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    西藥聯合理氣中藥對糖尿病大鼠胃排空延遲的影響及其機制研究*

    2016-08-11 08:57:09張毅宏楊國莉曹澤偉王天錫高俊琴
    天津中醫(yī)藥 2016年6期
    關鍵詞:肌間理氣排空

    張毅宏,楊國莉,付 瑩,張 釗,曹澤偉,張 俊,王天錫,郭 娜,高俊琴

    (1.天津市北辰醫(yī)院消化內科,天津 300400;2.天津市南開醫(yī)院消化內科,天津 300100)

    西藥聯合理氣中藥對糖尿病大鼠胃排空延遲的影響及其機制研究*

    張毅宏1,楊國莉1,付瑩1,張釗2,曹澤偉2,張俊1,王天錫2,郭娜2,高俊琴1

    (1.天津市北辰醫(yī)院消化內科,天津300400;2.天津市南開醫(yī)院消化內科,天津300100)

    [目的]探討促胃腸動力西藥聯合理氣中藥對糖尿病大鼠胃排空延遲的影響及其機制。[方法]70只7周齡雄性SD大鼠隨機分為兩組:正常組(A組,n=10),模型組(n=60)。模型組大鼠首先通過腹腔內注射四氧嘧啶建立糖尿病模型,造模成功大鼠隨機分為4組:對照組(B組,n=15)、理氣中藥治療組(C組,n=15)、伊托必利治療組(D組,n=14)、伊托必利聯合理氣中藥治療組(E組,n=14)。依照各組要求,每日予以相應藥物灌胃,飼養(yǎng)24周后,全部大鼠行13C胃固體半排空實驗,記錄胃半排空時間,處死大鼠并取材,進行蘇木-伊紅(HE)和神經元型一氧化氮合酶(nNOS)免疫組化染色,觀察胃壁病理改變。[結果]1)與A組大鼠相比,B組、C組、D組、E組大鼠胃固體半排空時間明顯延長(P<0.01)。2)C組、D組、E組大鼠胃排空時間較對B組明顯減少(P<0.05);E組大鼠胃排空時間較D組及C組大鼠明顯減少(P<0.01)。3)HE染色結果表明,與A組大鼠相比,B組、C組、D組、E組大鼠胃環(huán)肌及縱肌變薄,肌間神經叢數量減少,免疫組化nNOS表達明顯減少(P<0.05)。4)D組大鼠肌間神經叢數目較B組明顯增加(P<0.05),而C組及E組大鼠肌間神經叢數目明顯高于D組(P<0.05),且E組大鼠nNOS陽性神經叢數明顯高于D組(P<0.05)。[結論]規(guī)律應用理氣中藥,可明顯促進糖尿病大鼠胃排空,且和伊托必利聯合應用,可獲得更佳效果。實驗結果表明其對平滑肌及肌間神經叢有一定保護作用,并可促進nNOS的表達,此可能是其的作用機制。

    理氣中藥;肌間神經叢;糖尿?。晃概趴?/p>

    中國是糖尿病高發(fā)國家,隨著糖尿病病程的延長和長期的高血糖水平,可以出現胃動力下降、胃排空遲緩等并發(fā)癥,臨床上稱為“糖尿病性胃輕癱”。目前,糖尿病性胃輕癱產生機制尚不明確,一般認為可能與自主神經功能障礙、胃腸激素分泌異常、高血糖、平滑肌損害以及微血管病變等因素有關[1]。嚴格控制血糖水平,同時給予促胃動力藥物是目前臨床常采用的治療方法。

