白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系PC-3凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

郭　勇，田曉麗，范瓊瑛，任秋霞，吳亞坤，蘇軍華*

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050000；3.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院腦內(nèi)科，河北 石家莊 050082)

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·論著·

白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系PC-3凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

郭勇1，田曉麗2，范瓊瑛1，任秋霞3，吳亞坤2，蘇軍華2*

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050000；3.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院腦內(nèi)科，河北 石家莊 050082)

[摘要]目的探討白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞凋亡的作用。方法采用MTT比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞的增殖抑制情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡情況；采用RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)凋亡基因mRNA表達(dá)的情況。結(jié)果 B、C、D組PC-3細(xì)胞均有不同程度的抑制。24、48、72 h C、D組細(xì)胞生長抑制率高于B組，D組細(xì)胞生長抑制率高于C組(P<0.05)。B、C、D組48、72 h細(xì)胞生長抑制率高于24 h，72 h細(xì)胞生長抑制率高于48 h(P<0.05)。S期、G2/M期細(xì)胞比例明顯下降,G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升, 且隨藥物濃度的增加，凋亡率明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D組PC-3細(xì)胞bcl-2表達(dá)水平低于A組，D組低于B組(P<0.05)；B、C、D組PC-3細(xì)胞bax表達(dá)水平高于A組，C、D組高于B組，D組高于C組(P<0.05)。結(jié)論白藜蘆醇具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期等作用，能達(dá)到很好的抗腫瘤效果，值得臨床上廣泛應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]前列腺癌;白藜蘆醇;PC-3;細(xì)胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.025

前列腺癌好發(fā)于老年男性，在我國發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。由于目前沒有徹底有效的治愈方法，因此研究新的治療前列腺癌的方法顯得尤為重要。白藜蘆醇是從藜蘆的根部分離而得，已發(fā)現(xiàn)在72種植物中可以獲得。白藜蘆醇的作用非常廣泛，包括抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)等多方面。在臨床方面，白藜蘆醇對(duì)多種惡性晚期腫瘤的治療都有一定的效果[1-3]。本研究對(duì)白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系PC-3凋亡的作用進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1主要試劑與儀器 白藜蘆醇(購自美國Sigma公司)，前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞(來自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室)，RPMI1640培養(yǎng)液(Gibcobrl公司)，PCR提取及擴(kuò)增試劑盒(購自Takara 公司)。Biorad凝膠成像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及白藜蘆醇工作液配制將前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，培養(yǎng)液中含300 mg/L谷氨酰胺、10%新生牛血清，5%CO2培養(yǎng)箱為37 ℃飽和濕度溫箱。每天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)約85%貼壁時(shí)，2 d傳1代。白藜蘆醇用雙蒸水100%二甲基亞砜溶解后,滅菌，離心，取上清分別配制濃度為0.2、0.5、0.8 g/L白藜蘆醇工作液，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(A組)和實(shí)驗(yàn)組(B、C、D組)。B組為加入濃度0.2 g/L白藜蘆醇后的PC-3細(xì)胞，C組為加入濃度0.5 g/L白藜蘆醇后的PC-3細(xì)胞，D組為加入濃度0.8 g/L白藜蘆醇后的PC-3細(xì)胞。

1.2.3MTT比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞的增殖抑制情況。取對(duì)數(shù)期人前列腺癌PC-3細(xì)胞株接種120孔板，每孔100 μL。A組接種10孔在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h；B組接種30孔，其中10孔使藥物作用24 h，10孔使藥物作用48 h，10孔使藥物作用72 h；C組接種30孔，其中10孔使藥物作用24 h，10孔使藥物作用48 h，10孔使藥物作用72 h；D組接種30孔，其中10孔使藥物作用24 h，10孔使藥物作用48 h，10孔使藥物作用72 h。24、48、72 h后每孔加入MTT 50 μL，孵育4 h后去除培養(yǎng)液 ,再加入二甲基亞砜100 μL，振蕩10 min，使絮狀物完全溶解。590 nm波長酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上分別測(cè)定吸光度(optical density，OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率=(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/對(duì)照組平均OD值×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢查前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡情況。A、B、C、D 4組細(xì)胞各30孔，均采用70%冷乙醇固定,PBS液沖洗2次,過夜，之后用PBS液沖洗1次,加入RNA酶酶切、碘化丙啶染色后, 室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件Modfit分析，得出細(xì)胞凋亡比例及周期分布。G2/M阻滯用G2期細(xì)胞所占比率表示[4]。

