yàn)2采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將第3代貼壁生長(zhǎng)的BMEC隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每組細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加0、10、30、100、500、1 000 μmol/L的DETA/NO。其中，0為對(duì)照組。DETA/NO作用時(shí)間以試驗(yàn)1篩選得出的時(shí)間為準(zhǔn)，以抗氧化指標(biāo)為依據(jù)，進(jìn)一步篩選出適宜的DETA/NO作用濃度。

1.5樣品采集

細(xì)胞培養(yǎng)液的采集：BMEC經(jīng)不同濃度的DETA/NO培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，以處理和重復(fù)為單位，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL Eppendorf管中，12 000 r/min離心10 min，收集上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性及NO、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量的測(cè)定。

細(xì)胞樣品的采集：BMEC經(jīng)不同濃度的DETA/NO培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h后，棄上清，將培養(yǎng)皿置于冰上，加入1 mL PBS清洗2遍，加入1 mL動(dòng)物細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，之后用細(xì)胞刮板刮取貼壁細(xì)胞，收集于到1.5 mL Eppendorf離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液用于細(xì)胞中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定。

1.6測(cè)定指標(biāo)與方法

BMEC存活率采用MTT法測(cè)定。將BMEC懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)，向各培養(yǎng)孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)；培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，甩板并拍干液體，再向每孔加入100 μL DMSO，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀振蕩10 min后，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值(OD490 nm)。吸光度值反映細(xì)胞的存活數(shù)量，吸光度值越高，說(shuō)明細(xì)胞的存活數(shù)量越多。

細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組OD490 nm/對(duì)照組OD490 nm)×100。

細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，CAT活性采用比色法測(cè)定。細(xì)胞中GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

細(xì)胞培養(yǎng)液中iNOS活性和NO、炎癥細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均采用雙抗體夾心法測(cè)定，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.7試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步整理及計(jì)算，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)　果

2.1DETA/NO作用濃度與作用時(shí)間對(duì)BMEC數(shù)量的影響

由表1可見(jiàn)，在不同的作用時(shí)間下，DETA/NO的作用濃度對(duì)BMEC數(shù)量有顯著的影響(P<0.05)，隨著DETA/NO濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量呈不同程度的降低，當(dāng)DETA/NO濃度為10 μmol/L時(shí)，作用時(shí)間為2、4、6 h時(shí)，DETA/NO對(duì)細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著影響(P>0.05)，當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)到8、12、24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，存活率分別為95.32%、92.54%、88.98%。當(dāng)DETA/NO濃度增加到30～500 μmol/L時(shí)，作用時(shí)間為2～6 h時(shí)，雖然細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且細(xì)胞存活率均在80%以上。當(dāng)DETA/NO濃度增加到1 000 μmol/L時(shí)，所有作用時(shí)間的細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組及其他各濃度組(P<0.05)。

隨著DETA/NO作用時(shí)間的延長(zhǎng)，DETA/NO各組的細(xì)胞數(shù)量均呈先降低又升高的趨勢(shì)。與作用2 h相比，作用4 h的各組細(xì)胞數(shù)量均呈下降趨勢(shì)，作用6 h，所有濃度組細(xì)胞數(shù)量均增加；但作用時(shí)間在6～24 h時(shí)，除500、1 000 μmol/L外，其他濃度組的細(xì)胞數(shù)量波動(dòng)較小。其中，細(xì)胞存活率在70%～80%內(nèi)的DETA/NO作用濃度與時(shí)間分別是：1 000 μmol/L DETA/NO作用細(xì)胞6 h，細(xì)胞存活率為74.27%；500 μmol/L DETA/NO作用細(xì)胞8 h，細(xì)胞存活率為78.94%；100 μmol/L DETA/NO作用細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率為76.60%。