    中醫(yī)通過辨證論治,運用中藥治療糖尿病胃輕癱也取得了很好的效果。陳皮、枳實、木香、香附、玫瑰花是臨床上治療胃腸動力異常的常用中藥,五味中藥組方有健脾養(yǎng)胃,行氣破氣除痞,消積化滯的功效,能有效地治療糖尿病性胃輕癱[2]。為了進一步明確理氣中藥對糖尿病胃輕癱的干預作用及其機制,本實驗選用促胃腸動力藥伊托必利聯合五味理氣中藥灌服糖尿病胃排空延遲大鼠,觀察促胃腸動力西藥聯合理氣中藥對糖尿病大鼠胃排空延遲的改善作用與單用伊托比必利或理氣中藥相比是否更有效,并在神經肌肉水平闡明其機制,從而為臨床使用提供基礎理論支持。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1實驗動物7周齡雄性SD大鼠70只,體質量(250±10)g。

    1.1.2主要試劑四氧嘧啶(ALX):瑞士ALEXIS公司;理氣中藥(陳皮、玫瑰花、木香、枳實、香附各10 g,按傳統(tǒng)工藝制備水煎劑,濃縮至1 g/mL):廣東一方制藥有限公司;鹽酸伊托必利膠囊:哈藥集團制藥總廠,規(guī)格:50 mg×20粒;精蛋白鋅胰島素注射液:江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司,400 U/瓶;兔抗鼠神經元型一氧化氮合酶(nNOS)抗體:Santa Cruz公司。

    1.2方法

    1.2.1糖尿病大鼠模型制備雄性SD大鼠70只,適應性飼養(yǎng)1周后,按照隨機數字表法隨機分為2組:正常組(A組,10只)和模型組(60只)。所有大鼠禁食12 h,測血糖、稱質量,血糖值偏高的大鼠予以剔除。模型組大鼠禁食水24 h后,以新配制的5%ALX溶液按120 mg/kg劑量,經腹腔30 s內快速注入,正常組大鼠腹腔注射等容積生理鹽水,2 h后將50%葡萄糖20 mL放入飲水槽中,并恢復常規(guī)飼料喂養(yǎng)。72 h后,58只模型組大鼠血糖值在13.5~30.5 mmol/L范圍,平均(22.80±3.34)mmol/L,模型大鼠出現進食、飲水量增加,體質量下降,即制模成功。2只大鼠未成模,予以剔除。成模率為96.67%。

    *基金項目:天津市北辰區(qū)科技發(fā)展計劃項目(BCWS2011-05)。

    作者簡介:張毅宏(1967-),女,副主任醫(yī)師,主要從事消化內系統(tǒng)疾病研究工作。

    糖尿病組大鼠造模成功后,對照組(B組)、理氣中藥治療組(C組)經隨機數字法各分為15只,伊托必利治療組(D組)、伊托必利聯合理氣中藥治療組(E組)各14只。

    1.2.2給藥糖尿病大鼠模型制備成功后,各組均選用普通飼料喂養(yǎng)。在此基礎上,A、B組大鼠每日灌服生理鹽水10 mL/kg,C組大鼠每日灌服中藥20 mL/kg,D組大鼠每日灌服伊托必利125 mg/kg,E組大鼠每日灌服伊托必利125 mg/kg聯合中藥20 mL/kg。在實驗過程中,定期用斷尾法測量各組大鼠血糖,并稱體質量、記錄攝食攝水量。在飼養(yǎng)給藥過程中因高滲昏迷、低血糖導致B組2只、C組1只大鼠死亡,至24周飼養(yǎng)結束時,實際各組大鼠數量為:A組10只,B組13只,C組14只,D組14只,E 組14只。

    1.2.313C胃排空呼氣實驗檢測準備直徑大小不等的桶狀塑料瓶若干,剪成兩段,在瓶蓋上剪一直徑與軟膠管一致的小口,穿一段長約2 cm的軟膠管連接,供大鼠呼吸。在瓶底剪一直徑與硬膠管一致的小口,穿一段長約5 cm的硬膠管連接,留約4 cm在瓶外,用膠帶將連接處密封。所有動物禁食24 h,收集零時氣100 mL后。預先用13C-辛酸和蛋黃煎制好的實驗餐(13C-辛酸18 mg加入1/5個蛋黃中),每只動物喂食等量實驗餐,立即將大鼠根據體型大小放入適宜的瓶內,頭朝瓶蓋呼氣處,尾對瓶底,連接處用膠帶進行密封固定。用一長約5 cm的軟膠管將硬膠管與紅外線能譜分析儀連接,在儀器負壓的吸引下,將瓶內的空氣吸入儀器內,收集15、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240 min氣各100 mL檢測,計算胃固體半排空時間并記錄。

