益肺活血湯對(duì)大鼠慢性阻塞性肺疾病模型肺組織氧化抗氧化失衡的影響*

方庭正，段蘊(yùn)鈾，歐　敏

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)院，北京　100048；2.海軍總醫(yī)院干部病房呼吸內(nèi)科，北京　100048）

益肺活血湯對(duì)大鼠慢性阻塞性肺疾病模型肺組織氧化抗氧化失衡的影響*

方庭正1，段蘊(yùn)鈾1，歐敏2

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)院，北京100048；2.海軍總醫(yī)院干部病房呼吸內(nèi)科，北京100048）

［目的］觀察益肺活血湯對(duì)大鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型病理和肺功能的影響，評(píng)價(jià)其在氧化/抗氧化失衡機(jī)制方面的干預(yù)效應(yīng)。［方法］采用SPF級(jí)雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為對(duì)照組10只、COPD組15只、益肺活血湯組15只。COPD組采用氣管內(nèi)注射脂多糖聯(lián)合香煙煙霧吸入法制備大鼠COPD模型同時(shí)給予生理鹽水灌胃。益肺活血湯組在COPD組制備方法基礎(chǔ)上同時(shí)給予益肺活血湯灌胃治療。對(duì)照組則采用室內(nèi)環(huán)境喂養(yǎng)，氣管內(nèi)注射液生理鹽水，同時(shí)給予生理鹽水灌胃。模型制備及治療過程結(jié)束后檢測各組大鼠肺功能，并檢測肺組織中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量，轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45（NF-E2）相關(guān)因子-2（Nrf2）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）蛋白及mRNA表達(dá)。［結(jié)果］與對(duì)照組比較，模型組肺功能及肺組織病理切片提示COPD模型制備成功，MDA、GSH增高，SOD下降，NRF2和γ-GCS的蛋白及mRNA表達(dá)增高。與模型組比較，治療組肺功能和肺組織病理變化減輕，MDA、GSH下降，SOD增高，NRF2和γ-GCS的蛋白及mRNA表達(dá)下降。［結(jié)論］益肺活血湯能有效減輕氣管內(nèi)注射脂多糖聯(lián)合香煙煙霧吸入所造成的大鼠肺功能下降和肺組織病理變化。其機(jī)制應(yīng)與通過提高肺組織SOD的含量從而減輕氧化應(yīng)激有關(guān)，與激活Keap1-Nrf2-ARE通路引起γ-GCS基因和蛋白水平上調(diào)、GSH增多相關(guān)可能性小。

益肺活血湯；慢性阻塞性肺疾病；氧化應(yīng)激；氧化抗氧化失衡；大鼠

益肺活血湯是已故中國工程院董建華院士治療COPD的經(jīng)驗(yàn)方劑，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)能夠降低由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白高表達(dá)和活性氧（ROS）水平增高［3］。本課題將觀察益肺活血湯對(duì)大鼠COPD模型病理和肺功能的影響，并通過研究該藥對(duì)大鼠COPD模型肺組織中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量，轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45（NF-E2）相關(guān)因子-2（Nrf2）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）蛋白及mRNA表達(dá)的影響從而評(píng)價(jià)其在氧化/抗氧化失衡機(jī)制方面的干預(yù)效應(yīng)。