2.2DETA/NO作用濃度對(duì)BMEC抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可見(jiàn)，DETA/NO濃度對(duì)細(xì)胞SOD活性有顯著的降低作用(P<0.05)。與對(duì)照組相比，10、30 μmol/L組SOD活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。其中，濃度為1 000 μmol/L的組SOD活性最低，顯著低于對(duì)照組和10、30、100 μmol/L組(P<0.05)，與500 μmol/L組相比，雖無(wú)顯著差異(P>0.05)，但在數(shù)值上低于500 μmol/L組。隨著DETA/NO濃度增大，細(xì)胞CAT活性也顯著下降(P<0.05)。與對(duì)照組相比，10 μmol/L組CAT活性無(wú)顯著變化(P>0.05)，其余各組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中，1 000 μmol/L組最低。細(xì)胞GPx活性也呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，對(duì)照組GPx活性最高，且與10 μmol/L組組間差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)DETA/NO濃度增加到30 μmol/L，GPx活性顯著低于對(duì)照組。1 000 μmol/L組顯著低于其他各組(P<0.05)。細(xì)胞MDA含量則呈現(xiàn)與GPx活性相反的變化規(guī)律。與對(duì)照組相比，10 μmol/L組無(wú)顯著變化(P>0.05)，但隨著DETA/NO濃度的進(jìn)一步增加，MDA含量逐漸升高。當(dāng)DETA/NO濃度增加到500～1 000 μmol/L時(shí)，MDA含量較高，顯著高于其他組(P<0.05)。500

與1 000 μmol/L組之間差異不顯著(P>0.05)，但在數(shù)值上1 000 μmol/L組MDA含量高于500 μmol/L組。

表1　DETA/NO作用濃度與作用時(shí)間對(duì)BMEC數(shù)量的影響(以O(shè)D490 nm表示)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscript mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2　DETA/NO作用濃度對(duì)BMEC抗氧化指標(biāo)的影響

2.3DETA/NO作用濃度對(duì)BMEC炎癥因子含量的影響

由表3可見(jiàn)，隨著DETA/NO濃度的增加，細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF含量呈不同程度的升高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，10 μmol/L組的細(xì)胞IL-6、TNF含量在數(shù)值上有所提高，但組間差異不顯著(P>0.05)。細(xì)胞IL-1含量在10 μmol/L組、IL-6和TNF含量在30 μmol/L組開(kāi)始顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。100、500 μmol/L組的細(xì)胞IL-1、TNF含量組間差異顯著(P<0.05)，同時(shí)顯著高于對(duì)照組及10、30 μmol/L組(P<0.05)。1 000 μmol/L組的細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF含量最高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與500 μmol/L組相比，無(wú)顯著差異(P>0.05)。BMEC經(jīng)不同濃度的DETA/NO處理后，細(xì)胞iNOS活性與NO含量變化規(guī)律相似。與對(duì)照組相比，10 μmol/L的DETA/NO對(duì)iNOS活性與NO含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。之后隨著DETA/NO濃度的增加，iNOS活性逐級(jí)顯著升高，當(dāng)濃度增加到1 000 μmol/L時(shí)，iNOS活性達(dá)到最大值，顯著高于其他各濃度組(P<0.05)。NO含量呈相似變化規(guī)律，100與500 μmol/L、500與1 000 μmol/L組間差異均不顯著(P>0.05)，但在數(shù)值上均隨DETA/NO濃度的增加有所提高。

表3　DETA/NO作用濃度對(duì)BMEC炎癥因子含量的影響

3　討　論

NO是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子,除了參與神經(jīng)信息傳遞、機(jī)體防御免疫以及細(xì)胞凋亡等生理功能維系外，現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)研究證明NO還與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8]。臨床病理學(xué)研究顯示過(guò)量一氧化氮合酶(NOS)、NO的產(chǎn)生和炎性介質(zhì)的大量表達(dá)在各病理器官中呈明顯相關(guān)性，這提示NOS及其合成的NO和次級(jí)產(chǎn)物活性氮等可引發(fā)炎癥反應(yīng)[9]。DETA/NO是一種人工合成的一氧化氮/核苷化合物，其特點(diǎn)在于它無(wú)需酶的催化作用，能夠快速釋放NO。同時(shí)，DETA/NO也是目前所獲得的半衰期最長(zhǎng)的一氧化氮/核苷化合物之一，有利于體外試驗(yàn)的長(zhǎng)時(shí)程觀察，是較為理想的外源性NO供體[5]。因此，以DETA/NO為NO供體，誘導(dǎo)BMEC建立氧化損傷模型，可為科學(xué)調(diào)控奶牛乳腺抗氧化能力及機(jī)制研究提供了更好的試驗(yàn)平臺(tái)。在關(guān)于氧化損傷模型的報(bào)道中，氧化應(yīng)激判別標(biāo)準(zhǔn)也有所不同。在孫婧陶等[10]的報(bào)道中，建立延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型時(shí)，以細(xì)胞存活率為50%～60%作為篩選H2O2適宜作用濃度與時(shí)間的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。齊曉龍等[11]以細(xì)胞存活率60%作為產(chǎn)蛋雞肝細(xì)胞氧化損傷模型的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。金鹿等[12]的研究指出，建立H2O2誘導(dǎo)的BMEC氧化損傷模型以細(xì)胞存活率70%～80%作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行H2O2的初步篩選。不同種類的細(xì)胞對(duì)于氧化損傷的耐受力不同，對(duì)于細(xì)胞存活率判別標(biāo)準(zhǔn)的選擇也不同。