    1.2.4組織病理學檢測所有大鼠胃組織迅速用10%的福爾馬林固定液中固定,石蠟包埋、切片。標本采用蘇木-伊紅(HE)染色,并進行nNOS免疫組化染色。用顯微鏡觀察胃壁切片組織,重點觀測肌間神經叢,高倍鏡(40倍)下觀察nNOS陽性的細胞數量及強度,于低倍鏡(10倍)視野下,測量單位長度內胃壁神經元細胞數量。

    1.2.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量數據采用均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,重復測量計量資料比較采用重復測量方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1建立DM動物模型造模前各組大鼠血糖波動均在正常范圍,且兩兩之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模后,第1天、第2天和第24周A組血糖無明顯變化,為正常波動,與造模前比較差異無(P>0.05)。B組,C組、D組和E組血糖水平在造模后第1天、第2天、第24周呈現升高趨勢,與造模前比較均顯著升高(均P<0.01)。且造模1周后模型組(B組,C組、D組和E組)大鼠體質量較造模前有(20±5)g下降,綜合上述表現,可認定造模成功。見表1。此后每周定期測量大鼠體質量,造模1周后,可發(fā)現模型組大鼠與對照組大鼠體質量相比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

    表1 各組大鼠實驗前后體質量的變化(±s)Tab.1 The changes of body weight in rats of each group before and after experiment(±s)g

    表1 各組大鼠實驗前后體質量的變化(±s)Tab.1 The changes of body weight in rats of each group before and after experiment(±s)g

    注:與A組比較,*P<0.05;與B組比較,#P<0.05;與E組比較,△P<0.05。

    組別動物數 造模前 造模后1周 造模后24周A組 10 220.5±4.6 227.4±5.3 319.1±14.8 B組 13 214.5±4.9 212.3±24.8* 210.1±26.7* C組 14 221.1±3.3 214.7±16.6*#△ 214.1±28.5*#△D組 14 220.4±4.3 221.9±23.4*#△ 208.5±23.8*#△E組 14 221.6±3.0 211.3±12.8*# 232.6±18.3*#

    表2 各組大鼠給藥前后血糖的變化(±s)Tab.2 The changes of blood glucose in rats of each group before and after experiment(±s)mmol/L

    表2 各組大鼠給藥前后血糖的變化(±s)Tab.2 The changes of blood glucose in rats of each group before and after experiment(±s)mmol/L

    注:與A組比較,*P<0.01。

    組別 動物數 造模前 造模后1 d 造模后24周A組 10 4.73±0.56 4.51±0.69 5.12±0.55 B組 13 4.55±0.51 23.8±0.29* 24.1±0.33* C組 14 4.31±0.56 25.2±0.25* 23.7±0.23* D組 14 5.02±0.76 23.9±0.41* 22.7±0.61* E組 14 4.60±0.73 24.2±1.68* 23.2±0.25*

    2.2胃固體半排空時間B組大鼠胃固體半排空時間較A組大鼠明顯延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),C組及D組大鼠胃固體半排空時間較B組大鼠顯著縮短(P<0.05),而E組大鼠胃固體半排空時間較C組及D組時間明顯縮短,差異有顯著性(P<0.01)。見表3。

    表3 大鼠13C胃固體半排空時間(±s)Tab.3 13C gastric half-emptying time of rats(±s)

    表3 大鼠13C胃固體半排空時間(±s)Tab.3 13C gastric half-emptying time of rats(±s)