*基金項(xiàng)目：解放軍總后勤部保健專項(xiàng)科研課題（12BGZ19）。

作者簡介：方庭正（1982-），男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的中藥研究。

通訊作者：段蘊(yùn)鈾，E-mail：m18601922567@163.com。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑口鼻式吸入暴露染毒系統(tǒng)（柴田科學(xué)株式會(huì)社）、香煙煙霧發(fā)生器（柴田科學(xué)株式會(huì)社）、AniRes動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)、LOGENE PAS900病理圖像分析系統(tǒng) （無錫朗伽生物工程有限公司）、紅梅牌香煙（每支煙氣煙堿量0.9 mg，焦油量11 mg，煙氣一氧化碳量12 mg）、脂多糖（LPS）、9號(hào)直頭灌胃針、總谷胱甘肽檢測試劑盒（碧云天公司）、MDA檢測試劑盒（碧云天公司）、總SOD活性檢測試劑盒（碧云天公司）、引物由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥黃芪100 g，黨參120 g，白術(shù)60 g，當(dāng)歸90 g，桃仁120 g，紅花90 g，牛膝80 g，川芎50 g，赤芍60 g，陳皮70 g，柴胡50 g，桔梗50 g，枳殼60 g，甘草30 g，加重蒸水1 500 mL，同時(shí)煎沸20 min，合并兩次濾液4 000×g離心15 min后取上清液，濃縮至每1 mL含生藥1 g。分裝滅菌，備用。

1.3動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（250±20）g，鼠齡10周。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組及模型制作方法分組：將大鼠按照體質(zhì)量由低到高排序，依次采用Excel隨機(jī)分配無重復(fù)的大于等于1的整數(shù)，再按照所分配數(shù)值由小到大重新排序。第1～10只分配至對(duì)照組、11～25只分配至COPD組、26～40只分配至益肺活血湯組（以下簡稱中藥組）。

對(duì)照組：第1、14天，用1%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)。外部以聚焦光源照射頸部。撐開口腔后腹側(cè)方向可見隨呼吸一開一合的聲門，以9號(hào)直頭灌胃針快速插入氣管，將生理鹽水200 μL注入氣管內(nèi)。氣管注入后以軸位旋轉(zhuǎn)大鼠數(shù)次。室內(nèi)環(huán)境飼養(yǎng)28 d。第2天起灌服0.9%氯化鈉溶液（3.3 g/kg，每日2次），第14天不灌服，共26 d。第29天行肺功能檢查并處死動(dòng)物留取肺組織。

3.飼料投喂 放養(yǎng)一個(gè)月內(nèi)不用投喂，幼蝦以浮游生物為食。一個(gè)月后幼蝦達(dá)3cm以上，開始投喂羅氏沼蝦專用配合飼料，蛋白含量40%，投喂量為2kg/萬尾。此后，根據(jù)幼蝦攝食情況及時(shí)調(diào)整投喂量，一般日投喂量控制在蝦體重的2%左右，每日傍晚18：00前后投喂。

COPD組：第1、14天，以上述氣管注射方法將LPS（1 g/L）200 μL注入氣管內(nèi)。氣管注入后以軸位旋轉(zhuǎn)大鼠數(shù)次。第2～13、15～28天每天上午在口鼻式吸入暴露染毒系統(tǒng)內(nèi)熏吸香煙煙霧。香煙煙霧產(chǎn)生于香煙煙霧發(fā)生器內(nèi)。每次同時(shí)燃燒10支香煙，每吸15 mL，每支香煙以每分鐘1吸的速度共8吸，前后用時(shí)64 min，共燃燒84支香煙，煙霧濃度約40% （V/V）。第2天起灌服0.9%氯化鈉溶液（3.3 g/kg，每日2次），第14天不灌服，共26 d。第29天行肺功能檢查并處死動(dòng)物留取肺組織。

中藥組：以COPD組方法制備模型。第2天起灌服益肺活血湯3.3 g/kg，每日2次，該劑量系此前相關(guān)實(shí)驗(yàn)所提示大鼠模型有效劑量［3］。第14天不灌服，共26 d。第29天行肺功能檢查并處死動(dòng)物留取肺組織。

2.2檢測方法及步驟

2.2.1肺功能檢測用1%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)。于頸部正中剪開皮膚后逐層分離肌肉組織并暴露氣管。在氣管上段行T行切口并插入氣管插管，以縫線打結(jié)固定。將大鼠置入肺功能檢查儀器當(dāng)中，氣管插管與機(jī)器接口連接。按機(jī)器操作程序測定大鼠第0.3秒用力呼氣容積（FEV0.3）（單位mL）、用力肺活量（FVC）（單位mL）、FEV0.3/FVC。