1.2.5RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)凋亡基因mRNA的表達(dá)情況。經(jīng)白藜蘆醇作用24 h后，用胰蛋白酶適度消化、收集PC-3細(xì)胞, TRIzol法提取細(xì)胞總mRNA；NanoDrop(Thermo)聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。隨后根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)所提供的方法對(duì)提取出的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。bax：sense 5′-TTTCTGACGGCAACTTCAACTG-3′, antisense 5′-CAACCACCCTGGTCTTGGAT-3′；bcl-2：sense 5′-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3′, antisense 5′-GTTGACGCTCTCCACACACAT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳,用Biorad凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析,用Chemi-Imager5500 軟件測(cè)定OD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1細(xì)胞生長抑制率比較A組無細(xì)胞生長抑制，B、C、D組PC-3細(xì)胞均有不同程度的抑制。24、48、72 h C、D組細(xì)胞生長抑制率高于B組，D組細(xì)胞生長抑制率高于C組(P<0.05)。B、C、D組48、72 h細(xì)胞生長抑制率高于24 h，72 h細(xì)胞生長抑制率高于48 h(P<0.05)。隨白藜蘆醇濃度增加及時(shí)間的延長，PC-3細(xì)胞生長抑制率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1各組細(xì)胞生長抑制率比較

組別細(xì)胞生長抑制率24h48h72hFPA組000B組13.25±1.0228.64±3.12△36.84±3.15△▲207.8970.000C組21.92±2.34*41.28±6.23*△54.31±5.64*△▲104.7140.000D組32.85±3.14*#58.15±7.28*#△64.04±6.23*#△▲81.0260.000F176.72464.75970.75P0.0000.0000.000

*P<0.05與B組比較#P<0.05與C組比較△P<0.05與24 h比較▲P<0.05與48 h比較(q檢驗(yàn))

2.2細(xì)胞周期分布及誘導(dǎo)凋亡情況比較S期、G2/M期PC-3細(xì)胞比例明顯下降,G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升；隨藥物濃度的增加，凋亡率明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2 。

表2　各組細(xì)胞周期分布及誘導(dǎo)凋亡情況比較　(n=30，例數(shù)，%)

*P<0.05與A組比較(秩和檢驗(yàn))

2.3凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較4組bcl-2和bax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D組PC-3細(xì)胞bcl-2表達(dá)水平低于A組，D組低于B組；B、C、D組的PC-3細(xì)胞bax表達(dá)水平高于A組，C、D組高于B組，D組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3各組PC-3細(xì)胞bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平比較

組別OD值bcl-2baxA組0.042±0.0020.035±0.004B組0.039±0.0030.041±0.003*C組0.037±0.003*0.052±0.004*#D組0.035±0.002*#0.061±0.003*#△F8.38479.144P0.0000.000

*P<0.05與A組比較#P<0.05與B組比較△P<0.05與C組比較(q檢驗(yàn))

3　討　　論

前列腺癌是中老年男性發(fā)病率較高的腫瘤之一，是引起美國男性死亡的第二大癌癥，而在我國前列腺癌發(fā)病率也在迅速增加[5-6]。由于前列腺癌的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前并無有效的藥物能夠根治。有研究證實(shí)，黃酮和多酚類化合物能夠很好地預(yù)防、治療前列腺癌[7]。