    注:與A組比較,*P<0.01;與B組比較,#P<0.05;與C組比較,△P<0.05;與D組比較,▲P<0.05。

    組別 動物數 13C胃固體半排空時間(min)A組 10 111.07±7.62 B組 13 200.98±5.74* C組 14 130.41±3.48#D組 14 146.29±7.86#E組 14 116.43±3.77△▲

    2.3HE染色結果如圖1所示,在HE染色下,正常大鼠胃壁結構、肌層均完整,可見肌間神經叢,糖尿病大鼠(B、C、D、E組)可見胃平滑肌細胞形態(tài)改變,胞漿染色淡,透亮,有空泡樣變性壞死,胃環(huán)肌及縱肌變薄(見表4),胃肌間神經叢數量較正常大鼠明顯減少(見表5,P<0.05)。給藥后,D組大鼠胃環(huán)形肌厚度較B組及C組大鼠明顯增加(P<0.05),E組大鼠胃環(huán)形肌及縱形肌厚度均較B組大鼠增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但與C組和D組大鼠相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

    肌間神經叢數目方面D組較B組明顯增加,C組及E組大鼠肌間神經叢數目較D組明顯增加(P<0.05),E組與C組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    2.4nNOS免疫組化染色結果如圖2所示,A組大鼠nNOS免疫組化染色表達明顯,而B組大鼠nNOS陽性神經數目顯著減少,C、D、E組大鼠染色結果可見nNOS細胞陽性表達。統(tǒng)計結果顯示(見表5),糖尿病組大鼠nNOS陽性神經叢數量均明顯少于A組(P<0.05),但給藥的各組大鼠nNOS陽性神經叢表達高于B組,E組大鼠nNOS陽性神經叢數明顯高于D組。

    3 討論

    近年來,全球糖尿病患病率呈逐年增高趨勢。據統(tǒng)計,美國目前有糖尿病的患者超過2 900萬人,預計到2050年,每3個人中就會有一個糖尿病患者[3]。糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病,發(fā)病機制復雜,目前的治療多為對癥治療,無法根治[4]。

    表4 各組大鼠胃壁平滑肌厚度的變化(±s)Tab.4 The changes of the gastric smooth muscle cell of rats of each group before and after experiment(±s)mm

    表4 各組大鼠胃壁平滑肌厚度的變化(±s)Tab.4 The changes of the gastric smooth muscle cell of rats of each group before and after experiment(±s)mm

    注:與A組比較,*P<0.01;與B組比較,#P<0.05;與C組比較,△P<0.05。

    組別 動物數 環(huán)形肌厚度 縱行肌厚度A組 10 0.40±0.09 0.06±0.03 B組 13 0.25±0.07* 0.03±0.03* C組 14 0.31±0.08* 0.06±0.01 D組 14 0.39±0.08△# 0.04±0.05 E組 14 0.40±0.04*# 0.06±0.04*#

    圖1 大鼠胃組織HE染色結果(10×10)Fig.1 HE staining results of stomach tissue in rats(10×10)

    圖2 大鼠胃組織免疫組化結果(40×10)Fig.2 Results of the immunohistochemical staining of stomach tissue in rats(40×10)

    110多年前,Minkowshi等最早用切除狗胰腺的方法建立糖尿病動物模型,隨著相關研究的不斷發(fā)展,目前已有多種建立糖尿病動物模型的方法。選取適當的方法建立糖尿病相關動物模型,對于糖尿病及其并發(fā)癥的研究具有至關重要的作用[5],目前通常采用大鼠建立糖尿病動物模型。ALX為常用化學藥物[6-7]。四氧嘧啶是一種β細胞毒劑,大鼠等多種動物注射四氧嘧啶后,可對其胰島β細胞造成不可逆的損害,甚至壞死,影響胰島素的分泌功能,注射24 h后即可出現持續(xù)性高血糖狀態(tài),最終導致糖尿病的發(fā)生,因此多年來一直用于復制糖尿病動物模型。四氧嘧啶大鼠糖尿病模型是評價抗糖尿病藥物療效及安全性的常用模型[8]。本研究通過腹腔注射ALX的方法建立糖尿病大鼠模型,24 h后血糖明顯升高,并一直持續(xù)到24周,且模型大鼠多飲、多尿,體質量下降,符合糖尿病的表現,與既往文獻報道一致。