2.2.2肺組織留取將大鼠放血處死，將氣管與雙肺暴露。取右肺組織置于-80℃冰箱中擬行GSH、MDA、SOD含量測定，Nrf2和γ-GCS蛋白免疫印跡檢測（Western blot）及Nrf2和γ-GCS mRNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。取左肺組織浸入4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化監(jiān)測。

2.2.3GSH、MDA和SOD含量測定大鼠肺組織與生理鹽水10%組織勻漿在12 000×g下離心5 min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，然后按照試劑盒說明書操作步驟，使用可見光分光光度計(jì)檢測大鼠肺組織GSH、MDA及SOD含量（單位分別為mg/mg、mmol/mg、U/mg）。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次，每個(gè)水平5個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值附標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.2.4HE染色用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇，最后入蒸餾水，就可染色。1）將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。2）酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘。3）流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻。4）入70%和90%乙醇中脫水各10 min。5）入乙醇伊紅染色液染色2 min。染色后的切片經(jīng)純乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明。將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，貼上標(biāo)箋，切片標(biāo)本就可使用。

2.2.5免疫組化檢測用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇，最后入蒸餾水，就可染色。切片放在Hydrogen Peroxide Block中孵育10～15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5 min，2次。滴加山羊血清，室溫孵育30 min。按抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶（SP）檢測試劑盒操作，滴加一抗工作液37℃孵育1h。滴加HRPPolymer（酶標(biāo)二抗）。向1mL DABPlusSubstrate中滴加1～2滴DABPlusChromogen，混勻后滴加到切片上，孵育2 min。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。LOGENE PAS900病理圖像分析系統(tǒng)（無錫朗伽生物工程有限公司）采集和分析圖像，檢測平均吸光度值（A），取平均值作為每只動(dòng)物陽性表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

2.2.6Westernblotting檢測于液氮中取出大鼠肺組織，按照試劑盒說明書，提取組織漿蛋白和核蛋白，并依據(jù)BCA法蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒說明測定蛋白濃度。嚴(yán)格按照Western blotting操作步驟及要求操作。8%分離膠、5%的積層膠；γ-GCS、Nrf2Ⅰ抗以1∶200封閉液稀釋，Ⅱ抗以1∶1 000稀釋，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法X膠片顯影定影后掃描至計(jì)算機(jī)，圖像分析系統(tǒng)計(jì)算待測條帶的吸光度×面積，與其內(nèi)參照βaction（細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的蛋白質(zhì)，用于與目的蛋白質(zhì)對(duì)比的參照物）條帶的吸光度×面積的比值，作為其蛋白質(zhì)表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。

2.2.7RT-PCR檢測右下肺組織加入1 mL Trizol，研磨成勻漿，室溫裂解5 min。提取RNA。將RNA模板濃度統(tǒng)一調(diào)至500 μg/L。按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)目的基因、內(nèi)參基因β-actin的引物，將設(shè)計(jì)好的引物送交北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。引物序列如下，見表1。

表1 引物序列Tab.1　Primer sequences

然后配置 PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μL；PCR上游引物（10 μmol/L）0.8 μL；PCR下游引物（10 μmol/L）0.8 μL；ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL；cDNA 3 μL；dH2O 5 μL。Real Time PCR反應(yīng)條件為：Stage 1：預(yù)變性95℃，30 s；Stage 2：PCR反應(yīng)，Reps：40；95℃，5 s；60℃，34 s（采集熒光）Dissociation Stage：95℃，15 s，60℃，60 s；95℃，15 s。將管家基因β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，以樣品目的基因得值與樣品內(nèi)參基因得值比值，得出樣品目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)量值。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1大鼠死亡情況對(duì)照組，死亡2只，原因考慮氣管注入生理鹽水過程中窒息死亡。COPD組死亡5只，3只系氣管注入生理鹽水過程中窒息死亡，2只系吸煙過程中動(dòng)物自行掉頭后窒息死亡。中藥組死亡1只，系氣管注藥物過程中窒息死亡。

3.2肺功能檢查結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠肺功能（±s）Tab.2　The lung function of rats in each group（±s）