白藜蘆醇屬于多酚類化合物，具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗腫瘤、抑制血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)作用、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)酶、抗炎、心血管保護(hù)等[8]。此外，白藜蘆醇還具有抗肝纖維化、治療休克、抗衰老、抗氧化、減肥、美容等多種功效。臨床大量研究均表明，在治療如肝癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等多種晚期惡性腫瘤患者時(shí)，應(yīng)用化療藥物聯(lián)合白藜蘆醇臨床療效顯著。針對(duì)胃腸道等消化系統(tǒng)惡性腫瘤，白藜蘆醇能抑制腫瘤增殖，可綜合性多靶位地調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的各個(gè)層次的分子,起到調(diào)節(jié)平衡的作用[13-14]。還能抑制轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞PC-3M-IE8增殖和減弱腫瘤侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，在前列腺癌系PC-3細(xì)胞中，加入0.8 g/L的白藜蘆醇作用72 h后，PC-3細(xì)胞生長抑制率能達(dá)到(64.04±6.23)%。充分證實(shí)了白藜蘆醇抑制細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞凋亡是在多種基因調(diào)控下，細(xì)胞啟動(dòng)預(yù)定的凋亡程序，發(fā)生生理死亡的過程，又稱程序性死亡，在細(xì)胞衰老、腫瘤的發(fā)生中起重要作用[15]。而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物的重要機(jī)制，也是治療腫瘤的重要途徑之一。細(xì)胞周期阻滯能抑制腫瘤細(xì)胞增殖且會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]，細(xì)胞G2/M期受到阻滯能阻止DNA受損傷的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，因此細(xì)胞G2/M期的阻滯是藥物抗腫瘤機(jī)制的重要靶點(diǎn)。白藜蘆醇能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，一定程度上能抑制腫瘤增殖，減慢腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，未加入白藜蘆醇的PC-3細(xì)胞，G2/M期細(xì)胞比例為26.67%，加入0.8 g/L白藜蘆醇的PC-3細(xì)胞，G2/M期細(xì)胞比例為6.67%，表明白藜蘆醇具有顯著的增殖抑制作用和抑制集落生長作用，能夠抑制增殖和細(xì)胞周期阻滯；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞是否進(jìn)入G2/M阻滯，加入不同濃度白藜蘆醇作用24 h后，S期、M期比例明顯下降,G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升，表明白藜蘆醇能降低DNA的合成,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

bax和bcl-2是bcl2家族中重要的調(diào)控凋亡的基因，細(xì)胞凋亡或增殖是由二者的相互作用決定的，其中bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡,bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[17]。bax主要分布在細(xì)胞基質(zhì)中，通過促進(jìn)PT孔通道開放，使色素細(xì)胞C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，從而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bcl-2屬于膜結(jié)合蛋白定位于線粒體的外膜中，一般以同源二聚體的形式存在，可以抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇可以抑制基因(bax、bc1-2)的表達(dá)，而且隨著濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。表明白藜蘆醇主要是使凋亡促進(jìn)基因bax上調(diào)，同時(shí)使凋亡抑制基因bcl-2下調(diào)，進(jìn)而使bcl-2/bax比值下降，最終達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的。

綜上所述，白藜蘆醇具有誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制PC-3細(xì)胞基因的表達(dá)增殖等作用，高濃度的白藜蘆醇的抑制作用更強(qiáng)，能達(dá)到很好的抗腫瘤作用，可能是抗前列腺癌的機(jī)制之一。白藜蘆醇在人前列腺癌治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文編輯：趙麗潔)

[收稿日期]2016-02-24；[修回日期]2016-07-04

[作者簡介]郭勇(1976-)，男，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事泌尿外科疾病診治研究。 *通訊作者：E-mail:1120237924@qq.com

[中圖分類號(hào)]R737.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)07-0838-04