人三陰性乳腺癌細(xì)胞耐藥株的建立及特性研究*

吳月琴，鐘山亮，張曉慧，唐金海，趙建華△

(1．南京醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院臨床檢驗中心，南京 210009；3.江蘇省腫瘤醫(yī)院普外科，南京 210009)

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·論著·

人三陰性乳腺癌細(xì)胞耐藥株的建立及特性研究*

吳月琴1，鐘山亮2，張曉慧2，唐金海3，趙建華2△

(1．南京醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院臨床檢驗中心，南京 210009；3.江蘇省腫瘤醫(yī)院普外科，南京 210009)

目的建立人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的多西紫杉醇(Doc)耐藥模型(MDA-MB-231/Doc)和表阿霉素(Epi)耐藥模型(MDA-MB-231/Epi)，探討其生物學(xué)特性。方法采用Doc和EPi低濃度逐步加量誘導(dǎo)法歷時12個月分別建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐藥細(xì)胞株。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分析、比較其生物學(xué)特性，實時熒光定量PCR檢測多藥耐藥基因(MDR1)mRNA表達(dá)，Western Blot法檢測P糖蛋白(P-gp)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(Her-2)的表達(dá)狀況。結(jié)果所構(gòu)建的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐藥株可分別在12 nmol/L Doc和800 nmol/L Epi中穩(wěn)定生長，在相同的藥物濃度下，耐藥細(xì)胞株的生長增殖率明顯高于親代細(xì)胞，其耐藥指數(shù)分別為親代敏感細(xì)胞的8.32倍和64.93倍，且相互呈交叉耐藥狀態(tài)。與親代細(xì)胞相比，兩株耐藥細(xì)胞處于G1期和G2期的細(xì)胞增加、處于S期的細(xì)胞減少，隨撤藥時間的延長，細(xì)胞的增殖速度加快。兩株耐藥株的MDR1基因表達(dá)水平增高，分別為親代細(xì)胞的4.05倍和5.96倍，P-gp表達(dá)為陽性。與MCF-7細(xì)胞株相比，MDA-MB-231細(xì)胞株ER、PR、HER2表達(dá)陰性，是典型的三陰性乳腺癌細(xì)胞株。結(jié)論成功建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的耐藥細(xì)胞株，其生長及耐藥性穩(wěn)定。

乳腺癌細(xì)胞；多西紫杉醇；表阿霉素；多藥耐藥

目前，乳腺癌是中國女性發(fā)病率最高的癌癥，癌癥死亡原因位居第六。每年中國乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。三陰性乳腺癌(TNBC)是雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(Her-2)均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，約占所有乳腺癌的10%～20%[2]。它們具有特殊的分子表達(dá)特征、侵襲行為和轉(zhuǎn)移模式,表現(xiàn)為對傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療和靶向治療均不敏感，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后極差。目前，多西紫杉醇(Doc)和表阿霉素(Epi)是三陰性乳腺癌患者最常用的藥物，尤其是聯(lián)合治療可獲得較好的控制效果[3-4]，但藥物耐藥常導(dǎo)致治療的最終失敗[5-6]。本研究以人三陰性乳腺癌細(xì)胞敏感株MDA-MB-231/S為親本細(xì)胞，通過低劑量逐漸加量法體外誘導(dǎo)建立系列耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi，并對它們的耐藥性和生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為探討腫瘤細(xì)胞對化療耐藥的機制及體外逆轉(zhuǎn)耐藥的策略，克服當(dāng)前化療中存在的這一主要障礙構(gòu)建研究平臺。

1　材料及方法

1.1主要試劑與儀器人乳腺癌細(xì)胞敏感株MDA-MB-231/S和MCF7/S購買于上海生物制品研究所，引進(jìn)于美國ATCC。DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶(HyClone)、培養(yǎng)皿、Sigma的四甲基偶氮唑鹽(MTT)、兔抗人P糖蛋白(P-gp)單克隆抗體(Abcam)、兔抗人ER單克隆抗體(Abcam)、兔抗人PR單克隆抗體(Abcam)、兔抗人Her-2單克隆抗體(Abcam)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(arigo)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(北京康為)及HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Cell Signaling)；MDR1引物(由上海閃晶生物公司設(shè)計及合成)、超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、美國BD-FACSCaluibur流式細(xì)胞儀等。

1.2方法

1.2.1MDA-MB-231/S細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB-231/S和MCF7/S細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞用胰酶消化傳代。

1.2.2MD2A-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐藥株的建立在MDA-MB-231/S的基礎(chǔ)上，通過低劑量逐漸加量法構(gòu)建耐藥細(xì)胞株。Doc的藥物濃度從0.2 nmol/L逐步加至13 nmol/L；Epi的濃度從10 nmol/L逐步到800 nmol/L，整個過程歷時一年左右。在進(jìn)行后續(xù)試驗前，細(xì)胞在無藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周以上，以排除藥物的影響。