    表5 各組大鼠肌間神經叢數量及nNOS陽性神經叢數的變化(±s)Tab.5 The changes of the gastric smooth muscle and myenteric nerve plexus of rats of each group before and after experiment(±s) 個/mm

    表5 各組大鼠肌間神經叢數量及nNOS陽性神經叢數的變化(±s)Tab.5 The changes of the gastric smooth muscle and myenteric nerve plexus of rats of each group before and after experiment(±s) 個/mm

    注:與A組比較,*P<0.01;與B組比較,#P<0.05;與D組比較,△P<0.05。

    組別 動物數 胃壁肌間神經叢數目 nNOS陽性神經叢數A組 10 6.83±2.81 4.14±1.70 B組 13 3.12±2.50* 2.13±1.94* C組 14 4.45±1.65*△ 3.12±1.74* D組 14 4.27±1.63*# 3.14±1.50* E組 14 4.95±2.10*△ 3.45±1.65*△

    本研究中糖尿病模型大鼠胃固體半排空時間較正常大鼠也明顯增加。既往研究認為可能與自主神經病變有關[9]。中醫(yī)學多將胃輕癱歸于惡心、反胃、痞滿、積滯等病范疇,有人根據其病機命名為胃緩、胃痹[10-11]。從中醫(yī)角度來說,本病是消渴病日久陰傷氣耗,致中氣虛損、脾升胃降失和、氣機失調為主,脾氣虛弱、運化無力為本,氣滯、血瘀、濕阻、痰濁、食積、濕熱等引起胃失和降為標,為虛實夾雜之證[2]。而關于糖尿病性胃輕癱的治療,中醫(yī)多應用陳皮、枳實、木香、香附、玫瑰花等理氣類中藥,本方各位藥配伍應用共奏運脾和氣之效。本實驗中的陳皮性溫,味辛、苦,入脾、胃、肺經,具行氣、疏肝、健脾、止痛等功效。臨床常用于脾胃氣滯之脘腹脹滿或疼痛、消化不良;枳實性寒,味苦、辛,除痞消積,對大鼠胃動力有顯著的促進作用,其機制可能與促進胃動素(MLT)釋放及減少促胃液素分泌有關[12]。此外枳實還能興奮大鼠胃腸道移行復合運動波(MMC),其作用與P物質(SP)有關[13]。木香性溫,味辛、苦,歸脾、胃經,有行氣止痛的功效,并善理脾胃之氣滯,具有明顯的促進胃排空作用。香附性平,味辛、微苦、甘,可行氣疏肝,解郁,以治氣滯,其對腸動力傳輸有明顯促進作用;玫瑰花性溫,味甘,微苦,入肝、脾二經,具有理氣解郁、活血散瘀的功效?,F在藥理研究證實玫瑰花有改善內臟微循環(huán),在組織水平和細胞水平上有顯著的抗氧化作用。諸藥合用,集辛散、苦降、甘調于一方,雖治在調理脾胃之氣,又旁顧肝肺。既理氣調中,又培補中焦,兼顧肝肺,而使三焦通達,脾胃調和,樞機暢利,從而使脾胃功能恢復如常[14],共奏健脾運化、調和氣機之功效。西醫(yī)多給予促胃動力藥促進胃排空,本研究旨在觀察理氣中藥、促動力西藥伊托必利及兩者聯合在治療糖尿病胃輕癱方面的作用,初步探討其作用機制。