由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，濃度為1 000 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞6 h、濃度為500 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞8 h、濃度為100 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率都在70%～80%，分別為74.27%、78.94%、76.60%。結(jié)果顯示，DETA/NO作用4 h與2 h相比，細(xì)胞存活率均下降，但均在80%以上。500～1 000 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞8～12 h，除濃度為500 μmol/L的DETA/NO作用8 h之外，其余組均對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化損傷，細(xì)胞存活率下降至70%以下，最低達(dá)到49.28%。濃度為1 000 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞6 h、濃度為500 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞8 h，細(xì)胞存活率雖然均下降到70%～80%，但考慮到操作過(guò)程中的作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將BMEC長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的DETA/NO，會(huì)造成細(xì)胞大量死亡，以及不可逆的細(xì)胞損傷，這不利于氧化損傷建模進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。因此，根據(jù)細(xì)胞存活率初步確定：濃度為1 000 μmol/L的DETA/NO作用細(xì)胞6 h即可發(fā)揮適宜的氧化損傷作用，細(xì)胞存活率為74.27%，符合篩選要求，并且可以在較短時(shí)間內(nèi)觀察到試驗(yàn)結(jié)果。

在正常生理情況下，自由基的產(chǎn)生和清除是處于動(dòng)態(tài)平衡的。如果機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處在病理狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基并在在體內(nèi)蓄積不能及時(shí)被清除，就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。清除體內(nèi)多余的自由基主要依賴于抗氧化損傷防御體系中的抗氧化酶,如CAT、SOD、GPx等，它們發(fā)揮著重要的抗氧化防御作用，可以直接清除體內(nèi)的多余的ROS，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。MDA是自由基，是檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要指標(biāo)，能反映出氧化應(yīng)激的程度[13-14]。因此，抗氧化指標(biāo)是反映細(xì)胞是否發(fā)生氧化應(yīng)激損傷及其損傷程度關(guān)鍵指標(biāo)，因此確定細(xì)胞氧化損傷模型時(shí)，除考慮細(xì)胞存活率外，還必須考慮這些指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果得出，與對(duì)照組相比，當(dāng)DETA/NO的作用時(shí)間為6 h時(shí)，作用濃度達(dá)到100 μmol/L即可引起SOD、CAT、GPx活性的顯著降低，MDA含量的顯著增加，說(shuō)明DETA/NO引起了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。此外，程廣東[15]的研究指出，當(dāng)機(jī)體的抗氧化酶含量或活性升高時(shí),機(jī)體往往也處于較高的免疫水平，表明氧化損傷與炎癥關(guān)系密切。

如前所述，NO是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子質(zhì)量小的生物自由基，它具有雙向調(diào)節(jié)作用，高含量狀態(tài)下，可以激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB),誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6等的產(chǎn)生，IL-1、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生又能激活iNOS，促使機(jī)體產(chǎn)生更多的NO，從而形成正反饋循環(huán)，使細(xì)胞因子的分泌以及其NO自身的合成得以持續(xù)，使炎癥反應(yīng)更持久，更劇烈，并最終引起DNA損傷，線粒體呼吸抑制等。其中重要的機(jī)制之一是超氧負(fù)離子的伴隨產(chǎn)生，兩者可以形成過(guò)氧亞硝酸鹽陰離子等活性氮，對(duì)重要蛋白質(zhì)進(jìn)行氮化修飾，改變信號(hào)途徑，直接和間接地介導(dǎo)了NO的細(xì)胞毒性效應(yīng)[9,16-17]。因此，NO與炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6均可反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度。本試驗(yàn)中，不同濃度的DETA/NO處理細(xì)胞后，在BMEC抗氧化能力下降的同時(shí)，各組的炎癥因子含量、NO含量及iNOS的活性也呈現(xiàn)出與抗氧化酶活性相反的變化趨勢(shì)；DETA/NO作用濃度達(dá)到30 μmol/L即可引起活性氮NO和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的顯著增加，說(shuō)明DETA/NO作用濃度達(dá)到30 μmol/L即可引起細(xì)胞不同程度的損傷。