1.2.3細(xì)胞的生長曲線、IC50和相對耐藥指數(shù)(RI)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成1×105/mL的單細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入100 μL含有不同藥物濃度的完全培養(yǎng)基，每個藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照和陰性對照。培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，待晶體徹底溶解后，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度。計算細(xì)胞生長增殖率和生長抑制率：生長增殖率=實驗組平均吸光值/對照組平均吸光值×100%；生長抑制率=1-(實驗組平均吸光值/對照組平均吸光值)×100%。以藥物濃度的對數(shù)作為縱坐標(biāo)，以細(xì)胞生長增殖率作為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線；根據(jù)細(xì)胞生長抑制率計算細(xì)胞生長抑制所需的各藥濃度(IC50)和RI。RI=耐藥細(xì)胞的IC50/親代細(xì)胞的IC50。試驗獨立重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞周期分布取對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化制成1 mL的單細(xì)胞懸液，預(yù)冷的70%乙醇固定，-20 ℃過夜，PBS洗脫2次，碘化丙啶(PI)避光染色30 min，以美國BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。獨立重復(fù)3次。

1.2.5MDR1基因相對定量測定用胰酶消化細(xì)胞，總RNA simple Total RNA Kit(離心柱型)試劑盒提取總的RNA，測A260/A280值并計算其純度和RNA含量；按BU-Script RT KIT 試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μL cDNA 作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR(LightCycle LC480擴增儀)。多藥耐藥(MDR)1引物：上游5′-GTT GCT GCT TAC ATT CAG GTT TC-3′，下游5′-ACC AGC CTA TCT CCT GTC GC-3′；β-actin引物：上游5′-CAC CTT CTA CAA TGA GCT GCG TGT G-3′，下游5′-ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA CGT AC-3′。以2-ΔΔCt計算MDR1 mRNA 的相對表達(dá)量。(6)Western Blot 檢測ER、PR、Her-2和P-gp的表達(dá)：提取蛋白，測蛋白濃度。蛋白上樣量由蛋白濃度換算，80 V電泳20 min，120 V電泳2 h；300 mA 濕轉(zhuǎn)2 h；室溫5%牛奶封閉1 h；兔抗人P-gp單克隆抗體(1∶2 000)、兔抗人ER單克隆抗體(1∶800)、兔抗人PR單克隆抗體(1∶2 000)、兔抗人HER2單克隆抗體(1∶10 000)及鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶10 000)，4 ℃過夜;HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶4 000)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫1 h；ECL液暗室發(fā)光顯影。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞形態(tài)MDA-MB-231/S貼壁生長，呈長梭形或多角形，排列均勻。加入Doc 1周后細(xì)胞變細(xì)，變長，核染色質(zhì)變粗糙；加入Epi 1周后細(xì)胞胞體變大，核質(zhì)比增加。加入藥物后敏感細(xì)胞不斷死亡，需數(shù)次換液不斷清除死細(xì)胞，僅存少量貼壁細(xì)胞。去藥2周后，細(xì)胞開始少量成團(tuán)生長，去藥4周后細(xì)胞基本恢復(fù)。見圖1。

圖1　倒置顯微鏡觀察多西紫杉醇和表阿霉素作用前后MDA-MB-231/S細(xì)胞形態(tài)變化(×100)

2.2細(xì)胞耐藥特性與MDA-MB-231/S相比，在相同的藥物濃度下，MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi對Doc和Epi有較高的耐藥特性(圖2)，并且其之間交叉耐藥(表1)。

2.3細(xì)胞周期經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，MDA-MB-231/S的G0/G1期細(xì)胞占總細(xì)胞的53.70%，G2/M期占16.90%，S期占29.40%，細(xì)胞凋亡4.53%；MDA-MB-231/Doc細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞占總細(xì)胞的55.46%，G2/M期占22.33%，S期占22.22%，細(xì)胞凋亡1.68%；MDA-MB-231/Epi細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞占總細(xì)胞的61.21%，G2/M期占9.61%，S期占29.10%，細(xì)胞凋亡1.58%。結(jié)果表明MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi處于G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，凋亡減少。

表1　MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi細(xì)胞的耐藥特性(n=3)

圖2　不同的藥物濃度下，MDA-MB-231/S與MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi生長增殖率的比較

2.4MDR1基因相對定量RT-qPCR 結(jié)果顯示，MDA-MB-231/Doc 細(xì)胞MDR1 mRNA 表達(dá)水平是MDA-MB-231/S 的4.05倍(P<0.05)；MDA-MB-231/Epi 細(xì)胞MDR1 mRNA 表達(dá)水平是MDA-MB-231/S 的5.96倍(P<0.05)。見圖3。

圖3　MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi 細(xì)胞MDR1 基因的相對表達(dá)

2.5Western Blot 結(jié)果結(jié)果顯示MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi與MCF-7/S相比，ER、PR和Her-2缺失，表現(xiàn)為三陰性。MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi與MDA-MB-231/S相比P-gp表達(dá)陽性。結(jié)果見圖4。