表2　各組大鼠肺功能（±s）Tab.2　The lung function of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.001；與COPD組比較，**P＜0.001。

組別對(duì)照組COPD組中藥組動(dòng)物數(shù)8 10 14 FEV0.3（mL）　FEV0.3/FVC（%）5.433 0±0.456 8　77.593±6.342 4.139 6±0.321 8*　58.890±5.377* 4.874 6±0.269 4**　77.953±7.231**

3.3HE染色肺組織光鏡結(jié)果見圖1。對(duì)照組肺泡未見擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管周圍無炎癥細(xì)胞浸潤（圖1A）。COPD組細(xì)支氣管黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死。肺泡壁變薄，肺泡腔擴(kuò)大、破裂或形成大泡。細(xì)支氣管壁有炎癥細(xì)胞浸潤（圖1B）。中藥治療組可顯著緩解COPD組的病理改變（圖1C）。

3.4GSH、MDA和SOD含量見表3。

3.5RT-PCR檢測Nrf2 mRNA和γ-GCS mRNA表達(dá)結(jié)果見表4。

3.6Nrf2和γ-GCS蛋白表達(dá)

3.6.1免疫組化切片光鏡結(jié)果與對(duì)照組比較，COPD組大鼠肺組織中γ-GCS在支氣管和肺泡上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞中都為高表達(dá)，Nrf2在氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)增多。與模型組比較，中藥組肺組織中γ-GCS或Nrf2表達(dá)均減少。半定量分析結(jié)果見表5。

圖1　各組大鼠肺組織切片HE染色肺組織光鏡圖（×100）Fig.1　HE staining of lung tissue sections of rats under light microscope（×100）

表3　各組大鼠肺組織GSH、MDA和SOD的含量比較（±s）Tab.3　Comparison of the contents of GSH，MDA and SOD in lung tissue of rats in each group（±s）

表3　各組大鼠肺組織GSH、MDA和SOD的含量比較（±s）Tab.3　Comparison of the contents of GSH，MDA and SOD in lung tissue of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，**P＜0.05。

組別對(duì)照組COPD組中藥組動(dòng)物數(shù)8 10 14 GSH ［mg/（mg·prot）］SOD ［U/（mg·prot）］15.89±1.72　39.90±2.99　224.13±11.62 34.05±2.64*　72.86±3.18*　79.11±7.43* 25.74±2.52**　57.16±3.74**　184.06±9.71** MDA ［mmol/（mg·prot）］

表4　各組大鼠肺組織Nrf2 mRNA和γ-GCS mRNA表達(dá)水平的比較（±s）Tab.4　Comparison of the expression levels of Nrf2 and γ-GCS mRNA in lung tissue of rats in each group（±s）

表4　各組大鼠肺組織Nrf2 mRNA和γ-GCS mRNA表達(dá)水平的比較（±s）Tab.4　Comparison of the expression levels of Nrf2 and γ-GCS mRNA in lung tissue of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，**P＜0.05。

組別對(duì)照組COPD組中藥組動(dòng)物數(shù)8 10 14 Nrf2mRNA　γ-GCSmRNA 1.01±0.18　1.03±0.16 2.58±0.32*　2.66±0.37* 2.07±0.39**　2.18±0.29**

表5　各組大鼠肺組織免疫組化檢查Nrf2和γ-GCS蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.5　Comparison of the protein expression of immunohistochemistng staining of Nrf2 and γ-GCS in lung tissue of rats in each group（±s）

表5　各組大鼠肺組織免疫組化檢查Nrf2和γ-GCS蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.5　Comparison of the protein expression of immunohistochemistng staining of Nrf2 and γ-GCS in lung tissue of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，**P＜0.05。

組別對(duì)照組COPD組中藥組動(dòng)物數(shù)8 10 14 Nrf2（%）　γ-GCS（%）18.935±1.501　20.763±1.152 62.107±2.135*　68.471±1.346* 53.921±2.014**　53.600±0.754**