    本實驗結果證實,上述五味理氣中藥組方及促胃腸動力西藥伊托必利均具有顯著促進糖尿病大鼠胃排空的作用,改善胃輕癱,并且理氣中藥較伊托必利促進胃液體排空效果更加明顯。理氣中藥和促胃腸動力西藥相聯合可明顯減少糖尿病大鼠胃固體排空和液體排空時間,療效優(yōu)于兩者單獨應用。為研究其機制,進一步進行病理組織學研究,發(fā)現與正常大鼠相比,糖尿病模型大鼠胃組織平滑肌細胞形態(tài)改變,肌層變薄,神經叢數量減少。免疫組化發(fā)現nNOS表達減少。既往研究也有類似發(fā)現,即糖尿病大鼠模型nNOS陽性神經元密度減少[15-16]。應用理氣中藥或伊托必利24周后,大鼠胃組織肌層變厚,胃壁肌間神經叢增多,nNOS陽性神經元增多,且兩者聯用在改善胃壁肌間神經叢數目、nNOS陽性神經叢數、平滑肌厚度方面效果優(yōu)于單獨應用。因此,理氣中藥聯合促胃腸動力西藥改善糖尿病胃排空時間可能與其對平滑肌和肌間神經叢的保護作用有關。可見,在治療糖尿病性胃輕癱時,在給予西藥促動力藥的同時,適當給予理氣中藥輔助治療是合理有效的治療方法。

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    (本文編輯:馬英,高杉)

    Study on the mechanism and the effects of prokinetic agents combined with Chinese herbs on the delayed gastric emptying in diabetic rats

    ZHANG Yi-hong1,YANG Guo-li1,FU Ying1,ZHANG Zhao2,CAO Ze-wei2,ZHANG Jun1,WANG Tian-xi2,GUO Na2,GAO Jun-qin1
    (1.Department of Dastroenterology,Tianjin Beichen Hospital,Tianjin 300400,China;2.Department of Dastroenterology,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin 300100,China)

    [Objective]To observe the effects of prokinetic agents combined with Chinese herbs on the delayed gastric emptying in diabetic rats and the underlying mechanism.[Methods]Totally 70 male SD rats were randomly divided into two groups:normal group (group A,n=10)and model group(n=60).The rats of model group was established as diabetes model by intraperitoneal injection of alloxan.The successful model rats were divided into four groups:control group(group B,n=15),Chinese herbs treatment group(group C,n=15),Itopride treatment group(group D,n=14),Itopride combined with Chinese herbs treatment group(group E,n=14).According to the requirements of each group,the corresponding drugs were given to the stomach every day.After 24 weeks of feeding,all rats were given13C-gastric half-emptying time.Then all rats were killed.HE and nNOS immunohistochemical staining were used to observe the pathological changes of gastric wall.[Results]1)Compared with the rats in group A,the gastric emptying time of all rats in model group (group B,C,D and E)were prolonged(P<0.01).2)Compared with group B,the gastric emptying time in rats of group C,D and E were significantly reduced(P<0.05).Compared with Group D and C,they were significantly reduced in group E(P<0.01).3)Compared with group A,the gastric smooth muscle cell in the model group became thinner,and the number of muscle plexus and the expression of nNOS in gastric smooth muscle of rats were significantly decreased in group B,C,D and E.4)The number of muscle plexus in group B was significantly higher than that in group D,while the number in group group D was significantly lower than that in C and group E. Meanwhile,the number of nNOS positive nerve plexus in group D was significantly lower than that in group E.[Conclusion]Combined with Chinese herbs,prokinetic agents can promote the gastric emptying in diabetic rats effectively,and the effects are better than that of single use of Chinese herbs or prokinetic agents.The mechanism may correlated with its protective effects on smooth muscle and myenteric nerve plexus.

    Chinese herb;myenteric nerve plexus;diabetic;gastric emptying

    R285.5

    A

    1672-1519(2016)06-0363-05

    10.11656/j.issn.1672-1519.2016.06.12

    2016-03-28)

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