注：1為MDA-MB-231/S；2為MDA-MB-231/Doc；3為MDA-MB-231/Ep;4：MCF-7/S。

圖44株乳腺癌細(xì)胞中ER、PR、Her-2 及P-gp蛋白的表達(dá)

3　討　論

MDR是臨床化療急需攻克的難題，其耐藥相關(guān)機制仍未闡明[7-8]。通過一年低濃度逐漸加量法誘導(dǎo)成功的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi與MDA-MB-231/S相比，耐藥細(xì)胞株對Doc、Epi有較強的耐藥,并且相互之間交叉耐藥。同時耐藥細(xì)胞株G0/G1期的細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，凋亡減少。說明耐藥細(xì)胞株在建模中經(jīng)誘導(dǎo)獲得耐藥性后處于慢周期甚至靜息狀態(tài)，耐藥株對化療藥物的敏感度降低，具備了MDR的特性。

P-gp過表達(dá)是目前公認(rèn)的MDR生物學(xué)基礎(chǔ)，也被認(rèn)為是耐藥細(xì)胞經(jīng)典或最基本的標(biāo)志[9]。P-gp是人類MDR基因家族中，與耐藥有關(guān)的MDR1基因編碼。它不僅作為藥物，外排泵保護(hù)細(xì)胞免受有毒物質(zhì)侵襲，而且還可參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，介導(dǎo)MDR產(chǎn)生[10]。RT-qPCR及WesternBlot檢測到與親代細(xì)胞相比，MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的MDR1/P-gp表達(dá)上調(diào)。證實P-gp在Doc和Epi獲得性耐藥過程中被誘導(dǎo)產(chǎn)生并起關(guān)鍵作用。同時運用人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/S與MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi相比，三陰性乳腺癌細(xì)胞株的ER、PR和Her2表達(dá)陰性。進(jìn)一步說明了與其他類型乳腺癌相比，傳統(tǒng)的治療方法對于三陰性乳腺癌效果不明顯。而對于相對有效的化學(xué)藥物治療[11-12]，MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐藥模型的建立，為進(jìn)一步深入研究Doc和Epi的耐藥逆轉(zhuǎn)機制和三陰性乳腺癌的治療策略提供了

可靠的實驗?zāi)Ｐ秃蛥⒖家罁?jù)。

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Establishment of drug-resistant cell lines of human triple negative breast cancer and study on their characteristics*

WU Yueqin1，ZHONG Shanliang2,ZHANG Xiaohui2,TANG Jinhai3,ZHAO Jianhua2△

(1.GraduateSchool,NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu211166,China;2.ClinicalLaboratoryCentere,AffiliatedJiangsuProvincialTumorHospital,NanjingMedicalUniversity，Nanjing,Jiangsu210009,China;3.DepartmentofGeneralSurgery,JiangsuProvincialTumorHospital,Nanjing,Jiangsu210009,China)

ObjectiveTo establish docetaxel (Doc) resistant MDA-MB-231/Doc model and epirubicin (Epi) resistant MDA-MB-231/Epi mode from triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 and to explore their biological characteristics.MethodsThe MDA-MB-231/Doc and MDA-MB-231/Epi drug-resistant cell lines were respectively established by gradually increasing Doc or Epi concentrations induction method in 12 months.The biological characteristics of the cell lines were compared by the cell morphological observation,MTT and flow cytometry;the real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect multi-drug resistance gene (MDR1) mRNA expression；the expression of P glycoprotein(P-gp),estrogen receptor (ER),progesterone receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor 2 (Her-2) was detected by Western Blot.ResultsAfter the 12-month induction,the established MDA-MB-231/Doc could grow stably in the medium containing 12 nmol/L Doc,and MDA-MB-231/Epi could grow stably in the medium containing 800 nmol/L Epi;in the same drug concentration,the growth proliferation rate of the drug resistant cell line was significantly higher than that of the parental generation cells,their drug resistance indexes were 8.32 times and 64.93 rimes of parental generation sensitive cells,moreover which showed the mutual cross drug resistant status.Compared to the parental generation cells,the cells of stage G1and G2in two cell lines were increased and the cells of stage S were decreased,with the prolongation of drug withdrawal time,the cell proliferation speed was accelerated.The expression level of MDR1 gene was increased in the two drug-resistant cell lines，which were 4.05 times and 5.96 times of parental generation cells respectively,P-gp protein expression was positive.Compared with the MCF-7 cell line,ER,PR and Her2 expression in the MDA-MB-231 cell line was negative and typical triple negative breast cancer cell line.ConclusionThe drug resistance cell lines of MDA-MB-231/Doc and MDA-MB-231/Epi are successfully established with stable growth and drug resistance.

triple negative breast cancer cell line;docetaxel;epirubicin;multidrug resistant

2016-01-19修回日期：2016-05-03)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81272470)。

吳月琴，女，主管檢驗技師，主要從事乳腺癌分子生物學(xué)的研究。△

，E-mail:jhzhao2838@sina.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.001

A

1673-4130(2016)15-2049-03