3.6.2Western blot檢測結(jié)果見表6、圖2。

表6　各組大鼠肺組織Western blot檢測Nrf2和γ-GCS蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.6　Comparison of the protein expression of Nrf2 and γ-GCS detected by Western blot in lung tissue of rats in each group（±s）

表6　各組大鼠肺組織Western blot檢測Nrf2和γ-GCS蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.6　Comparison of the protein expression of Nrf2 and γ-GCS detected by Western blot in lung tissue of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與COPD組比較，**P＜0.05。

組別對(duì)照組COPD組中藥組動(dòng)物數(shù)8 10 14 Nrf2　γ-GCS 1.02±0.11　1.01±0.09 2.67±0.29*　3.00±0.20* 2.07±0.25**　2.12±0.30**

4　討論

目前認(rèn)為細(xì)胞毒性產(chǎn)物MDA可以反映COPD患者組織細(xì)胞氧化損傷程度［2］，而GSH是肺內(nèi)抵御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵抗氧化劑，SOD則是重要的抗氧化酶［4-5］。γ-GCS是GSH合成的限速酶，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在COPD動(dòng)物模型和患者的肺組織中γ-GCS mRNA、γ-GCS蛋白含量都是增加的［6-9］。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在氧化劑作用下Nrf2活化并由胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，從而上調(diào)γ-GCS表達(dá)，促進(jìn)抗氧化物GSH的生成，在COPD的發(fā)展過程中起保護(hù)作用［4，6-7，10］。

圖2　各組大鼠肺組織Western blot檢測γ-GCS和Nrf2蛋白表達(dá)的比較Fig.2　Comparison of the protein expression of γ-GCS and Nrf2 detected by Western blot in lung tissue of rats in each group

益肺活血湯是已故中國工程院董建華院士治療COPD的經(jīng)驗(yàn)方劑，多年來一直應(yīng)用于COPD和肺源性心臟病治療，療效顯著［11-12］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)益肺活血湯能夠降低由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白高表達(dá)和ROS水平增高，從而抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖［3，13］。其中對(duì)ROS的干預(yù)效應(yīng)提示益肺活血湯可能具有抗氧化的生物效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)采取香煙煙霧吸入聯(lián)合氣管內(nèi)注射脂多糖方面制備大鼠COPD模型。肺功能結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較COPD組存在持續(xù)的氣流受限。而肺組織HE染色切片可見支氣管黏膜上皮細(xì)胞、纖毛、肺泡的廣泛病變，炎癥細(xì)胞浸潤，管壁黏液腺及杯狀細(xì)胞增生、肥大。結(jié)合中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的慢性阻塞性肺疾病診治指南認(rèn)為大鼠COPD模型制備成功［1］。

COPD組大鼠MDA顯著增高說明肺組織內(nèi)存在嚴(yán)重細(xì)胞氧化損傷，這與目前認(rèn)為COPD發(fā)病機(jī)制中存在氧化/抗氧失衡一致。而肺組織中Nrf2和γ-GCS mRNA和蛋白增加、GSH水平增高說明COPD組大鼠肺組織受香煙煙霧刺激后抗氧化系統(tǒng)反應(yīng)性上調(diào)——Nrf2激活、γ-GCS上調(diào)和GSH增多。這與以往研究中所提示的COPD氧化/抗氧化失衡中Nrf2的激活、開啟Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路、促進(jìn)抗氧化物GSH的表達(dá)，從而抵抗氧化損傷、在COPD的發(fā)展過程中起保護(hù)作用的結(jié)論一致［4，6-7，10］。但以往也有研究提示Nrf2激活體現(xiàn)在蛋白水平而非mRNA水平［7］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組Nrf2 mRNA水平的增高與這一結(jié)論并不一致。模型組SOD的顯著減少則說明在氧化應(yīng)激的過程中存在著過氧化物酶活性的受損。既往的研究已經(jīng)提示無論是在COPD患者還是動(dòng)物模型當(dāng)中都存在這種SOD受損現(xiàn)象［2，14-15］，也有研究采用基因敲除動(dòng)物模型的方法發(fā)現(xiàn)SOD基因缺陷會(huì)加重吸煙或氣管內(nèi)注射彈性蛋白酶誘發(fā)的肺氣腫和細(xì)胞外基質(zhì)破壞［5］。