建立氧化應(yīng)激模型時(shí)，細(xì)胞存活率不宜過(guò)高或過(guò)低，既要引起足夠的細(xì)胞損傷，同時(shí)還要考慮細(xì)胞存活率不可過(guò)低；若存活率過(guò)低，說(shuō)明大量的細(xì)胞已經(jīng)死亡，會(huì)造成細(xì)胞不可恢復(fù)的損傷，不利于后續(xù)試驗(yàn)研究；若存活率過(guò)高，說(shuō)明細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)較好，細(xì)胞的活力也較好，氧化后不會(huì)造成明顯的損傷，也不利于后續(xù)試驗(yàn)的開(kāi)展[11]。金鹿等[12]研究指出，BMEC存活率降低到70%～80%為宜。在本研究條件下，1 000 μmol/L組作用6 h不僅引起了細(xì)胞抗氧化能力的顯著降低與炎癥因子含量的顯著升高，又使細(xì)胞存活率保持在70%～80%。

綜上所述，以1 000 μmol/L的DETA/NO作為刺激源，作用細(xì)胞6 h，引起B(yǎng)MEC氧化損傷，這可以作為建立BMEC氧化損傷模型的適宜條件。

4　結(jié)　論

① 細(xì)胞存活率、抗氧化指標(biāo)及炎癥因子含量都可以作為判別BMEC是否發(fā)生氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。

② 經(jīng)1 000 μmol/L的DETA/NO處理細(xì)胞6 h后，SOD、CAT、GPx活性均顯著降低，MDA、炎癥因子及NO含量，iNOS活性均顯著上升，使BMEC產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激。以DETA/NO為應(yīng)激源，作用濃度為1 000 μmol/L作用時(shí)間為6 h，可以作為建立BMEC氧化損傷模型的適宜條件。

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(責(zé)任編輯王智航)

, professor, E-mail:yansmimau@163.com

Establishment of Oxidative Damage Model of Bovine Mammary Epithelial Cells Induced by Diethylenetriamine/Nitric Oxide Adduct

GUO YongmeiZHANG BoqiSHI HuiyuYAN Sumei*SHI BinlinGUO Xiaoyu

(College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Due to exuberant metabolism, dairy cows produce a great deal of nitric oxide (NO)during lactation, which leads to oxidative stress, and then results in cell toxicity. This experiment was conducted to investigate the suitable condition for oxidative damage model of bovine mammary epithelial cells (BMEC) induced by diethylenetriamine/nitric oxide adduct (DETA/NO) and establish an oxidative damage model. The oxidative damage model of BMEC was established using DETA/NO as the stimulation source. BMEC was exposed in DETA/NO with different medium concentrations (0, 10, 30, 100, 500 and 1 000 μmol/L) and for different times (2, 4, 6, 8, 12 and 24 h). According to the analysis of cell survival rate and antioxidative parameters, inflammatory cytokines and nitric oxide (NO) contents, as well as inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity, the suitable treatment time and concentration of DETA/NO were screened. The results showed that the survival rate decreased to 74.27%, and the activitise of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase also significantly reduced (P<0.05) after that BMEC was cultured with 1 000 μmol/L DETA/NO for 6 h. However, the activity of iNOS and the contents of NO, interleukin-1, interleukin-6, tumor necrosis factor-α and malondialdehyde showed opposite changes and increased significantly (P<0.05). In summary, the treatment of 1 000 μmol/L DETA/NO for 6 h is suitable for establishment of oxidative damage model.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2378-2384]

diethylenetriamine/nitric oxide adduct; bovine mammary epithelial cells; oxidative damage

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.008

2016-02-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560650)

郭詠梅(1989—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士研究生，從事動(dòng)物礦物質(zhì)與維生素營(yíng)養(yǎng)的研究。E-mail： ymguo2015@163.com

閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yansmimau@163.com

S823

A

1006-267X(2016)08-2378-07