與COPD模型組比較，治療組在肺功能方面有顯著改善，支氣管上皮細(xì)胞和纖毛病變、肺氣腫、炎癥細(xì)胞浸潤等病理變化也顯著減輕。治療組MDA降低、Nrf2和γ-GCS的mRNA和蛋白、GSH含量降低。這說明通過益肺活血湯的治療，肺組織細(xì)胞氧化損傷減輕。而Nrf2與keap1解離減少、Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路作用減弱則應(yīng)當(dāng)是肺組織細(xì)胞氧化應(yīng)激減輕后的反應(yīng)性變化。這也提示益肺活血湯對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用可能并非是通過激活Keap1-Nrf2-ARE通路、引起γ-GCS基因和蛋白水平上調(diào)、GSH增多得以實(shí)現(xiàn)。另一方面益肺活血湯組肺組織SOD含量的增多，則提示該藥的抗氧化作用可能是通過提高肺組織SOD的含量得以實(shí)現(xiàn)。目前關(guān)于COPD發(fā)病機(jī)制中SOD作用的相關(guān)研究認(rèn)為真正發(fā)揮抗氧化作用的是位于細(xì)胞外的SOD3［5，16-17］。下一步實(shí)驗(yàn)在重復(fù)益肺活血湯改善動(dòng)物模型肺功能及病理改變的同時(shí)，可研究益肺活血湯對(duì)SOD3的影響從而進(jìn)一步探明益肺活血湯的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物死亡偏多，導(dǎo)致最終標(biāo)本例數(shù)偏少。下一步可在增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)目、熟練操作技能的前提下重復(fù)本實(shí)驗(yàn)，從而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)僅僅采用了3.3 g/kg這一個(gè)劑量組，不利于證實(shí)藥效作用。這主要是因?yàn)樵诩韧鶎?shí)驗(yàn)［3］中該劑量對(duì)大鼠顯示出生物學(xué)效應(yīng)，而既往實(shí)驗(yàn)中較低的一個(gè)劑量組（0.66 g/kg）并未顯示出生物學(xué)效應(yīng)。而既往實(shí)驗(yàn)中較高的另一個(gè)劑量（16.5 g/kg）雖然顯示了明顯生物學(xué)效應(yīng)，但在本研中由于大鼠體質(zhì)量較既往實(shí)驗(yàn)中大，造成此劑量下藥物體積大、灌胃難度大且預(yù)實(shí)驗(yàn)中死亡率高，最終放棄該劑量實(shí)驗(yàn)。未來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)探索使用其他劑量，從而更充分的證明藥效。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南 （2013年修訂版）［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36（4）：255-264.

［2］Zeng M，Li Y，Jiang Y，et al.Local and systemic oxidative stress and glucocorticoid receptor levels in chronic obstructive pulmonary disease patients［J］.Can Respir J，2013，20（1）:35-41.

［3］張凌云，歐敏，顧玨，等.益肺活血湯對(duì)缺氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1α和活性氧的影響［J］.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2012，1（2）：69-72.

［4］江敏，高振，李風(fēng)森，等.Keap1-Nrf2-ARE通路與慢性阻塞性肺疾病氧化/抗氧化失衡關(guān)系［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2013，33（2）:165-169.

［5］Yao H，Arunachalam G，Hwang JW，et al.Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（35）:15571-15576.

［6］李宇航，鐘相根，賈旭，等.通利大腸對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織γ-GCS及NRF2 mRNA表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（11）:1785-1788.

［7］劉曉燕，戴愛國，胡瑞成，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠轉(zhuǎn)錄因子KLF2對(duì)NRF2調(diào)控γ-GCS表達(dá)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（2）:173-178.

［8］馮青青，夏熙鄭.慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中Bach1和γ-GCS的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，48（4）:474-477.

［9］Rahman I，Schadewijik AA，Hiemstra PS，et al.Location of gammaglutamylcysteine synthetase messenger RNA expression in lungs of smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］. Free Radic Biol Med，2000，28:920-925.

［10］Singh A，Ling GY，Subasini AN，et al.Nrf2 dependent sulfiredoxin-1 expression protects against cigarette smoke-induced oxidative stress in lungs［J］.Free Radic Biol Med，2009，46（3）:376-386.

［11］歐敏，顧玨，吳育云.益肺活血湯對(duì)老年慢性肺源性心臟病患者一氧化氮及一氧化氮合酶的影響［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2011，25 （5）:406-408.

［12］歐敏，馬路，王琪，等.益肺活血湯治療老年肺心病56例臨床觀察［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，39（6）：419-421.

［13］張凌云，歐敏，黃友章，等.益肺活血湯對(duì)缺氧培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞NO，iNOS的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17 （23）:117-120.

［14］張梓楠，馮瑩，楊瀟，等.氧自由基在COPD患者中的變化及臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2013，18（7）:1225-1226.

［15］張偉，孫璐璐，韓佳，等.COPD模型大鼠不同分期肝、肺組織γ-GCSmRNA表達(dá)水平的比較研究［J］.北京中醫(yī)藥，2012，31（10）: 786-789.

［16］Morten D，Russell P B，Klaus J，et al.Superoxide Dismutase 3 Polymorphism Associated with reduced Lung Function in Two Large Populations［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178:906-912.

［17］夏大慶，徐曉玲，夏淮玲，等.超氧化物歧化酶基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系［J］.中國慢性病預(yù)防與控制，2013，21（4）: 395-398.

（本文編輯：高杉，滕曉東）

Effect of Yifei Huoxue soup on the lung tissue oxidant/antioxidant imbalance in COPD rats

FANG Ting-zheng1，DUAN Yun-you1，OU Min2
（1.Navy Clinical Medical College of Second Military Medical University，Beijing 100048，China；2.VIP Respiratory Department of Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

［Objective］The aim of this study is to evaluate the effect of Yifei Huoxue soup（YFHXS）intervention on pathology，pulmonary function，oxidative stress and antioxidant status of COPD rats.［Methods］Forty SPF-grade male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the control group（n=10），the COPD model group（n=15）and the YFHXS group（n=15）.The COPD rat model was established by exposure to cigarettes smoke plus intratracheal injecting of lipopolysaccharide（LPS）and administered with physiological saline by gastro gavage.YFHXS group was established in the same way as COPD model group and administered with YFHXS by gastro gavage.The control group was administered with physiological saline by gastro gavage.After all medication，pulmonary function was measured by testing FEV0.3，F(xiàn)EV0.3/FVC and PEF.Morphological changes of the lung tissue were observed under microscope after H&E staining.The level of MDA，SOD and GSH were detected to estimate the oxidative stress level in rat lungs.The expression of Nrf2 and γ-GCS in the lung tissue were also detected.［Results］The difference between pulmonary function and pathology in COPD group with in control group indicated that the COPD model was made up successfully.In contrast with the control group，the COPD group had a significant increase in MDA and GSH，where as there was a significant decrease in SOD levels.The γ-GCS and Nrf2 both in mRNA and protein levels were also detected higher in COPD group than in control group.In comparison with COPD group，YFHXS was effective to increase pulmonary function and improve lung pathological impairment.YFHXS treatment decreased MDA and GSH，while improved SOD levels.The γ-GCS and Nrf2 both in mRNA and protein levels were also detected decreased in YFHXS group than in COPD group.［Conclusion］YFHXS was effective to improve pulmonary function and lung pathological impairment which were caused by exposing to smoke plus LPS. YFHXS showed antioxidative capacity by improving SOD levels.However，it was unlikely that the antioxidative effect of YFHXS was associated with activation of Keap1-Nrf2-ARE pathway and increase of γ-GCS and GSH levels.

Yifei Huoxue soup；COPD；oxidant stress；oxidant；antioxidant imbalance；rat

R563.5

A

1672-1519（2016）07-0419-06

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.10

2016-02-27）